倪　卓，黃葦殷，王　應(yīng)，吳耿鋒，潘田光

深圳大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，廣東深圳518060

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Received：2015-10-28；Accepted：2015-12-16

Foundation：National Natural Science Foundation of China (51378315); Science and Technology Innovation Project of Guangdong Provincial Educational Department (2013KJCX0163)

? Corresponding author：Professor Ni Zhuo．E-mail: royzhuoni@hotmail.com

Citation：Ni Zhuo, Huang Weiyin, Wang Ying, et al．Experiments on biocompatibility of PEEK-SEEK-HA composite materials with U2OS cells[J]. Journal of Shenzhen University Science and Engineering, 2016, 33(1): 1-9.(in Chinese)

【化學(xué)與化工 / Chemistry and Chemical Engineering】

PEEK-SPEEK-HA復(fù)合材料與U2OS細(xì)胞相容性研究

倪卓，黃葦殷，王應(yīng)，吳耿鋒，潘田光

深圳大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，廣東深圳518060

摘要：體外培養(yǎng)U2OS細(xì)胞，通過噻唑藍(lán)(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltet razolium bromide, MTT)法研究新型聚醚醚酮-羥基磷灰石(polyetheretherketone-hydroxyapatite, PEEK-HA)生物復(fù)合材料對細(xì)胞增殖的影響．研究發(fā)現(xiàn)，聚醚醚酮-磺化聚醚醚酮-羥基磷灰石(polyetheretherketone-sulfnated polyetheretherketone-hydroxyapatite, PEEK-SPEEK-HA)復(fù)合材料的細(xì)胞增殖作用較PEEK-HA復(fù)合材料強(qiáng)，且隨著HA含量的增加細(xì)胞增殖作用增強(qiáng)，材料浸提液質(zhì)量濃度為4～8 mg/mL時對細(xì)胞有較好的增殖促進(jìn)作用．復(fù)合材料毒性級別為Ⅰ，對細(xì)胞無毒性．測定黏附率研究該材料對U2OS細(xì)胞的黏附特性，PEEK-SPEEK-HA復(fù)合材料隨著HA含量的增大，細(xì)胞黏附率增加，高于PEEK-HA復(fù)合材料組，表明加入HA和SPEEK能改善復(fù)合材料的黏附性能．采用流式細(xì)胞術(shù)研究材料對細(xì)胞凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)加入SPEEK的PEEK-HA復(fù)合材料能抑制細(xì)胞發(fā)生早期凋亡，從而降低凋亡率．激光共聚焦和流式細(xì)胞儀檢測該材料對細(xì)胞活性氧的影響發(fā)現(xiàn)，SPEEK引入復(fù)合材料能夠降低細(xì)胞活性氧水平，降低細(xì)胞毒性． 掃描電鏡實驗表明，U2OS細(xì)胞能夠在PEEK-SPEEK-HA復(fù)合材料表面黏附、伸展和生長．

關(guān)鍵詞：聚醚醚酮-羥基磷灰石復(fù)合材料；U2OS骨瘤細(xì)胞；細(xì)胞增殖；細(xì)胞形態(tài)；細(xì)胞黏附；細(xì)胞凋亡；活性氧

由損傷、先天畸形和疾病所導(dǎo)致的骨缺損在臨床上十分常見，傳統(tǒng)的治療方法包括自體骨移植術(shù)和異體骨移植術(shù)．自體骨由于來源少且有二次手術(shù)痛苦，因此在應(yīng)用上受到限制．異體骨組織可能會產(chǎn)生排異反應(yīng)和疾病傳播等問題[1]．隨著醫(yī)療水平的提高，對人工合成的骨和牙齒替代材料的需求不斷增加．因此，從材料學(xué)和仿生學(xué)角度出發(fā)，研究人工合成硬組織材料有重要意義[2]．金屬材料在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用已有很長的歷史，是最早被采用的生物材料，有較高的強(qiáng)度和韌性，適用于硬組織系統(tǒng)的修復(fù)．醫(yī)用金屬缺乏生物活性，難以與骨組織鍵合，其應(yīng)用具有一定的局限性，且絕大多數(shù)醫(yī)用金屬彈性模量較高，易造成骨應(yīng)力吸收，引起種植體松動[3]．羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)是無機(jī)非金屬生物材料中類最重要的磷灰石材料之一，20世紀(jì)70年代開始進(jìn)入臨床，以其優(yōu)良的生物相容性、無毒、無刺激性、無排斥反應(yīng)、不老化、不致敏、不致癌以及可與骨組織發(fā)生化學(xué)性結(jié)合等特點被廣泛應(yīng)用[4]．然而，HA在具體應(yīng)用中還存在一些缺陷，如：塊狀HA質(zhì)硬、脆性大、韌性差、不易雕刻，與周圍組織吻合不好；粒狀HA用于填充牙槽嵴、填充頜骨時，存在顆粒游走、移位、凝固時間長、塑性后近期形狀不穩(wěn)定和易發(fā)生變形等問題[5]．聚醚醚酮(polyetheretherketone, PEEK)是英國帝國化學(xué)工業(yè)集團(tuán)(Imperial Chemical Industries, ICI)于1977年開發(fā)成功，并于20世紀(jì)80年代初期由英國Victrex公司實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的一種高性能特種工程塑料，被稱為塑料工業(yè)的金字塔尖[6]．它具有耐熱等級高、耐輻射、耐化學(xué)藥品、沖擊強(qiáng)度高、耐磨性和耐疲勞性好、阻燃和電性能優(yōu)異等特點，已在航空航天、電子電氣、醫(yī)療、能源、電力、機(jī)械、汽車和涂料等領(lǐng)域獲得廣泛應(yīng)用[7]．Bakar等[8]曾嘗試將羥基磷酸鈣填料加入聚醚醚酮，使聚醚醚酮表面具有生物活性．羥基磷酸鈣粉體粗大且用量高，嚴(yán)重降低了聚醚醚酮材料的機(jī)械強(qiáng)度．與傳統(tǒng)的微米級填料系統(tǒng)不同，均勻分散于聚合物之中的納米填料能在單位體積內(nèi)產(chǎn)生超大的界面積．這種超大界面積以及填料本身的納米尺度使聚合物納米復(fù)合材料在獲得新性能的同時，其力學(xué)性能也得到顯著提高[9-10]．研究表明，含有磺酸基的改性材料利于細(xì)胞生長和增殖[11]，因此將nHA與PEEK復(fù)合，并引入含有磺酸基類似偶聯(lián)劑的磺化聚醚醚酮(sulfnated polyetheretherketone, SPEEK)，克服PEEK和HA的缺陷，集中兩種材料的優(yōu)勢，制備新型生物復(fù)合材料，提高生物相容性，以便更好地適應(yīng)臨床需要．目前該復(fù)合材料與U2OS細(xì)胞生物相容性未見報道，本研究采用實驗室制備的新型PEEK-HA復(fù)合材料與U2OS細(xì)胞共培養(yǎng)，檢測材料對細(xì)胞增殖、黏附、形態(tài)、凋亡和活性氧等細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，體外評價該材料的細(xì)胞相容性，為該材料的應(yīng)用和臨床研究提供科學(xué)依據(jù)．

1實驗

1.1實驗試劑與儀器

試劑： PEEK-HA生物復(fù)合材料(本實驗室制備)； U2OS骨瘤細(xì)胞(上海生命科學(xué)院)； RPM11640 培養(yǎng)基(Hyclone公司)； 小牛血清(Thermo Fisher公司)； 磷酸鹽緩沖劑(PBS，Hyclone公司)胰蛋白酶(蘇州碧云天公司)； 噻唑藍(lán)(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltet razolium bromide, MTT，Sigma公司)； 二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO， 美國Amresco公司)； 凋亡雙染試劑盒(南京凱基)； 活性氧檢測試劑盒(蘇州碧云天)， 無水乙醇(東江試劑)； 戊二醛(東江試劑)； 平均粒徑為25～30 μm的羥基磷灰石．

儀器：酶聯(lián)檢測儀(Imark，美國Bio-Rad公司)；高壓滅菌鍋(HV-50，Hirayama公司)；激光共聚焦顯微鏡(FV1000，Olympus公司)；流式細(xì)胞儀(Facscalibur，美國BD公司)SU-70熱場發(fā)射掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope, SEM，日本日立公司)．

1.2細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)生長曲線測定

將對數(shù)生長期的U2OS細(xì)胞制備成7個不同濃度(0.5×104～3.5×104mL-1)細(xì)胞懸液，分別接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)(100 μL/孔，n=3)． 置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中，恒溫培養(yǎng)72 h，棄上清液，加入質(zhì)量濃度為5mg/L的MTT (20 μL/孔)， 繼續(xù)孵育4 h． 去上清， 用0.1 mmol/L 的磷酸鹽緩沖劑(phosphate buffered saline, PBS)清洗，加胰蛋白酶(質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL)消化細(xì)胞，加入DMSO( 150 μL /孔) ，室溫下孵育15～20 min，用酶聯(lián)檢測儀測其570 nm處光密度值，記作D(570)，計算出各濃度組均值，作生長曲線．

1.3細(xì)胞毒性試驗

將w(HA)分別為10%、20%和30%的PEEK-HA、PEEK-HA及w(HA)分別為10%、20%和30%的PEEK-SPEEK-HA共6種復(fù)合材料高壓滅菌，用RPMI1640培養(yǎng)液按4、8、16、32和64 mg/mL配成不同質(zhì)量濃度的混懸液，37 ℃恒溫箱中靜置浸提48 h，離心后于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫囵B(yǎng)細(xì)胞至對數(shù)生長期，棄去原培養(yǎng)液，用PBS洗滌2次，質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL的胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，用體積分?jǐn)?shù)為10%牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液配成單個細(xì)胞懸液，細(xì)胞板計數(shù)，每孔按2×104mL-1接種在96孔板(n=3)， 每孔體積200 μL．24 h后細(xì)胞貼壁，吸去培養(yǎng)液，換成含有復(fù)合材料的浸提液，將培養(yǎng)板移入CO2培養(yǎng)箱中，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% 的CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)．通過倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞貼壁情況．每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)20 μL，37 ℃孵箱中繼續(xù)孵育4 h，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液．每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解．選擇570 nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔的D(570)值，記錄結(jié)果．

1.4細(xì)胞黏附率測定

將復(fù)合材料分別制備成5 mm×2 mm大小圓柱體的模壓材料，經(jīng)過高溫高壓滅菌后，置于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，將細(xì)胞以2×104mL-1的濃度加入到細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔0.5 mL，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)48 h后，采用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)．具體方法為：將材料取出，培養(yǎng)板殘余細(xì)胞消化收集、計數(shù)，所得結(jié)果為未黏附細(xì)胞數(shù)．材料的細(xì)胞黏附率計算公式為

(1)

1.5細(xì)胞凋亡實驗

經(jīng)滅菌的模壓材料分別置于12孔板中，將處于對數(shù)生長期的U2OS細(xì)胞制成2×105mL-1的細(xì)胞懸液，滴加在材料上，培養(yǎng)48 h后，PBS清洗材料并消化收集細(xì)胞，待測細(xì)胞用PBS (pH=7.4) 緩沖液清洗2次，每次以2 000 r/min離心5 min，然后棄上清加入500 μL 結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，移至測量管中后每管加人5 μL AnnexinV-FITC和5μL PI，室溫下避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀上樣檢測．CellsQuest軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，An-nexin-V+/PI-判斷為早期凋亡，Annexin-V+/PI+判斷為晚期凋亡，兩種凋亡率之和為總凋亡率．觀察兩組細(xì)胞流式細(xì)胞儀散點圖，并計算早期凋亡、晚期凋亡及總凋亡率．

1.6活性氧檢測

在12孔板中分別加入經(jīng)滅菌的模壓材料，將處于對數(shù)生長期的U2OS細(xì)胞配制成2×105mL-1的細(xì)胞懸液，滴加在材料上，培養(yǎng)24 h后，取出材料，PBS清洗材料并消化收集細(xì)胞．加入終濃度為10 μmol/L的DCFH-DA(用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA至1∶1 000) 1 mL，37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5% 的CO2培養(yǎng)箱中靜置0.5 h，每隔3～5 min混勻1次，使探針和細(xì)胞充分作用．用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA．0.5 mL胰酶消化收獲各組細(xì)胞，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，1 200 r/min離心5 min，再吸出上清，加入1 mL的PBS，離心2～3次．棄上清，加500 μL PBS，激發(fā)光488 nm，發(fā)射光 525 nm，采用激光共聚焦觀察熒光強(qiáng)度，流式細(xì)胞儀進(jìn)行定量檢測．

1.7掃描電鏡實驗

經(jīng)滅菌的PEEK-SPEEK-HA模壓材料置于12孔板中，取對數(shù)生長期U2OS細(xì)胞配制成2×104mL-1的細(xì)胞懸液，滴加在材料上，共同培養(yǎng)5 d后(每天換新鮮培養(yǎng)液)，取出材料，PBS清洗材料2次，放入EP管中，加入體積分?jǐn)?shù)為2.5%的戊二醛，固定3～4 h；PBS洗滌3次，吸棄戊二醛，體積分?jǐn)?shù)為30%、50%、70%、85%和90%梯度乙醇脫水各1次，每次15 min，無水乙醇脫水2～3次，把細(xì)胞中的水置換出來．然后置于真空冷凍干燥儀內(nèi)干燥過夜，將樣品固定在樣品臺上，進(jìn)行噴金鍍膜，上鏡觀察2次電子圖像．

1.8統(tǒng)計學(xué)處理

本研究數(shù)據(jù)中，每組材料有3～6個數(shù)據(jù)，樣本總體符合正態(tài)分布，適用于t檢驗條件，采用統(tǒng)計分析軟件Origin 7.5進(jìn)行處理，作顯著性差異分析．理論值差異的顯著水平為α=0.05． 數(shù)據(jù)處理得P>0.05(t<0.05)， 表明差異不顯著．

2結(jié)果與討論

2.1U2OS細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)生長曲線

細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)生長曲線是細(xì)胞可反映出細(xì)胞生長的趨勢，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線選擇合適的實驗細(xì)胞濃度[12]．一般采用MTT法測定光密度值作增殖曲線，U2OS細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)生長曲線，見圖1．用MTT孵育細(xì)胞后要先用PBS溶液小心地洗，然后用胰酶消化，最后用DMSO裂解，混勻再測定，其結(jié)果比較準(zhǔn)確．U2OS細(xì)胞接種量與細(xì)胞的增殖代謝率在接種細(xì)胞數(shù)為2×104～3×104mL-1范圍內(nèi)基本呈正相關(guān)，該區(qū)域為細(xì)胞的對數(shù)增長期．在測定時，接種細(xì)胞的密度對生長曲線的影響較大，接種密度過高或過低都不利于細(xì)胞生長，這與細(xì)胞的生長特性有關(guān)．本實驗選擇的接種細(xì)胞數(shù)在相關(guān)范圍內(nèi)．

圖1　U2OS細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)生長曲線Fig.1　Standard growth curve of U2OS cells

圖2　PEEK-HA復(fù)合材料對細(xì)胞增殖影響Fig.2　(Color online)Influence of the composites on cell proliferation with incubation time

2.2材料對細(xì)胞增殖的影響

分別于第1、2、3和4天檢測各組材料在4 mg/mL質(zhì)量濃度下的細(xì)胞D(570)值，研究隨時間變化材料對細(xì)胞增殖的影響．圖2(a)為PEEK-HA復(fù)合材料對細(xì)胞增殖影響．隨著材料與U2OS細(xì)胞培養(yǎng)時間的延長，D(570)值整體呈增加趨勢，隨著HA質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，對細(xì)胞增殖作用增加，w(HA)=30%的PEEK-HA對細(xì)胞的增殖作用最強(qiáng)，細(xì)胞生長到第3天時，增殖作用有減緩趨勢．圖2(b)顯示PEEK-SPEEK-HA復(fù)合材料對細(xì)胞增殖影響，在1～3 d內(nèi)，細(xì)胞增殖速度較快，各組材料曲線隨時間變化趨勢類似，PEEK-SPEEK-HA復(fù)合材料隨HA質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，D(570)值升高，曲線向上平移．比較PEEK-HA與PEEK-SPEEK-HA復(fù)合材料，分析SPEEK對細(xì)胞增殖影響， w(HA)=20%時，PEEK-SPEEK-HA對細(xì)胞增殖影響略高于PEEK-HA，即w(HA)=20%的PEEK-SPEEK-HA材料對細(xì)胞的增殖作用比w(HA)=20%的PEEK-HA稍強(qiáng)，見圖2(c)．表明HA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加及SPEEK引入PEEK-HA復(fù)合材料對細(xì)胞增殖有一定促進(jìn)作用．

PEEK-HA復(fù)合材料隨w(HA)增加，D(570)值逐漸減小，曲線緩慢下滑，4～8mg/mL內(nèi)，曲線變化較為平緩，材料質(zhì)量濃度變化對細(xì)胞增殖無明顯作用．8～16mg/mL內(nèi)，曲線下滑，質(zhì)量濃度升高，材料對細(xì)胞增殖作用逐漸減小，對細(xì)胞增殖有明顯抑制作用；16～64mg/mL內(nèi)，曲線平緩，材料對細(xì)胞增殖作用最小，細(xì)胞增殖緩慢并即將停滯；64mg/mL時，材料對細(xì)胞增殖作用最小，表明過高的質(zhì)量濃度不利于細(xì)胞增殖，見圖3(a)、(b)和(c)．PEEK-SPEEK-HA材料濃度對細(xì)胞增殖的影響，見圖3(d)、(e)和(f)，其變化趨勢與PEEK-HA基本一致，主要原因是該材料主要組分為PEEK-HA，SPEEK作為類似偶聯(lián)劑加入后，濃度變化對細(xì)胞影響不大．

圖3　PEEK-HA復(fù)合材料質(zhì)量濃度對細(xì)胞增殖影響Fig.3　(Color online) Cell proliferation at different concentrations of the composites

2.3材料毒性級別

計算相對增殖率(relative proliferation rate, RGR)及毒性級別(細(xì)胞RGR=材料組D(570)值÷陰性對照組D(570)值)．細(xì)胞毒性分級標(biāo)準(zhǔn)為: RGR≥100%為0級: 75%～99%為Ⅰ級; 50%～74%為Ⅱ級; 25%～49%為Ⅲ級;1%～24%為Ⅳ級．0為Ⅴ級, 0級和Ⅰ級表示無細(xì)胞毒性；Ⅱ級表示可能有細(xì)胞毒性；Ⅲ級以上表示有細(xì)胞毒性)[13]．各組材料細(xì)胞毒性級別為Ⅰ級，見表1，說明各組材料對細(xì)胞無毒性．隨著HA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加和SPEEK加入，相對增殖率增加，表明HA和SPEEK能改善復(fù)合材料生物相容性．

±s)

組 別w(HA)/%1dRGR毒性級別2dRGR毒性級別3dRGR毒性級別4dRGR毒性級別PEEK-HA1075±1.58Ⅰ92±1.59Ⅰ92±1.83Ⅰ92±2.41Ⅰ2075±3.47Ⅰ98±5.91Ⅰ89±1.67Ⅰ95±3.76Ⅰ3078±2.71Ⅰ99±4.86Ⅰ96±0.89Ⅰ96±4.82ⅠPEEK-SPEEK-HA1082±1.29Ⅰ94±2.44Ⅰ94±0.32Ⅰ96±1.15Ⅰ2097±2.49Ⅰ96±3.52Ⅰ95±0.25Ⅰ99±2.36Ⅰ3098±1.83Ⅰ98±1.73Ⅰ98±0.73Ⅰ99±1.35Ⅰ空白對照0100Ⅰ100Ⅰ100Ⅰ100Ⅰ

2.4細(xì)胞黏附率

細(xì)胞在材料表面的黏附是評價材料生物相容性的重要指標(biāo)之一．細(xì)胞黏附在維持機(jī)體正常生理和生化功能中有重要的作用，是材料生物相容性的基礎(chǔ)．隨著w(HA)的增加，PEEK-HA和PEEK-SPEEK-HA復(fù)合材料的細(xì)胞黏附率均提高，且PEEK-SPEEK-HA復(fù)合材料組的黏附率高于PEEK-HA復(fù)合材料組的，說明在SPEEK中，加入HA能改善材料對細(xì)胞的黏附性能，見表2．首先，從官能團(tuán)上看，羧基、羥基、磺酸基和酰胺基等官能團(tuán)可以通過調(diào)節(jié)材料表面的親水性和表面電荷促進(jìn)細(xì)胞的黏附．PEEK -HA和PEEK-SPEEK-HA復(fù)合材料中的HA含有羥基，隨著w(HA)在兩種復(fù)合材料中的增加，羥基的量也隨之增加．PEEK-SPEEK-HA復(fù)合材料中的SPEEK含有磺酸基，增加了材料中磺酸基官能團(tuán)的量．羥基和磺酸基可以通過調(diào)節(jié)材料表面的親水性和表面電荷而促進(jìn)細(xì)胞的黏附，提高材料的細(xì)胞黏附率．其次，材料的表面特性和理化性質(zhì)決定黏附性能[14]，SPEEK引入復(fù)合材料可提高分子之間的交聯(lián)，使得叉狀分子增多，材料表面粗糙度增大，比表面積增大，利于細(xì)胞附著．

±s)

組別w(HA)/%未黏附細(xì)胞數(shù)×10-5黏附細(xì)胞數(shù)×10-5黏附率/%PEEK-HA103.63±0.170.61±0.0214.39±3.37203.49±0.130.75±0.0317.69±3.01303.27±0.180.97±0.0522.88±3.09PEEK-SPEEK-HA103.31±0.050.93±0.0321.93±4.39203.25±0.030.99±0.0323.35±4.54303.11±0.111.13±0.0526.65±3.29空白對照04.24±0.1000

2.5細(xì)胞凋亡率

通過流式分析，比較PEEK-HA與PEEK-SPEEK-HA復(fù)合材料對U2OS細(xì)胞凋亡的影響．各組材料凋亡率從小到大依次為，對照組、w(HA)=20%的PEEK-SPEEK-HA和w(HA)=20%的PEEK-HA，見表3．w(HA)=20%時的PEEK-SPEEK-HA與PEEK-HA相比，早期凋亡降低，晚期凋亡無明顯差異，說明SPEEK加入能抑制細(xì)胞早期凋亡的發(fā)生降低凋亡率．

表3　PEEK-HA復(fù)合材料對U2OS細(xì)胞凋亡類型和

2.6材料對細(xì)胞ROS含量影響

材料的毒性與細(xì)胞活性氧(reactive oxygen species, ROS)的產(chǎn)生密切相關(guān)，過量的ROS會將細(xì)胞膜上的磷脂以及酶和膜受體上的多不飽和脂肪酸側(cè)鏈氧化，形成過氧化脂質(zhì)產(chǎn)物，導(dǎo)致細(xì)胞膜的流動性和通透性改變，繼而破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能、造成細(xì)胞凋亡、組織損傷和器官病變.因此，測試活性氧含量常?？梢苑从臣?xì)胞氧化程度和損傷程度[15]．采用激光共聚焦顯微鏡觀察PEEK-HA復(fù)合材料對U2OS細(xì)胞ROS的影響，見圖4．PEEK-HA復(fù)合材料組隨著HA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加熒光強(qiáng)度逐漸減弱，該結(jié)果與流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果一致，見表4，表明HA與PEEK復(fù)合后能使細(xì)胞活性氧含量減少．PEEK-SPEEK-HA復(fù)合材料組中HA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，活性氧降低，與PEEK-HA復(fù)合材料相比，SPEEK引入PEEK-HA復(fù)合材料能夠明顯降低細(xì)胞活性氧含量.其中，w(HA)=30%的PEEK-SPEEK-HA復(fù)合材料上的細(xì)胞產(chǎn)生活性氧最少，與對照組接近．表明加入HA和SPEEK的復(fù)合材料能夠降低材料對細(xì)胞ROS水平．

圖4　激光共聚焦觀察U2OS細(xì)胞產(chǎn)生的ROSFig.4　(Color online) Cell ROS results observed by CLSM

±s)

組 別w(HA)/%平均熒光強(qiáng)度空白對照04.26±0.14PEEK-HA106.90±0.31206.41±0.28305.14±0.29PEEK-SPEEK-HA105.20±0.18204.83±0.17304.37±0.26

2.7掃描電鏡實驗

掃描電鏡觀察U2OS細(xì)胞在PEEK-SPEEK-HA生物復(fù)合材料上的黏附生長情況，細(xì)胞在材料凹陷位置附著生長，高倍鏡下顯示細(xì)胞為三角形或長梭形呈扁平的形態(tài)，緊密地貼附在材料表面，且長出板層偽足及絲狀偽足緊密貼附在材料表面，部分細(xì)胞板層偽足及絲狀偽足深入進(jìn)材料縫隙內(nèi)，偽足伸展?fàn)顟B(tài)良好，形態(tài)正常，見圖5(a)．大量U2OS細(xì)胞在材料表面呈平行排列生長，細(xì)胞之間形成連接，部分細(xì)胞通過偽足連接，緊密包覆在材料表面，生長態(tài)勢良好，見圖5(b)．大量細(xì)胞能夠在該復(fù)合材料凹陷位置生長，見圖5(c)．圖5結(jié)果表明U2OS細(xì)胞能夠在PEEK-SPEEK-HA復(fù)合材料表面黏附、伸展和生長．

圖5　U2OS細(xì)胞在復(fù)合材料上生長形態(tài)Fig.5　Morphology of U2OS cells on the surface of the composites

結(jié)語

采用本實驗室制備的新型PEEK-HA生物復(fù)合材料，MTT法研究該材料對U2OS細(xì)胞的影響，該材料隨著HA含量的增加，對細(xì)胞的增殖作用增強(qiáng).隨著時間推移，增殖有減緩趨勢，細(xì)胞生長至第4天時，材料對細(xì)胞增殖作用達(dá)到最大，與PEEK-HA相比，PEEK-SPEEK-HA復(fù)合材料對細(xì)胞的增殖作用稍強(qiáng)，SPEEK加入能提高該材料的細(xì)胞相容性．比較不同濃度的PEEK-HA和PEEK-SPEEK-HA復(fù)合材料，發(fā)現(xiàn)質(zhì)量濃度為4～8 mg/mL的材料浸提液對細(xì)胞有較好的增殖促進(jìn)作用，隨著濃度增大，細(xì)胞增殖減緩，過高質(zhì)量濃度對細(xì)胞增殖有抑制作用．各組材料毒性級別為Ⅰ級，對細(xì)胞無毒性．HA和SPEEK的引入復(fù)合材料能改善材料對細(xì)胞的黏附性能．PEEK-SPEEK-HA (w(HA)=20%)凋亡率低于PEEK-HA (w(HA)=20%)， 說明SPEEK加入能抑制細(xì)胞凋亡．活性氧檢測表明，SPEEK引入PEEK-HA復(fù)合材料能夠明顯降低細(xì)胞活性氧含量，降低細(xì)胞毒性．U2OS細(xì)胞能夠在PEEK-SPEEK-HA復(fù)合材料表面正常黏附、伸展和生長，該材料生物相容性良好．

引文：倪卓，黃葦殷，王應(yīng)，等. PEEK-SPEEK-HA復(fù)合材料與U2OS細(xì)胞相容性研究[J]. 深圳大學(xué)學(xué)報理工版，2016，33(1)：1-9.

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【中文責(zé)編：晨兮；英文責(zé)編：新谷】

Experiments on biocompatibility of PEEK-SEEK-HA

composite materials with U2OS cells

Ni Zhuo?，Huang Weiyin，Wang Ying，Wu Gengfeng，and Pan Tianguang

College of Chemistry and Environmental Engineering, Shenzhen University, Shenzhen 518060, Guangdong Province, P.R.China

Abstract：Effects of polyetheretherketone-hydroxyapatite (PEEK-HA) composites and polyetheretherketone-sulfnated polyetheretherketone-hydroxyapatite (PEEK-SPEEK-HA) composites on U2OS cells are studied by using the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltet razolium bromide (MTT) method. It is found that cell proliferation in PEEK-SPEEK-HA composites is broader than that in PEEK-HA composites. With an increase of HA content in PEEK-HA composites, cell proliferation accelerates. The material of sulfnated polyetheretherketone promotes cell proliferation significantly at 4-8 mg/mL concentration. A cytotoxicity test shows that these bio-materials are non-toxic to U2OS cells and the U2OS cells can adapt to these materials. With an increase of HA content, the cell adhesion rate increases and is higher in PEEK-SPEEK-HA composites than in PEEK-HA composites, which indicates that adding HA and SPEEK in PEEK composite could improve the adhesion property. Cell apoptosis test by the flow cytometry (FCM) indicates that the addition of SPEEK in PEEK-HA composites can inhibit the early apoptosis thus decreasing the apoptosis rate. A test on the effect of SPEEK on the reactive oxygen species (ROS) of U2OS cells by using the flow cytometry (FCM) and the confocal laser scanning microscopy (CLSM) shows that SPEEK in PEEK-HA composites can decrease the ROS level, and reduce the cytotoxicity. Scanning electron microscope (SEM) results show that U2OS cells can adhere, stretch and grow on surfaces of PEEK-SPEEK-HA composites.

Key words：polyetheretherketone-hydroxyapatite (PEEK-HA) composite; U2OS cell; cell morphology; proliferation; cell adhesion; cell apoptosis; reactive oxygen species (ROS)

作者簡介：倪卓(1965—)，男，深圳大學(xué)教授、博士生導(dǎo)師. 研究方向：生物材料和功能材料. E-mail: royzhuoni@hotmail.com

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(51378315)；廣東省教育廳科技創(chuàng)新資助項目(2013KJCX0163)

中圖分類號：R 318.08

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

doi：10.3724/SP.J.1249.2016.01001