黃 華 伍玲園 唐秀法 陳自洪 孫燕萍 牛向麗

(廣西壯族自治區(qū)人口和計劃生育研究中心生殖醫(yī)學(xué)科，南寧市 530021，E-mail：86168263@qq.com)

論著·臨床研究

玻璃化冷凍人卵母細(xì)胞體外受精-胚胎移植9例臨床分析▲

黃 華 伍玲園 唐秀法 陳自洪 孫燕萍 牛向麗

(廣西壯族自治區(qū)人口和計劃生育研究中心生殖醫(yī)學(xué)科，南寧市 530021，E-mail：86168263@qq.com)

目的 探討人卵母細(xì)胞玻璃化冷凍在體外受精-胚胎移植(IVF-ET)中的應(yīng)用效果。方法 行IVF-ET治療、因取卵日男方因素?zé)o法進(jìn)行受精的患者9例，對其成熟卵子進(jìn)行玻璃化冷凍保存，解凍后進(jìn)行卵胞漿內(nèi)顯微授精(ICSI)，記錄卵子復(fù)蘇、受精、卵裂及移植后妊娠情況。結(jié)果 9例患者共解凍復(fù)蘇58枚卵子，復(fù)蘇率68.2%(58/85)；復(fù)蘇后進(jìn)行ICSI的成熟卵子中，受精40枚，形成胚胎34枚，受精率69.0%，卵裂率85.0%。7個移植周期共移植胚胎15枚，臨床妊娠3例，臨床妊娠率42.9%。結(jié)論 人卵母細(xì)胞玻璃化冷凍可以獲得一定的臨床妊娠率，在IVF-ET中可作為臨床治療的選擇之一。

體外受精；胚胎移植；玻璃化冷凍；卵胞漿內(nèi)精子顯微注射；卵母細(xì)胞

卵母細(xì)胞冷凍保存是一種發(fā)展迅速的技術(shù)，具有重要的現(xiàn)實意義和社會價值，該技術(shù)的應(yīng)用逐漸增多。我國實施“二孩”政策以后，卵母細(xì)胞冷凍應(yīng)用前景更加廣闊。細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生冰晶是冷凍過程中造成卵子功能受損的主要原因之一。與胚胎、精子相比，卵子的表面積與體積比值小，這導(dǎo)致了卵子在慢凍過程中更加不易脫水，進(jìn)而在細(xì)胞內(nèi)更容易形成冰晶，損傷細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)，這可對卵子的發(fā)育潛能產(chǎn)生不利影響，甚至導(dǎo)致卵子凋亡。玻璃化冷凍卵子技術(shù)是近年來輔助生殖領(lǐng)域的一項熱門新技術(shù)，能有效地解決冷凍過程中產(chǎn)生冰晶的問題。該技術(shù)不需要程序冷凍儀，操作簡單、迅捷、效率高，而且費用相對較低。其原理是在高濃度冷凍保護(hù)劑作用下將卵母細(xì)胞快速降溫，使胞漿由液態(tài)變?yōu)闃O其黏稠的非結(jié)構(gòu)的玻璃態(tài)而無任何形式的冰晶形成。在卵子解凍過程中也同樣能完全不形成冰晶，從而減少低溫凍融對細(xì)胞產(chǎn)生的損傷[1]。該技術(shù)將卵子保存在-196℃液氮中，最長可保存30年，且保持排卵時的正常狀態(tài)[2]。玻璃化冷凍技術(shù)從1995年開始用于人卵子的冷凍保存，因其能更好地保持卵子的生理功能，并獲得更好的妊娠結(jié)局，逐漸被廣泛認(rèn)可，近年來被越來越多生殖中心應(yīng)用于臨床[3]。2013年美國生育年會頒布的指導(dǎo)原則也表明，成熟卵子的冷凍已經(jīng)不再局限于實驗研究[4]。但是，目前國內(nèi)外不同生殖中心采用的載體、保護(hù)劑及冷凍程序等不盡相同，世界范圍內(nèi)還沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的玻璃化冷凍方案，對保護(hù)劑和載體的選擇及冷凍程序等仍未達(dá)成共識[5]。許多研究致力于改進(jìn)卵子玻璃化冷凍條件，探討在體外受精中最佳的玻璃化冷凍方法。隨著臨床中玻璃化冷凍技術(shù)的不斷推廣和逐步完善，卵母細(xì)胞玻璃化冷凍技術(shù)也發(fā)展迅速，與新鮮卵母細(xì)胞相比，玻璃化冷凍卵子的受精率、卵裂率和臨床妊娠率無統(tǒng)計學(xué)差異[6]。在臨床上，有小部分患者在體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo tranfer，IVF-ET)采卵日因男方因素?zé)o法獲得精子，通過行卵子玻璃化冷凍有效地解決了這一問題，避免了卵子的浪費，給廣大不孕不育患者帶來了福音。近年來本生殖中心根據(jù)單位現(xiàn)有條件，借鑒國內(nèi)外先進(jìn)生殖中心的經(jīng)驗，應(yīng)用人類成熟卵母細(xì)胞玻璃化冷凍這一技術(shù)，取得了較好的臨床結(jié)局。本文分析9例在取卵當(dāng)日因為男方取精失敗而行卵子玻璃化冷凍的患者的臨床結(jié)局，探討卵子玻璃化冷凍技術(shù)在IVF-ET應(yīng)用的可行性，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2011年3月至2015年6月在我中心行IVF-ET助孕治療的患者9例，均在取卵當(dāng)日無法獲得男方精子，年齡23～36歲，平均31.8歲。在簽署知情同意書后行成熟卵子玻璃化冷凍。

1.2 卵子凍融方法

1.2.1 卵子冷凍方法：采用日本加藤公司的玻璃化冷凍冷卻盒和瑞典Vitrolife公司的卵子處理液G-mops-plus。其中，玻璃化冷凍冷卻盒包括平衡液(equilibration solution，ES)和玻璃化溶液(vitrification solution，VS)。配備凍卵所用冷凍液滴前，以上液體需要提前30 min于25℃室溫進(jìn)行平衡。將G-mops-plus 2 ml加入3001培養(yǎng)皿中，用剝卵器將已脫顆粒的成熟卵子移入，漂洗去油。在3003培養(yǎng)皿的皿蓋配置G-mops-plus及ES微滴待用，其中G-mops-plus微滴1個，ES液滴3個(ES1、ES2、ES3)，各約20 μl，G-mops-plus液滴與ES1、ES2盡量等大且成等邊三角形排列。漂洗去油后的卵子首先移至3003皿蓋的G-mops-plus液滴。1 min后將G-mops-plus與ES1連線，計時2 min，由于滲透壓的不同，過程中可見卵子飄向G-mops-plus液滴頂端；在G-mops-plus與ES1連線的中點與ES2再次連線，計時2 min；最后將卵子移至ES3液滴放置5 min。卵子置于ES3液滴期間，在3003皿蓋繼續(xù)配置VS液滴3個，每個約10 μl，反復(fù)用VS液清洗剝蝕的吸管。5 min后將卵子從ES3中移至VS液滴，依次漂洗數(shù)次，至最后一個VS液滴停留，準(zhǔn)備裝載，在VS液中的總時間需大于90 s但小于120 s。裝載體積小于2 μl。裝載后將載體投入盛有液氮的容器，再次核對標(biāo)識后移入液氮罐。

1.2.2 解凍卵子：采用日本KITAZATO公司的玻璃化冷凍解凍試劑盒，解凍液由解凍液(thawing solution，TS)、稀釋液(dilute solution，DS)和洗液-1(washing solution-1，WS-1)及WS-2 4部分組成。在使用前，也需要提前30 min將TS于37℃進(jìn)行平衡，DS、WS-1和WS-2于25℃室溫平衡。首先，從液氮中取出Cryotop載桿，將裝有卵子的載桿前端快速浸入TS中，把卵子從 Cryotop 載桿上洗脫，此過程不超過1 min。然后，將卵子迅速移至DS中，讓卵子自然下沉。3 min后再將卵子置于WS-1中，5 min后將卵子移至WS-2中。再過5 min后，將形態(tài)完全恢復(fù)的卵子轉(zhuǎn)入培養(yǎng)液中。對復(fù)蘇的成熟卵子全部進(jìn)行卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)。

2 結(jié) 果

解凍了9例患者共85枚玻璃化冷凍成熟卵子，復(fù)蘇了58枚，復(fù)蘇率68.2%；對復(fù)蘇的58枚MⅡ期卵子全部進(jìn)行ICSI，共受精40枚，受精率69.0%(40/58)，形成了胚胎34枚，卵裂率85.0%(34/40)，優(yōu)胚率32.3%(11/34)。7個移植周期移植胚胎15枚。移植后2周，抽血驗β-HCG，2周后對陽性者行B超檢測，有孕囊和出現(xiàn)胎心搏動者可判斷為臨床妊娠，臨床妊娠共3例(42.9%)，其中1例為宮外孕，1例單胎足月分娩一健康男嬰，另1例單胎仍在妊娠中，已有38周，發(fā)育正常。剩余3枚冷凍胚胎。9例患者的凍融結(jié)果及妊娠情況見表1。

表1 9例患者的凍融結(jié)果及妊娠情況

3 討 論

玻璃化冷凍法利用高濃度保護(hù)劑溶液，使胚胎受凍時胞漿能從液態(tài)變?yōu)闊o結(jié)構(gòu)的玻璃狀態(tài)，這種玻璃狀態(tài)能使處于溶液狀態(tài)的分子和離子得以保持很好的分布，不產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)結(jié)晶，不需充分脫水，滲透壓與跨膜物質(zhì)濃度相差不大，不易產(chǎn)生不可逆的細(xì)胞膜理化損傷而引起細(xì)胞死亡[7]，冷凍過程中細(xì)胞內(nèi)容易形成冰晶，從而使細(xì)胞膜及細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)受損，導(dǎo)致染色體異常，對細(xì)胞造成致命傷害，而玻璃化冷凍法很好地解決了這一問題[8]。玻璃化冷凍技術(shù)是體外受精實驗室一個很好的工具，使輔助生殖有了更多的選擇并增加了靈活性。玻璃化冷凍的出現(xiàn)推動了常規(guī)臨床實踐的期望結(jié)局的發(fā)展，無論是在提高解凍后的存活率、臨床妊娠率，還是加強(qiáng)對植入前遺傳學(xué)診斷的臨床效果，此技術(shù)都有不俗的表現(xiàn)[9]。

人類卵母細(xì)胞體外保存已經(jīng)成為輔助生殖技術(shù)進(jìn)步的客觀要求。作為一種發(fā)展迅速的冷凍技術(shù)，玻璃化冷凍技術(shù)的優(yōu)點正逐漸被認(rèn)識[5]。雖然，玻璃化冷凍卵母細(xì)胞解凍后的復(fù)蘇率、受精率及移植妊娠率等都較前有所提高，但是，目前的卵子玻璃化冷凍技術(shù)還不夠成熟，人們對冷凍卵子的成熟階段、冷凍程序、冷凍劑等方面仍未全面了解[1]。雖然經(jīng)過冷凍和解凍程序之后卵母細(xì)胞存活率似乎有所改善，但一個重要問題是體外成熟(in vitro maturation，IVM)與受精率低及未成熟的卵母細(xì)胞冷凍緊密相關(guān)[10]。然而，也有研究表明在未成熟GV期和在成熟MⅡ期玻璃化冷凍卵母細(xì)胞的存活率沒有顯著差異[11]。李娜等[12]選取未成熟卵子進(jìn)行研究，將GV期卵子(220枚)直接行玻璃化冷凍，同時將GV期卵子(155枚)直接行IVM，待培養(yǎng)至MⅡ期，再行玻璃化冷凍，兩組間存活率、成熟率、受精率、卵裂率和囊胚形成率無差異，說明GV期卵子直接冷凍或體外培養(yǎng)至 MⅡ期冷凍效果相當(dāng)。

本實驗室采用的是美國玻璃化冷凍方法，冷凍試劑是日本KITAZATO公司的玻璃化冷凍解凍試劑盒和瑞典Vitrolife公司的G-mops-plus，9例患者共解凍復(fù)蘇了85枚卵子，復(fù)蘇率68.2%，高于秦文松等[13]報告的59.62%，與耿潔等[14]報告的68.57%相似，但低于滕曉明等[8]報告的83.02%；復(fù)蘇后的成熟卵子進(jìn)行ICSI，受精率69.0%，與秦文松等[13]報告的67.74%、滕曉明等[8]報告的72.73%相似，低于耿潔等[14]的91.67%； 卵裂率85.0%，與耿潔等[14]報告的86.36%相似，但低于秦文松等[13]報告的95.24%、滕曉明等[8]報告的93.75%； 7個移植周期共移植胚胎15枚，臨床妊娠3例，獲得了42.9%的移植妊娠率，與秦文松等[13]、耿潔等[14]報告的40%相似，高于滕曉明等[8]報告的22.22%。雖然ICSI 輔助受精能夠大大提高凍融卵子的受精率，但是并不能提高卵裂率及優(yōu)質(zhì)胚胎率，后兩者決定于精子與卵子的質(zhì)量[15]。我們只獲得了68.2%的復(fù)蘇率，可能與經(jīng)驗不足有關(guān)，因此，在卵子復(fù)蘇率上還有待進(jìn)一步提高，凍融后卵子的受精及其胚胎發(fā)育需進(jìn)一步深入研究，提高卵裂率。

穩(wěn)定成熟的卵子冷凍技術(shù)是臨床應(yīng)用的前提，國內(nèi)外有關(guān)卵子的玻璃化冷凍在睪丸取精失敗周期中的臨床應(yīng)用僅有有限的文獻(xiàn)報告，臨床可行性尚需大樣本證實[16]。經(jīng)過冷凍和解凍程序之后GV期卵母細(xì)胞IVM困難依然存在[17]。本中心初步應(yīng)用該技術(shù)，還存在卵子復(fù)蘇率(68.2%)、優(yōu)胚率(32.3%)偏低的問題，說明在卵子的玻璃化冷凍及解凍過程中，超低溫可能給細(xì)胞透明帶、超微結(jié)構(gòu)(如膜結(jié)構(gòu)、細(xì)胞骨架等)、紡錘體等帶來了損傷，使冷凍卵子復(fù)蘇后不能完全自我修復(fù)，從而不能發(fā)育成優(yōu)質(zhì)胚胎，甚至囊胚[18]。從妊娠結(jié)局來看，3例臨床妊娠所移植的胚胎均有優(yōu)質(zhì)胚胎，說明卵子在冷凍、解凍、ICSI后若能形成優(yōu)質(zhì)胚胎，則該胚胎具備良好的發(fā)育潛能，移植后更有可能獲得理想的結(jié)局，也說明我生殖中心采用的卵子玻璃化冷凍體系是可行的。隨著實踐經(jīng)驗的積累，該體系可不斷完善成為成熟的卵子玻璃化凍融方案。

凍存卵母細(xì)胞活產(chǎn)嬰兒的數(shù)量在過去十年迅速增加，玻璃化冷凍技術(shù)的發(fā)展必然伴隨著產(chǎn)科和圍產(chǎn)期結(jié)局，以及嬰兒的長期發(fā)展評估[17]。尤其是標(biāo)本直接與液氮接觸帶來的污染問題以及高濃度冷凍保護(hù)劑的毒性影響，還有冷凍技術(shù)本身帶來的一定遺傳風(fēng)險都決定今后研究方向應(yīng)為冷凍方法的優(yōu)化與安全性[8]。由于缺乏高育齡婦女的數(shù)據(jù)和用于長期儲存的卵母細(xì)胞凍存數(shù)據(jù)，迄今文獻(xiàn)可靠性也存在局限性[17]。因此，這些信息還不能涵蓋整個生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。一項研究初步分析了玻璃化冷凍卵母細(xì)胞后的165例妊娠者和200名嬰兒的產(chǎn)科和圍產(chǎn)期結(jié)局[18]，其平均出生體重和先天畸形的發(fā)生率與不孕婦女接受體外受精治療或自然懷孕育齡婦女相當(dāng)，這提示通過使用卵子玻璃化冷凍治療出現(xiàn)的低懷孕率和低出生體重嬰兒率與產(chǎn)科和圍產(chǎn)期結(jié)局風(fēng)險的增加不相關(guān)。僅意大利就有約2 000名為卵母細(xì)胞凍存出生的嬰兒，至今沒有異常嬰兒數(shù)量增加的報告[11]。目前有限的資料提示此項技術(shù)是安全的，但還需要進(jìn)一步的研究。

隨著進(jìn)一步的深入研究，卵母細(xì)胞玻璃化冷凍的標(biāo)準(zhǔn)程序?qū)惶岢?，可綜合女性的年齡和冷凍保存的原因，為其提供合理的信息以幫助做出明智的選擇，以解決女性生育力保存的問題。未來對于卵母細(xì)胞凍存的研究成果，將為輔助生殖治療提供更深入的見解。

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In vitro fertilization and embryo transfer using human oocytes with vitrified cryopreservation:a report of 9 cases

HUANGHua,WULing-yuan,TANGXiu-fa,CHENZi-hong,SUNYan-ping,NIUXiang-li

(ResearchCenterforPopulationandFamilyPlanningofGuangxiZhuangAutonomousRegion,Nanning530021,China)

Objective To explore the effect of vitrification of human oocytes applied to in vitro fertilization and embryo transfer(IVF-ET).Methods Nine patients who could not be fertilized due to male factors underwent IVF-ET.The mature ova of these patients were treated with vitrified cryopreservation.Intracytoplasmic sperm injection(ICSI) was conducted after the ova were thawed.The recovery,fertilization,segmentation and pregnancy after transplantation were recorded.Results A Total of 58 ova were thawed in the 9 patients,and the recovery rate was 68.2%(58/85) .Of the mature ova received ICSI after recovery,40 ova were fertilized and 34 developed into embryos.The fertilization rate and segmentation rate were 69.0% and 85.0% respectively.In 7 transplantation cycles,15 embryos were transplanted and clinical pregnancy was completed in 3 cases,and the clinical pregnancy rate was 42.9%.Conclusion Vitrified cryopreservation of human oocytes can achieve satisfactory clinical pregnancy rate.IVF-ET can be one of the choices for clinical therapy. 【Key words】 In vitro fertilization,Embryo transfer,Vitrified cryopreservation,Intracytoplasmic sperm injection,Oocyte

廣西壯族自治區(qū)計劃生育委員會科研項目(桂人口計生研1109，桂人口計生研1102)

黃華(1983～)，男，碩士，助理研究員，研究方向：胚胎實驗。

牛向麗(1978～)，女，碩士，助理研究員，研究方向：胚胎實驗，E-mail：59075287@qq.com。

R 169

A

0253-4304(2016)07-0941-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.07.14

2016-02-04

2016-05-04)