杜靜　劉蘇

地塞米松對(duì)兔眼水通道蛋白-1表達(dá)的影響及其與眼壓的關(guān)系

杜靜1劉蘇2

目的 研究地塞米松（DEX）對(duì)兔眼小梁內(nèi)皮細(xì)胞（TM）和睫狀體無(wú)色素上皮（NPCE）細(xì)胞水通道蛋白-1（AQP1）表達(dá)的影響。方法 建立兔皮質(zhì)類固醇性高眼壓模型，用免疫組化和免疫熒光方法檢測(cè)高眼壓組與正常對(duì)照組AQP1表達(dá)水平的差異。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組兔眼NPCE的AQP1表達(dá)比正常對(duì)照組增強(qiáng)（P＜0.05），而在TM細(xì)胞則減弱（P＜0.05）。結(jié)論 地塞米松能使兔眼眼壓升高，可能是通過(guò)抑制AQP1在TM的表達(dá)，并使NPCE的AQP1表達(dá)上調(diào)，這可能是皮質(zhì)類固醇性青光眼的病理機(jī)制之一。

地塞米松；睫狀體無(wú)色素上皮細(xì)胞；小梁細(xì)胞；水通道蛋白-1；青光眼

1　引言

水通道蛋白（aquaporins，AQPs）是一類廣泛存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)細(xì)胞膜或細(xì)胞內(nèi)囊泡中的水分子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，目前在眼組織中發(fā)現(xiàn)有5種AQP亞型［1-2］，與眼內(nèi)液體轉(zhuǎn)運(yùn)和眼功能的維持密切相關(guān)。目前皮質(zhì)類固醇性青光眼（corticosteroid glaucoma）的發(fā)病機(jī)制不明確，但睫狀體房水產(chǎn)生過(guò)多或者小梁網(wǎng)房水流出障礙引起的眼內(nèi)壓的升高是公認(rèn)的主要危險(xiǎn)因素［3］。AQP家族的發(fā)現(xiàn)，為房水動(dòng)力學(xué)開(kāi)啟了新的研究領(lǐng)域。

2　材料與方法

2.1主要試劑及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

地塞米松磷酸鈉（Sigma），鼠抗兔AQP1多克隆抗體（ADI，免疫組化一抗），山羊抗鼠IgG（Sigma，免疫組化二抗），Cy3熒光標(biāo)記羊抗鼠IgG（Sigma，免疫熒光二抗），SABC免疫組化試劑盒（中杉）。8周齡健康新西蘭大白兔30只。

2.2實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1兔激素性高眼壓模型的建立 采用隨機(jī)數(shù)字法將30只兔分為兩組：實(shí)驗(yàn)組（20只）和正常對(duì)照組（10只）。處理前用Schiotz眼壓計(jì)測(cè)量兔眼壓［4］，然后用1%地塞米松磷酸鈉溶液［5］滴實(shí)驗(yàn)組雙眼，用無(wú)菌生理鹽水滴對(duì)照組雙眼，連續(xù)3周，監(jiān)測(cè)眼壓。眼壓成功升高的實(shí)驗(yàn)組兔再隨機(jī)分為DEX組（10只）和觀察組（9只，死亡1只）。DEX組立即取下眼球標(biāo)本固定，觀察組繼續(xù)監(jiān)測(cè)眼壓6周，最后取下眼球標(biāo)本固定、包埋、切片。

2.2.2免疫組織化學(xué)（SABC法）和免疫熒光 石蠟片經(jīng)常規(guī)處理及免疫組化、免疫熒光方法處理，拍照采集圖片。陰性對(duì)照用PBS緩沖液代替一抗。最后采集圖片用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件定量分析免疫組化染色的陽(yáng)性光密度值。

2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

DEX作用前后眼內(nèi)壓數(shù)據(jù)用自身配對(duì)t檢驗(yàn)方法。正常對(duì)照組、DEX組和觀察組之間免疫組化的光密度值（OD）的比較用多個(gè)樣本均數(shù)間比較的SNK法單因素方差分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)資料用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3　結(jié)果

3.1眼壓

用1%地塞米松磷酸鈉溶液滴眼可以成功建立兔皮質(zhì)類固醇性高眼壓模型，成功率95%（P＜0.05）。用藥前兔眼基礎(chǔ)眼壓為（35.591±2.513 1）mm Hg，實(shí)驗(yàn)組用藥后第13～19 d時(shí)達(dá)高峰，約（50.5±3.829 7）mm Hg，觀察組眼壓在停藥8周后基本降到用藥前水平。

3.2組織病理學(xué)改變

3.2.1免疫熒光切片 AQP1在正常兔眼角膜內(nèi)皮和虹膜后色素上皮、睫狀體無(wú)色素上皮、小梁內(nèi)皮等多處表達(dá)。Cy3熒光成亮紅色，表達(dá)部位在陽(yáng)性細(xì)胞的胞膜。

3.2.2免疫組化切片 AQP1的表達(dá)在組織切片上表現(xiàn)為陽(yáng)性細(xì)胞膜上的棕褐色顆粒。AQP1在DEX組NPCE的表達(dá)（0.365±0.112）較對(duì)照組（0.276±0.077）增強(qiáng)（P＜0.05），在觀察組（0.280±0.086）則恢復(fù)到正常水平。AQP1在DEX組TM的表達(dá)（0.164±0.085）較對(duì)照組減弱（0.265±0.056）（P＜0.05），陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量也減少，觀察組（0.181±0.066）與DEX組的情況接近、尚未恢復(fù)。

4　討論

Bogner B［2］等研究發(fā)現(xiàn)并定位了兔眼內(nèi)5個(gè)AQPs亞型。在胎鼠發(fā)育過(guò)程中AQP1表達(dá)在NPCE以及虹膜后上皮層，提示其與房水的分泌有關(guān)［6］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AQP1在兔眼TM和Schlemm管以及NPCE的內(nèi)皮表達(dá)，可以看出這種分布與眼內(nèi)房水的分泌和流出密切相關(guān)。Zhang等［7］進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)AQP1基因敲除鼠的房水生成明顯減少，眼壓下降，因此AQP1被證實(shí)參與了睫狀體房水的分泌過(guò)程。那么本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DEX使兔眼NPCE的AQP1表達(dá)上調(diào)，房水分泌增加，可以認(rèn)為是激素性高眼壓的原因之一。

另一方面本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)DEX抑制兔眼小梁組織AQP1的表達(dá)，同樣地塞米松也抑制體外培養(yǎng)的人眼小梁細(xì)胞［8］AQP1的表達(dá)。AQP1在小梁和Schlemm管內(nèi)皮細(xì)胞的作用還不得而知，而房水的外流主要是通過(guò)細(xì)胞外途徑還是跨細(xì)胞途徑，地塞米松對(duì)房水外流阻力有哪些影響等，都有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，DEX誘導(dǎo)兔眼壓升高，可能是通過(guò)上調(diào)睫狀體無(wú)色素上皮AQP1的表達(dá)，增加房水生成，同時(shí)抑制小梁組織AQP1表達(dá)，同時(shí)小梁細(xì)胞減少，細(xì)胞外基質(zhì)堆積，房水排出受阻。兩方面綜合作用，導(dǎo)致激素性青光眼的發(fā)生。

［1］Verman AS. Role of aquaporin water channels in eye function［J］. Exp Eye Res，2003，76（2）：137-143.

［2］Bogner B，Schroedl F，Trost A，et al. Aquaporin expression and localization in the rabbit eye［J］. Exp Eye Res.，2016，147：20-30.

［3］Knepper PA，Goossens W，Hvizd M，et al. Glycosaminoglycans of the human trabecular meshwork in primary open-angle glaucoma［J］. Invest Ophthalmol Vis Sci.，1996，37（7）：1360-1367.

［4］Best M，Pola R，Galin MA，et al. Tonometric calibration for the rabbit eye［J］. Arch Ophthalmol，1970，84（2）：200-205.

［5］Levene RZ，Rothberger M，Rosenberg S. Corticosteroid glaucoma in the rabbit［J］. Am J Ophthalmol，1974 ，78（3）：505-510.

［6］Yamaguchi Y，Watanabe T，Hirakata A，et al. Localization and ontogeny of aquaporin-1 and -4 expression in iris and ciliary epithelial cells in rats［J］. Cell Tissue Res.，2006，325（1）：101-109.

［7］Zhang D，Vetrivel L，Verkman AS. Aquaporin deletion in mice reduces intraocular pressure and aqueous fluid production［J］. Gen Physiol.，2002，119（6）：561-569.

［8］林明楷，葛堅(jiān)，黃楚龍，等. 地塞米松對(duì)人眼小梁細(xì)胞水通道蛋白-1表達(dá)的影響［J］. 中國(guó)藥房，2002，13（12）：713-714.

Effects of Dexamethasone on Expression of Aquaporin-1 in Rabbit Eye and the Correlation to Intraocular Pressure

DU Jing1LIU Su21 Department of Ophthalmology， Chongqing Aier Eye Hospital， Chongqing 400000， China， 2 Department of Ophthalmology， The Second Affliated Hospital of Chongqing University of Medical Sciences，Chongqing 400010， China

Objective To study the effects of dexamethasone （DEX）on expression of aquaporin-1 （AQP1） in rabbit eye's trabecular meshwork （TM） and non-pigmented ciliary epithelium （NPCE） cells. Methods To establish a rabbit model of high intraocular pressure induced by corticosteroids， and to detect the difference of AQP1 expression between high intraocular pressure group and normal control group by immunohistochemistry and immunofluorescence method. Results The expression of AQP1 of NPCE in the experimental group was stronger than that in the normal control group （P＜0.05）， while the TM cells were decreased （P＜0.05）. Conclusion Dexamethasone can increase the intraocular pressure of the rabbit eyes， may be throughinhibiting the expression of AQP1 in TM， and make AQP1 of NPCE expression up regulation， which may be one of the pathological mechanisms of corticosteroid glaucoma.

Dexamethasone， Non-pigmented ciliary epithelium，Trabecular meshwork， Aquaporin-1， Glaucoma

R775

A

1674-9308（2016）22-0212-02

10.3969/j.issn.1674-9308.2016.22.140

1重慶愛(ài)爾眼科醫(yī)院眼科，重慶 400000；2 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院眼科，重慶 400010

劉蘇，E-mail：liusu2836@sina.com