賴呈純，黃賢貴，黃金澤，潘 紅，范麗華*，謝鴻根，王 琦

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所 350003；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)經(jīng)濟與科技信息研究所)

KT對刺葡萄愈傷組織花青素含量的影響

賴呈純1，黃賢貴1，黃金澤2，潘 紅1，范麗華1*，謝鴻根1，王 琦1

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所 350003；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)經(jīng)濟與科技信息研究所)

以長期保持的紫紅色刺葡萄愈傷組織DLR細胞系為試驗材料，研究不同KT濃度對其花青素和原花青素含量的影響，結(jié)果表明：KT可以有效調(diào)控刺葡萄愈傷組織花青素和原花青素的合成，其中以MS+2,4-D 1.0 mg/L+KT 0.05 mg/L培養(yǎng)基效果最佳，花青素和原花青素含量分別達到66.95 μg/g(FW)和3947.50 μg/g(FW)，分別是對照的2.44倍和1.68倍。

刺葡萄；6-糠氨基嘌呤(KT)；花青素；原花青素；愈傷組織

LAI Cheng-chun1, HUANG Xian-gui1, HUANG Jin-ze2, PAN Hong1, FAN Li-Hua1*, XIE Hong-Gen1, WANG Qi1

(1.InstituteofAgriculturalEngineeringandTechnology,FujianAcademyofAgriculturalSciences,FujianProvince350003；2.AgriculturalEconomyandScienceandTechnologyInformationResearchInstituteFujianAcademyofAgriculturalSciences,FujianProvince)

花青素和原花青素是清除人體自由基最有效的天然抗氧化劑，具有抗氧化、抗突變、抗腫瘤、保護心血管等方面的功能[1-3]。目前，天然的原花青素主要來源于松樹皮和葡萄籽，隨著市場需求的不斷擴大，原有來源于葡萄、松樹皮或其他替代植物的生物活性物質(zhì)已不能滿足市場需求，必須尋求更多更可靠的材料來源。植物細胞培養(yǎng)是生物技術(shù)領(lǐng)域的一個重要分支，是解決藥用植物資源匱乏的有效途徑[4]。然而，要通過細胞培養(yǎng)開展刺葡萄花青素生產(chǎn)，必須建立高含量花青素刺葡萄愈傷組織培養(yǎng)技術(shù)體系。本研究課題組曾對誘導(dǎo)產(chǎn)生并長期保持的兩個同質(zhì)不同型刺葡萄細胞系進行系列研究[5]，研究中發(fā)現(xiàn)，6-糠氨基嘌呤(KT)可顯著提高刺葡萄愈傷組織花青素含量。為了進一步了解KT對刺葡萄愈傷組織花青素含量的影響，在前期研究的基礎(chǔ)上，通過對培養(yǎng)基中KT濃度優(yōu)化，以期大幅度提高刺葡萄愈傷組織細胞中花青素的含量，從而為葡萄花青素的規(guī)?；a(chǎn)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

以福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所葡萄研究室誘導(dǎo)并長期保持的紫紅色刺葡萄愈傷組織DLR細胞系[5]為試驗材料。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基配方處理 根據(jù)前期的研究，以刺葡萄愈傷組織同步化培養(yǎng)基M0為對照處理(MS+2,4-D 1.0 mg/L)，設(shè)計添加6種濃度KT的培養(yǎng)基配方，用于其對刺葡萄愈傷組織花青素含量影響的研究，具體配方如下，M1：MS+2,4-D 1.0 mg/L+KT 0.05 mg/L，M2：MS+2,4-D 1.0 mg/L+KT 0.10 mg/L，M3：MS+2,4-D 1.0 mg/L+KT 0.50 mg/L，M4：MS+2,4-D 1.0 mg/L+KT 1.00 mg/L，M5：MS+2,4-D 1.0 mg/L+KT 1.50 mg/L，M6：MS+2,4-D 1.0 mg/L+KT 2.00 mg/L。以上培養(yǎng)基均加入蔗糖30 g/L、瓊脂粉6 g/L，pH值調(diào)整為5.8左右。

1.2.2 刺葡萄愈傷組織的選擇與預(yù)培養(yǎng) 為了使細胞旺盛生長并趨于同步化，需對細胞進行預(yù)培養(yǎng)，具體做法：選取長期繼代培養(yǎng)過程中穩(wěn)定顯示紫紅色的刺葡萄愈傷組織細胞系DLR，繼代培養(yǎng)20 d 后，挑取愈傷組織細胞團表層略帶部分里層的細胞作為接種材料，接種到未添加KT的M0培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 d，作為下一步試驗的接種材料。

1.2.3 刺葡萄愈傷組織接種與培養(yǎng) 選取預(yù)培養(yǎng)后的刺葡萄愈傷組織，接種到附加不同濃度KT的6種配方處理培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并以在M0培養(yǎng)基中培養(yǎng)的刺葡萄愈傷組織為對照。每種培養(yǎng)基接種20瓶，設(shè)3次重復(fù)，培養(yǎng)25 d和35 d時分別收集愈傷組織，用液氮速凍后，于-80℃下保存，備用。

1.2.4 刺葡萄愈傷組織花青素與原花青素含量測定 刺葡萄愈傷組織花青素與原花青素含量測定參照賴呈純等[5]的方法。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)采用DPS數(shù)據(jù)分析軟件進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)天數(shù)和不同培養(yǎng)基對刺葡萄細胞花青素含量的影響

在預(yù)培養(yǎng)后的細胞中挑取合適大小的細胞團(表層略帶部分里層的細胞)作為接種的材料，接種到6種配方處理的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)25 d和35 d 時分別取樣，測定細胞培養(yǎng)物中花青素含量，結(jié)果見表1。從培養(yǎng)天數(shù)變化來看，從培養(yǎng)25 d到35 d，花青素含量極顯著升高。從不同培養(yǎng)基來看，培養(yǎng)25 d時，在KT濃度為0～2.0 mg/L范圍內(nèi)，隨KT濃度的增加，刺葡萄細胞中花青素含量呈先增加后降低再增加的趨勢，增加和降低的幅度較小，最高為M6培養(yǎng)基，達18.52 μg/g(FW)；其次是M2培養(yǎng)基，為18.18 μg/g(FW)；第三是M1培養(yǎng)基，為15.44 μg/g(FW)；含量最低是對照處理M0培養(yǎng)基，為8.92 μg/g(FW)；除M4培養(yǎng)基外，其他培養(yǎng)基配方處理的刺葡萄細胞中花青素含量均極顯著高于對照處理的M0培養(yǎng)基。培養(yǎng)35 d時，在KT濃度為0～2.0 mg/L范圍內(nèi)，隨KT濃度的增加，花青素含量也呈先急劇增加后迅速降低再增加的趨勢，花青素含量最高的是M1培養(yǎng)基，達66.95 μg/g(FW)，并極顯著高于其他培養(yǎng)基配方處理；其次是M6培養(yǎng)基，為50.60 μg/g(FW)；第三是M2培養(yǎng)基，為39.54 μg/g(FW)；最低的是M3培養(yǎng)基，為22.22 μg/g(FW)。從以上分析結(jié)果可以看出，當(dāng)刺葡萄細胞在M1培養(yǎng)基中培養(yǎng)35 d時，最有利于其花青素合成，花青素含量高達66.95 μg/g(FW)，是對照處理M0培養(yǎng)基中刺葡萄細胞花青素含量的2.44倍。因此，刺葡萄細胞在MS+2,4-D 1.0 mg/L+KT 0.05 mg/L培養(yǎng)基中培養(yǎng)，可極大地提高其花青素含量。

表1 不同培養(yǎng)基中刺葡萄細胞花青素含量

注：①表中同列數(shù)據(jù)后無相同小寫字母的表示差異顯著(P<0.05)，無相同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)；②按鮮重測定，下同。

2.2 不同培養(yǎng)天數(shù)和不同培養(yǎng)基對刺葡萄細胞原花青素含量的影響

本研究進一步考察不同培養(yǎng)基對刺葡萄細胞中原花青素含量的影響。分別取25 d和35 d的刺葡萄細胞培養(yǎng)物，測定細胞培養(yǎng)物中原花青素含量，結(jié)果見表2。從培養(yǎng)天數(shù)變化來看，從培養(yǎng)25 d到35 d原花青素含量極顯著升高。從不同培養(yǎng)基來看，KT濃度在0～2.0 mg/L范圍內(nèi)，培養(yǎng)25 d時，原花青素含量隨KT濃度的升高呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，但增加和降低的幅度很小，在各培養(yǎng)基中培養(yǎng)的刺葡萄細胞原花青素含量除M1和M2與對照處理的M0培養(yǎng)基差異顯著外，其余差異都不顯著，原花青素含量最高的是M2培養(yǎng)基，為1433.65 μg/g(FW)；其次是M1培養(yǎng)基，為1406.48 μg/g(FW)；含量最低的是M0培養(yǎng)基，為1100.33 μg/g(FW)。培養(yǎng)35 d時，KT濃度在0～2.0 mg/L范圍內(nèi)，隨KT濃度的增加，刺葡萄細胞中原花青素含量呈先急劇升高后迅速下降再緩慢升高的趨勢，原花青素含量最高時對應(yīng)的培養(yǎng)基是M1，為3947.50 μg/g(FW)；其次是M6培養(yǎng)基，為2789.65 μg/g(FW)；含量最低的是M4培養(yǎng)基，為1836.24 μg/g(FW)。從以上分析可以看出，在M1培養(yǎng)基中培養(yǎng)35 d的刺葡萄細胞，其原花青素含量極顯著高于其他配方的培養(yǎng)基處理，高達3947.50 μg/g(FW)，是對照處理M0培養(yǎng)基的1.68倍。因此，刺葡萄細胞在MS+2,4-D 1.0 mg/L+KT 0.05 mg/L培養(yǎng)基中培養(yǎng)，可極大地提高其原花青素含量。

表2 不同培養(yǎng)基中刺葡萄細胞原花青素含量變化情況

3 小結(jié)與討論

植物細胞培養(yǎng)具有不受季節(jié)影響、生長周期短、產(chǎn)物均一可控、活性物質(zhì)含量高等優(yōu)點，被認為是解決藥用植物資源匱乏的有效途徑。目前，植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)天然活性物質(zhì)已經(jīng)取得很大進展[6]。因此，建立刺葡萄細胞培養(yǎng)生產(chǎn)花青素的技術(shù)體系，有望為花青素生產(chǎn)提供豐富的原材料。然而，如何有效提高刺葡萄細胞中花青素的含量，仍是目前亟須解決的問題。有研究表明，適量的細胞分裂素KT可以促進植物細胞分裂和增殖，并增加細胞中次生產(chǎn)物的含量，Narayan等[7]的研究證明，在添加0.2 mg/L KT的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，可較顯著地增加玫瑰茄細胞花青素含量。本研究發(fā)現(xiàn)，添加KT可以有效地調(diào)控刺葡萄細胞中花青素的合成，培養(yǎng)基中添加不同濃度KT均可增加刺葡萄愈傷組織花青素和原花青素含量，以MS+2,4-D 1.0 mg/L+KT 0.05 mg/L培養(yǎng)基效果最佳，其花青素和原花青素含量分別是對照的2.44倍和1.68倍。該研究結(jié)果可為進一步進行刺葡萄細胞規(guī)?；囵B(yǎng)生產(chǎn)花青素提供技術(shù)支撐。

[1]Thorne Research Inc.Oligomeric Proanthocyanidins (OPCs) (Monograph)[J].Altern Med Rev,2003,8(4):442-450.

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[3]PRAPHASAWAT R,KLUNGSUPYA P,MUANGMAN T,et al.Antimutagenicity and antioxidative DNA damage properties of oligomeric proanthocyanidins from thai grape seeds in TK6 cells[J].Asian Pac J Cancer P,2011,12:1317-1321.

[4]DONNEZ D,JEANDET P,CLéMENT C,et al.Bioproduction of resveratrol and stilbene derivatives by plant cells and microorganisms[J].Trends Biotechnol,2009,27(12):706-713.

[5]賴呈純,范麗華,黃賢貴,等.刺葡萄幼胚愈傷組織誘導(dǎo)及其高產(chǎn)原花青素細胞系篩選[J].植物生理學(xué)報,2014,50(11):1683-1691.

[6]呂春茂，范海延，姜河，等.植物細胞培養(yǎng)技術(shù)合成次生代謝物質(zhì)研究進展[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2007,21(1):1-5.

[7]NARAYAN M S,THIMMARAJU R, BHAGYALAKSHMI N.Interplay of growth regulators during solid-state and liquid-state batch cultivation of anthocyanin producing cell line ofDaucuscarota[J].Process Biochemistry,2005,40(1):351-358.

(責(zé)任編輯：楊小萍)

Effect of KT on anthocyanin content in callus of brier grape (VitisdavidiiFoёx)

Using the long-term maintained and purplish red callus of brier grape as test material, the effect of different KT concentration on its anthocyanin and proanthocyanidinscontent was investigated in this paper. The result showed that the anthocyanin and proanthocyanidins synthesis of brier grape callus could be regulated effectively by KT. The optimal medium was MS+2,4-D 1.0 mg/L+KT 0.05 mg/L, the anthocyanincontent and proanthocyanidinscontent were up to 66.95 μg/g(FW) and 3947.50 μg/g(FW), and they were 2.44 times and 1.68 times as control respectively.

Brier grape; 6-aminofurfurylpurine(KT); anthocyanin; proanthocyanidins; callus

2016-07-30

賴呈純，男，1975年生，博士，副研究員。

*通訊作者：范麗華，女， 1957年生，副研究員 (E-mail：512264119@qq.com)。

福建省科技計劃項目 ——省屬公益類科研院所基本科研專項(2014R1015-6)；福建省自然科學(xué)基金項目(2016J01126)；福建省種業(yè)創(chuàng)新與產(chǎn)業(yè)化工程項目(FJZZZY-1520)；“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計劃項目(2013BAD01B05-7)。

10.13651/j.cnki.fjnykj.2016.09.001