周志磊，徐志強(qiáng)，周順，汪華，徐菲菲，李玥，鐘芳

1(江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122)2(安徽中煙工業(yè)公司技術(shù)中心，安徽合肥，230088)

美拉德反應(yīng)是還原糖與含氮物質(zhì)(氨基酸、肽和蛋白質(zhì)等)間發(fā)生的一種非酶棕色化學(xué)反應(yīng)，它包括一系列復(fù)雜的反應(yīng)并產(chǎn)生大量的香味物質(zhì)和色素等成分［1-2］。美拉德反應(yīng)在形成和改善食品色澤和風(fēng)味中占有重要地位，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具有抗氧化、金屬螯合以及生物活性［3-4］。

研究人員常使用氨基酸還原糖混合物的簡單模型代替食品來研究美拉德反應(yīng)中香味物質(zhì)及色素的形成［5］。美拉德反應(yīng)可以在液相或者固相中進(jìn)行，液相反應(yīng)模型可以模擬蒸煮或者濕熱殺菌等過程中的美拉德反應(yīng)，而固相反應(yīng)模型代表了烘焙、燒烤以及卷煙燃燒等條件下的反應(yīng)過程。在可以對比的條件下固相和液相美拉德反應(yīng)的反應(yīng)時間和產(chǎn)物數(shù)目有明顯差異，但是不同相中美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的形成機(jī)理基本上是一樣的［6］，這有助于人們分析一些具體產(chǎn)物的形成機(jī)理。

脯氨酸美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的燒烤特征香味對許多需要進(jìn)行熱處理的食品風(fēng)味有重要貢獻(xiàn)［7］，一些研究人員分析了脯氨酸美拉德反應(yīng)中重要的香味物質(zhì)［8］。但是，這些研究大多是在液相中進(jìn)行的。因此本文探討了固相葡萄糖果糖與脯氨酸的美拉德反應(yīng)中焦甜香香味物質(zhì)的形成，并分析了它們的形成機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1水合 D-葡萄糖 (C6H12O6·H2O)、D-葡萄糖(C6H12O6)、D-果糖和 L-脯氨酸(Proline)、乙酸苯乙酯(內(nèi)標(biāo))、2-糠醇、2-乙酰呋喃、5-甲基-2-糠醇、4-羥基-2，5-二甲基-3(2H)-呋喃酮(HDMF)、無水硫酸鈉和正構(gòu)烷烴(C7～C15)為分析純，購自百靈威科技有限公司(北京，中國)。溶劑(CH2Cl2)為色譜純，購自Tedia公司(費(fèi)爾菲爾德，美國)。

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀6890-5975C，安捷倫科技有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:R-215，瑞士Buchi公司;超聲儀KQ5200E，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模型反應(yīng)與樣品制備

取1mmol的1水合D-葡萄糖、D-葡萄糖或者D-果糖與1mmol的L-脯氨酸混合并在研缽中充分研磨。將混合物放入試管中，蓋上瓶塞后在150℃加熱10 min。待試管自然冷卻后，依次加入20 μg內(nèi)標(biāo)和20 mL CH2Cl2，超聲萃取15 min。用無水 Na2SO4去除水分，將提取液過濾，并減壓濃縮至1 mL進(jìn)GCMS分析。每個樣品至少制備和測試2個重復(fù)。

1.2.2 氣相色譜-質(zhì)譜分析

色譜條件:進(jìn)樣量為1 μL，分流比5∶1。色譜柱為 HP-5MS(60 m × 0.25 mm，0.25 μm)，載氣為高純He，流量1.0 mL/min，進(jìn)樣口溫度240℃。升溫程序?yàn)?初始溫度50℃，保持5 min，以8℃/min升至250℃，保持10 min。質(zhì)譜電離能為70 eV，離子源溫度230℃，掃描范圍35～350amu。

1.2.3 反應(yīng)產(chǎn)物的定性和定量

先將得到的質(zhì)譜與NIST 08質(zhì)譜庫和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(authentic compounds，AC)(對于有標(biāo)樣的物質(zhì))的質(zhì)譜進(jìn)行比較，對揮發(fā)性成分進(jìn)行初步鑒定，再使用正構(gòu)烷烴的保留時間計算出各成分的線性保留指數(shù)(linear retention indices，LRI)［9］并與文獻(xiàn)值和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(對于有標(biāo)樣的物質(zhì))的結(jié)果進(jìn)行比對，保留LRI偏差小于15的物質(zhì)。忽略響應(yīng)因子(假定都是1)和回收率(假定100%)的影響，令內(nèi)標(biāo)和目標(biāo)物質(zhì)的峰面積比等于其濃度比，對鑒定的成分進(jìn)行近似定量。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式表示，不同處理的差異顯著性采用單因素方差分析測定，多重比較采用 Duncan法，顯著性水平為0.05，使用 SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 形成的揮發(fā)性成分分析

1水D-葡萄糖、D-葡萄糖及D-果糖與脯氨酸的固相美拉德反應(yīng)產(chǎn)物鑒定結(jié)果如表1所示，共鑒定了9個揮發(fā)性成分。2，3-二氫-3，5-二羥基-6-甲基-4(H)-吡喃-4-酮(DDMP)是這些揮發(fā)性成分中含量最高的物質(zhì)。DDMP是脯氨酸美拉德反應(yīng)模型中產(chǎn)量最大的揮發(fā)性成分之一，也是美拉德反應(yīng)尤其是2，3-烯醇化路徑的標(biāo)志［10］。此外，DDMP可能是一種重要的香味物質(zhì)-麥芽酚的前體物。4-羥基-2，5-二甲基-3(2H)-呋喃酮(HDMF)、2，4-二羥基-2，5-二甲基-3(2H)-呋喃酮(DDF)和5-羥基麥芽酚是脯氨酸美拉德反應(yīng)模型產(chǎn)物中重要的香味物質(zhì)，具有焦糖和烘焙特征香氣［7，11］;2-糠醇、2-乙酰呋喃、5-甲基-2-糠醇和2-環(huán)戊烯-1，4-二酮分別具有燃燒味、焦糖香、奶甜味和焦辛甜香特征氣味［12］。1-羥基-2-丙酮是糖降解的產(chǎn)物，可以做為糖降解反應(yīng)或者焦糖化反應(yīng)發(fā)生的標(biāo)志物［13］。葡萄糖和果糖與脯氨酸的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具有強(qiáng)烈的甜的焦糖香味，以上幾種具有甜香、焦糖及焙烤特征氣味的物質(zhì)可能對其總體香味有重要貢獻(xiàn)。本文重點(diǎn)關(guān)注幾種有焦糖香味的物質(zhì):2-乙酰呋喃、DDF、HDMF和5-羥基麥芽酚，研究反應(yīng)溫度、反應(yīng)物比例以及葡萄糖分子中結(jié)晶水等因素對其生成量的影響，并推測其形成機(jī)理。

表1 葡萄糖及果糖與脯氨酸在150℃加熱10 min生成的揮發(fā)性成分以及它們的氣味Table1 Formation of the volatile compounds in the reaction of glucose and fructose with proline heated at 150℃for 10 min and their odour

2.2 溫度對幾種重要焦糖風(fēng)味物質(zhì)生成量的影響

相對于液相美拉德反應(yīng)，固相美拉德反應(yīng)通常在較高的溫度下進(jìn)行［5，13-14］。因此，將葡萄糖或果糖與脯氨酸的等摩爾混合物分別在150、200、250、300℃和350℃下反應(yīng)10 min，考察反應(yīng)溫度對幾種選定產(chǎn)物生成量的影響。

圖1顯示了不同溫度下4種物質(zhì)的生成量。2-乙酰呋喃受溫度影響小于其他3種物質(zhì)。相對于1水葡萄糖和葡萄糖，果糖與脯氨酸的反應(yīng)更有利于2-乙酰呋喃的生成。葡萄糖分子中含有結(jié)晶水對2-乙酰呋喃的生成沒有明顯影響。對于DDF來說，溫度對其生成量有顯著的影響。果糖-脯氨酸、1水葡萄糖-脯氨酸及葡萄糖-脯氨酸反應(yīng)體系中DDF最有利的生成溫度分別為250、200和150℃。溫度對HDMF和5-羥基麥芽酚的影響相似，二者的最大生成量都在300℃左右，這可能預(yù)示著二者有相同的前體物或者反應(yīng)路徑。葡萄糖-脯氨酸混合物生成的HDMF和5-羥基麥芽酚含量要明顯高于果糖-脯氨酸和1水合葡萄糖-脯氨酸體系。說明葡萄糖相較于果糖更有利于產(chǎn)生HDMF和5-羥基麥芽酚，葡萄糖分子中存在結(jié)晶水會對二者的產(chǎn)生造成不利影響。

圖1 溫度對幾種焦糖風(fēng)味物質(zhì)生成量的影響Fig.1 Formation amounts of caramel-like aroma compounds in the reaction of reducing sugars with proline at different temperatures

2.3 反應(yīng)物摩爾比對幾種重要焦糖風(fēng)味物質(zhì)生成量的影響

在固相美拉德反應(yīng)模型中，還原糖和氨基酸的比例通常是 1∶1［5，15］(摩爾比或質(zhì)量比)，但不同實(shí)際樣品中的反應(yīng)物比例會有很大差異。本文研究了還原糖脯氨酸比例對幾種焦糖香物質(zhì)生成量的影響，如圖2所示。

圖2 還原糖脯氨酸摩爾比對幾種焦糖風(fēng)味物質(zhì)生成量的影響(同組不同字母代表有顯著差異(P＜0.05))Figure 2 Formation amounts of caramel-like aroma compounds with different molar ratios of reducing sugar to proline

總體上看，還原糖氨基酸比例對2-乙酰呋喃的影響較小，對DDF、HDMF和5-羥基麥芽酚的生成量影響較大。如圖2A所示，果糖脯氨酸相較于葡萄糖脯氨酸更容易受到反應(yīng)物比例的影響，且還原糖脯氨酸摩爾比小于1∶1時更有利于2-乙酰呋喃的生成。還原糖脯氨酸比例對DDF、HDMF和5-羥基麥芽酚的影響規(guī)律相似，如圖2B、圖2C及圖2D所示，當(dāng)還原糖脯氨酸摩爾比小于1∶1時，3種物質(zhì)的生成量較低，當(dāng)還原糖脯氨酸摩爾比大于1∶1時，3種物質(zhì)的生成量較高，特別是5-羥基麥芽酚，而當(dāng)還原糖脯氨酸摩爾比為2∶1時，3種物質(zhì)的生成量最大。葡萄糖中含有結(jié)晶水對2-乙酰呋喃、HDMF及5-羥基麥芽酚的生成產(chǎn)生了顯著的影響。水分對美拉德反應(yīng)的影響比較復(fù)雜，其機(jī)理還不十分清楚。原因可能是結(jié)晶水在反應(yīng)中揮發(fā)會消耗能量，進(jìn)而影響到了某些反應(yīng)路徑，結(jié)晶水的存在也可能會改變反應(yīng)物及一些反應(yīng)中間體的存在狀態(tài)，進(jìn)而造成反應(yīng)產(chǎn)物的顯著差異。

2.4 還原糖脯氨酸美拉德反應(yīng)路徑及幾種焦糖香物質(zhì)的形成機(jī)理

溫度和反應(yīng)物比例對DDF、HDMF和5-羥基麥芽酚的影響規(guī)律比較相似(圖1和圖2)，這說明三者可能有共同的前體物。葡萄糖和果糖與脯氨酸經(jīng)過一系列的美拉德前期反應(yīng)生成了活性中間體-去氧二羰基化合物［16］，例如 1-去氧-2，3-己二酮糖。它可以通過環(huán)化及一系列異構(gòu)化后脫水形成DDMP，DDMP可以氧化生成5-羥基麥芽酚［17］。作者發(fā)現(xiàn)DDMP和5-羥基麥芽酚的生成量之間有很強(qiáng)的相關(guān)性(數(shù)據(jù)沒有給出)，這也證明了二者間的前體物-產(chǎn)物關(guān)系。1-去氧-2，3-己二酮糖通過異構(gòu)化和脫水可以形成一種二去氧二酮糖化合物，此化合物可以轉(zhuǎn)化成DDF，DDF經(jīng)過還原和脫水形成HDMF［18］。此外，一些糖裂解產(chǎn)物也可以反應(yīng)生成HDMF，例如1-羥基-2-丙酮和2-氧代丙醛。這些產(chǎn)物在美拉德反應(yīng)中很容易得到［8］。2-乙酰呋喃主要有2種形成路徑，一種是Amadori化合物通過Strecker降解生成，得到的2-乙酰呋喃側(cè)鏈甲基上的碳來自于氨基酸;另一條路徑中1-去氧-2，3-己二酮糖脫水形成一種二去氧己二酮糖，此化合物環(huán)化后脫2個分子水生成2-乙酰呋喃，此路徑中2-乙酰呋喃的6個碳原子全部來自于還原糖。在液相美拉德反應(yīng)中，2條路徑都有發(fā)生，且第二條路徑占主要地位;而在裂解條件(固相反應(yīng))下，2-乙酰呋喃只通過第二條路徑生成［6］。

2-乙酰呋喃受溫度和反應(yīng)物比例影響都比較小，這可能暗示其反應(yīng)路徑和中間體比較穩(wěn)定，不易受反應(yīng)條件影響。而DDF受溫度的影響與還原糖種類有關(guān)。HDMF和5-羥基麥芽酚生成量隨著溫度的升高而增加，且在300℃時達(dá)到最大值。在溫度較高時，去氧二羰基化合物中間體等物質(zhì)的活性較高，也更容易轉(zhuǎn)化和降解生成HDMF和5-羥基麥芽酚，但當(dāng)溫度更高時，副反應(yīng)增多，其生成量下降。

還原糖在美拉德反應(yīng)中的消耗速度高于脯氨酸，其中一個重要原因是從還原糖和脯氨酸混合物到生成去氧二羰基化合物的反應(yīng)過程中，脯氨酸實(shí)際上起催化劑的作用，其消耗速度慢于還原糖［19］。這可能是還原糖氨基酸比例影響美拉德反應(yīng)產(chǎn)物種類和生成量的主要原因。果糖在美拉德反應(yīng)中通常比葡萄糖表現(xiàn)出較高的反應(yīng)活性［3］，但是，研究發(fā)現(xiàn)葡萄糖與脯氨酸反應(yīng)生成的DDF、HDMF和5-羥甲基麥芽酚遠(yuǎn)多于果糖脯氨酸混合物，在還原糖過量時這個現(xiàn)象更加明顯(圖2)，也就是說葡萄糖比果糖具有更高的活性。原因主要在于脯氨酸具有特殊的結(jié)構(gòu)，使其具有催化醛醇縮合反應(yīng)的活性，因此在美拉德反應(yīng)中它可以提高葡萄糖的活性［15］。

3 結(jié)論

溫度和反應(yīng)物比例對2-乙酰呋喃的生成影響較小，而對DDF、HDMF和5-羥基麥芽酚的生成有很大影響，且影響規(guī)律類似。4種焦甜香味物質(zhì)都可以由同一個前體物1-去氧-2，3-己二酮糖生成，解釋了溫度和反應(yīng)物比例對DDF、HDMF和5-羥基麥芽酚的生成影響規(guī)律類似的原因。由于脯氨酸的特殊催化活性，葡萄糖比果糖表現(xiàn)出更高的反應(yīng)活性，且葡萄糖中含有結(jié)晶水會對會上述幾種物質(zhì)的生成造成不利影響。本文的研究的美拉德反應(yīng)模型在固相中進(jìn)行，可以為烘焙、燒烤及卷煙燃燒時焦糖香物質(zhì)的生成提供參考。

［1］ van Boekel M A J S.Formation of flavour compounds in the Maillard reaction ［J］. Biotechnology Advances，2006，24(2):230-233.

［2］ Friedman M.Food browning and its prevention:an overview ［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1996，44(3):631-653.

［3］ Hwang I G，Kim H Y，Woo K S，et al.Biological activities of Maillard reaction products(MRPs)in a sugar-amino acid model system ［J］.Food Chemistry，2011，126(1):221-227.

［4］ Maillard M-N，Billaud C，Chow Y-N，et al.Free radical scavenging，inhibition of polyphenoloxidase activity and copper chelating properties of model Maillard systems［J］.LWT-Food Science and Technology，2007，40(8):1 434-1 444.

［5］ Nishibori S，Bernhard R A.Model system for cookies:Volatile components formed from the reaction of sugar and beta-alanine［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1993，41(12):2 374-2 377.

［6］ Wnorowski A，Yaylayan V A.Influence of pyrolytic and aqueous-phase reactions on the mechanism of formation of Maillard products［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2000，48(8):3 549-3 554.

［7］ Blank I，Devaud S，Matthey-Doret W，et al.Formation of odour-active compounds in Maillard model systems based on proline［C］.Beaune:Flavour Research at the Dawn of the Twenty-first Century，Proceedings of the 10th Weurman Flavour Research Symposium，2002-6-24.

［8］ Blank I，Devaud S，Matthey-Doret W，et al.Formation of odorants in Maillard model systems based on L-proline as affected by pH ［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2003，51(12):3 643-3 650.

［9］ van Den Dool H，Dec Kratz P A generalization of the retention index system including linear temperature programmed gas-liquid partition chromatography［J］.Journal of Chromatography A ，1963，11(0):463-471.

［10］ Yaylayan V A.，Mandeville S.Mechanistic pathway for the formation of maltoxazine from intact 1-［(2 ＇-carboxyl)pyrrolidinyl］-1-deoxy-D-fructose(Amadori-Proline)［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1994，42(9):1 841-1 844.

［11］ Cutzach I，Chatonnet P，Henry R，et al.Identifying new volatile compounds in toasted oak［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1999，47(4):1 663-1 667.

［12］ 毛多斌，鞠華波，牟定榮等.1-L-亮氨酸-1-脫氧-D-果糖和1-L-異亮氨酸-1-脫氧-D-果糖的熱裂解［J］.中國煙草學(xué)報，2010，6(12):1-9.

［13］ Ait A L，Rega B，Giampaoli P，et al.The fate of furfurals and other volatile markers during the baking process of a model cookie［J］.Food Chemistry，2008，111(3):758-763.

［14］ Nishibori S，Kawakishi S.Effects of dough materials on flavor formation in baked cookies［J］.Journal of Food Science，1990，55(2):409-412.

［15］ Britt P F，Buchanan A C，Owens J C V，et al.Does glucose enhance the formation of nitrogen containing polycyclic aromatic compounds and polycyclic aromatic hydrocarbons in the pyrolysis of proline?［J］.Fuel，2004，83(8):1 417-1 432.

［16］ Ledl F，Schleicher E.New aspects of the Maillard reaction in foods and in the human body［J］.Angewandte Chemie International Edition in English，1990，29(6):565-594.

［17］ Yaylayan V A，Mandeville S.Stereochemical control of maltol formation in Maillard reaction ［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1994，42(3):771-775.

［18］ Cutzach I，Chatonnet P，Dubourdieu D.Study of the formation mechanisms of some volatile compounds during the aging of sweet fortified wines［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1999，47(7):2 837-2 846.

［19］ Van Boekel Martinus A J S，Martins S I F S.Fate of glycine in the glucose-glycine reaction:a kinetic analysis［J］.International Congress Series，2002，1 245(11):289-293.