王 恬

(浙江師范大學(xué) 杭州幼兒師范學(xué)院,浙江 杭州 310012)

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運(yùn)動(dòng)免疫檢測(cè)方法的研究進(jìn)展*

王 恬

(浙江師范大學(xué) 杭州幼兒師范學(xué)院,浙江 杭州 310012)

生物技術(shù)的發(fā)展，使得越來(lái)越多的高新技術(shù)和方法運(yùn)用于運(yùn)動(dòng)免疫的研究中.運(yùn)用文獻(xiàn)資料法，對(duì)細(xì)胞免疫、免疫分子的檢測(cè)手段和方法進(jìn)行了深入的探討和研究，對(duì)不同的檢測(cè)方法進(jìn)行比較和分析，為運(yùn)動(dòng)免疫的研究提供方法學(xué)上的依據(jù)，并為通過(guò)更有效的研究方法來(lái)判斷和辨別運(yùn)動(dòng)性免疫抑制的現(xiàn)象和機(jī)制提供參考.

運(yùn)動(dòng)免疫；檢測(cè)；方法；免疫細(xì)胞；細(xì)胞因子

隨著生物科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，新的檢測(cè)手段和技術(shù)的推出，越來(lái)越多的高新技術(shù)和檢測(cè)方法應(yīng)用于運(yùn)動(dòng)免疫的研究中，已成為運(yùn)動(dòng)免疫學(xué)倍受關(guān)注的研究?jī)?nèi)容之一.免疫標(biāo)記物、免疫檢測(cè)儀器的不斷問(wèn)世，免疫分析靈敏度的不斷提高，使得運(yùn)動(dòng)免疫的研究不斷地深入.

1 免疫細(xì)胞的檢測(cè)

1.1 T淋巴細(xì)胞和細(xì)胞亞群的檢測(cè)

T淋巴細(xì)胞在人體細(xì)胞免疫中發(fā)揮著重要的作用.測(cè)定運(yùn)動(dòng)過(guò)程中T淋巴細(xì)胞及亞群的變化可以判斷運(yùn)動(dòng)機(jī)體的免疫功能狀態(tài)，并能為免疫機(jī)能的轉(zhuǎn)歸提供一定的參考依據(jù).

T淋巴細(xì)胞及其亞群的檢測(cè)方法包括細(xì)胞數(shù)量檢測(cè)和細(xì)胞功能的檢測(cè).常用的數(shù)量檢測(cè)方法有[1]：免疫熒光法、磁株分離法、流式細(xì)胞術(shù)等.常用的功能檢測(cè)方法有[2]：細(xì)胞毒試驗(yàn)、T細(xì)胞增殖試驗(yàn)、T細(xì)胞分泌功能檢測(cè)等.早期的一些檢測(cè)方法如玫瑰花環(huán)試驗(yàn)等已經(jīng)被淘汰，目前應(yīng)用最為普及的是流式細(xì)胞術(shù)，它具有快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是最先進(jìn)的細(xì)胞定量分析技術(shù)之一.

流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)是利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行的一種在功能水平上對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行定量分析和分選的技術(shù).它可以對(duì)混合細(xì)胞群中的亞群細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù).隨著流式細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，其發(fā)展趨勢(shì)體現(xiàn)在從相對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)到絕對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)、從單色到多色熒光分析、從相對(duì)定量到絕對(duì)定量分析.流式細(xì)胞術(shù)已廣泛應(yīng)用于免疫相關(guān)疾病的臨床研究和運(yùn)動(dòng)免疫發(fā)生機(jī)制及運(yùn)動(dòng)性免疫抑制的研究中[3-4].

1.2 自然殺傷細(xì)胞、自然殺傷T細(xì)胞的檢測(cè)

1)自然殺傷細(xì)胞(natural killer cells，NK)介導(dǎo)天然免疫應(yīng)答，能直接殺傷靶細(xì)胞，是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞之一，具有抗病毒、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等功能.NK細(xì)胞是一類被認(rèn)為在運(yùn)動(dòng)中反應(yīng)明顯、變化幅度大的細(xì)胞群[5]，因而為了準(zhǔn)確地了解運(yùn)動(dòng)機(jī)體細(xì)胞免疫的變化及免疫系統(tǒng)的功能狀況，通常需要監(jiān)測(cè)運(yùn)動(dòng)過(guò)程中NK細(xì)胞的活性及數(shù)量[6-7].

NK細(xì)胞的檢測(cè)方法有細(xì)胞活性的測(cè)定和細(xì)胞數(shù)量的測(cè)定.放射性核素釋放法、四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT) 微量酶反應(yīng)比色法、乳酸脫氫酶釋放法等[8-10]都是細(xì)胞活性常用的檢測(cè)方法.放射性核素釋放法較為經(jīng)典的是采用51Cr釋放法檢測(cè)人體NK細(xì)胞活性，但其缺點(diǎn)是存在放射性污染.NK細(xì)胞活性也可用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，其優(yōu)點(diǎn)是能夠在單細(xì)胞水平上進(jìn)行分析，敏感性較強(qiáng).張嘉等[11]通過(guò)構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的K562細(xì)胞株，作為靶細(xì)胞株，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，認(rèn)為該檢測(cè)快速、穩(wěn)定、準(zhǔn)確，可作為NK細(xì)胞活性檢測(cè)的一種新方法.NK細(xì)胞的數(shù)量檢測(cè)較多地采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè).

2)自然殺傷T細(xì)胞(natural killer T cells，NKT)是Budd等[12]在1987年首次報(bào)道的，之后的研究表明,NKT是不同于T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞的另一類細(xì)胞群，兼具NK細(xì)胞和T細(xì)胞特征的免疫細(xì)胞.臨床研究發(fā)現(xiàn)，NKT細(xì)胞參與了機(jī)體的免疫反應(yīng)和免疫防御，在抑制自身免疫性疾病、抗腫瘤和克服器官移植排斥等方面都發(fā)揮了免疫保護(hù)作用[13-14].運(yùn)動(dòng)免疫的研究也發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)中NKT會(huì)出現(xiàn)明顯的變化，是能夠較好地反映機(jī)體免疫功能狀況的敏感指標(biāo)[15].

NKT的檢測(cè)同樣可采用細(xì)胞活性的測(cè)定和細(xì)胞含量的測(cè)定.51Cr釋放法、MTT法可用于細(xì)胞毒活性的檢測(cè)，細(xì)胞毒活性的殺傷效應(yīng)也可用雙標(biāo)記細(xì)胞毒法、細(xì)胞光掃描法等進(jìn)行測(cè)定.NKT細(xì)胞含量的測(cè)定較多的是選用流式細(xì)胞儀和克隆定量進(jìn)行檢測(cè)的[16].流式細(xì)胞儀與克隆定量相比較，顯得更為簡(jiǎn)單、方便.

1.3 樹突狀細(xì)胞的檢測(cè)

自1973年Steimant等[17]首次報(bào)道樹突狀細(xì)胞(DC)以來(lái)，DC已被認(rèn)為是目前已知的功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，在細(xì)胞免疫和體液免疫的調(diào)控中起到了重要的作用.由于DC參與抗原的識(shí)別、加工處理和提呈，因而,DC的研究頗受免疫學(xué)界的矚目.盡管目前運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)界對(duì)DC的研究較少，但是由于DC具有啟動(dòng)初使免疫應(yīng)答的獨(dú)特功能，因此，在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中,檢測(cè)DC的改變對(duì)于尋找運(yùn)動(dòng)性免疫抑制的敏感指標(biāo)可能提供了一條新的線索.

外周血液中DC1及DC2細(xì)胞的檢測(cè)通常采用熒光抗體標(biāo)記和流式細(xì)胞術(shù).流式細(xì)胞儀檢測(cè)可直接定量DC數(shù)量和百分率，并具有快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏等特點(diǎn).傳統(tǒng)的檢測(cè)方法主要是通過(guò)密度梯度離心、培養(yǎng)、和(或)陰性選擇富集后的DC細(xì)胞，費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，不能夠準(zhǔn)確反映DC在體內(nèi)的真實(shí)特性.

2 免疫分子的檢測(cè)

2.1 細(xì)胞因子的檢測(cè)

機(jī)體功能在正常狀態(tài)下，Th1和Th2細(xì)胞(輔助性T細(xì)胞,helper T cell，簡(jiǎn)稱Th細(xì)胞)處于動(dòng)態(tài)平衡，維持著細(xì)胞免疫和體液免疫的正常功能狀態(tài).隨著對(duì)運(yùn)動(dòng)免疫研究的深入，許多學(xué)者認(rèn)為Th1/Th2淋巴細(xì)胞失衡與運(yùn)動(dòng)免疫抑制有密切關(guān)系.由于Th1和Th2細(xì)胞的表面標(biāo)志物無(wú)法區(qū)分，只能通過(guò)細(xì)胞亞群所分泌的細(xì)胞因子的不同，對(duì)Th1和Th2細(xì)胞進(jìn)行間接測(cè)定.

細(xì)胞因子的檢測(cè)[18-19]主要包括細(xì)胞生物學(xué)檢測(cè)法、免疫學(xué)檢測(cè)法及分子生物學(xué)檢測(cè)法.

1)生物學(xué)檢測(cè)法又稱生物活性檢測(cè)法.根據(jù)細(xì)胞因子具有的不同活性，對(duì)其進(jìn)行檢測(cè).生物活性檢測(cè)法有細(xì)胞增殖法、靶細(xì)胞殺傷法、細(xì)胞因子誘導(dǎo)的產(chǎn)物分析法等.該檢測(cè)法敏感性較高，但特異性較差、操作煩瑣、易受干擾.

2)免疫學(xué)檢測(cè)法是根據(jù)細(xì)胞因子的抗原性與相應(yīng)的特異性抗體結(jié)合的特性，通過(guò)免疫學(xué)技術(shù)如同位素、熒光或酶標(biāo)記技術(shù)測(cè)定細(xì)胞因子的含量.有放射免疫測(cè)定法、免疫熒光法、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(ELISPOT)、流式細(xì)胞術(shù)等.

目前使用較多的是ELISA法，其優(yōu)點(diǎn)是特異、方便、易標(biāo)準(zhǔn)化和批量化，很適合臨床應(yīng)用.其缺點(diǎn)是敏感性較低.隨著研究技術(shù)的進(jìn)步，ELISPOT已應(yīng)用到細(xì)胞因子的檢測(cè)中，它可以從單細(xì)胞水平觀察細(xì)胞因子的表達(dá).ELISPOT比ELISA具有更高的靈敏度，更為高效、簡(jiǎn)單、快捷.

流式細(xì)胞術(shù)和ELISPOT技術(shù)均是胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè)的理想手段.流式細(xì)胞術(shù)能快速、簡(jiǎn)單地進(jìn)行單細(xì)胞水平細(xì)胞因子的檢測(cè)，同時(shí)還能較精確地判斷不同分泌特性的細(xì)胞亞群.流式細(xì)胞術(shù)和ELISPOT技術(shù)已在運(yùn)動(dòng)免疫的研究中得到較為廣泛的認(rèn)可和應(yīng)用.

3)分子生物學(xué)檢測(cè)方法測(cè)定的并非細(xì)胞因子本身，而是利用細(xì)胞因子的基因探針檢測(cè)特定細(xì)胞因子基因表達(dá)的技術(shù).通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)法(PCR)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)或熒光定量PCR方法，可對(duì)細(xì)胞因子的DNA或RNA進(jìn)行檢測(cè).PCR技術(shù)是用于體外放大擴(kuò)增特定的DNA片段以獲得大量拷貝數(shù)的分子生物學(xué)技術(shù).PCR技術(shù)從1985年問(wèn)世以來(lái)，就得到了普遍的關(guān)注和應(yīng)用.20世紀(jì)90年代中期發(fā)展起來(lái)的RT-PCR技術(shù)，是從定性到定量的飛躍，被認(rèn)為是一種重復(fù)性好、靈敏性和準(zhǔn)確性都很高的檢測(cè)方法[20-21].RT-PCR的出現(xiàn)，毫無(wú)疑問(wèn)地成為了檢測(cè)基因表達(dá)量的最適合方法.上海體育學(xué)院人體運(yùn)動(dòng)科學(xué)研究人員探索了絕對(duì)定量的實(shí)時(shí)熒光PCR細(xì)胞因子mRNA檢測(cè)方法，該方法可檢測(cè)外周血白細(xì)胞γ-干擾素、白細(xì)胞介素-2、白細(xì)胞介素-4和白細(xì)胞介素-10等細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)量，由于它不需要對(duì)免疫細(xì)胞進(jìn)行刺激，因而可反映生理狀態(tài)下機(jī)體的免疫機(jī)能[22].在運(yùn)動(dòng)免疫的研究中，運(yùn)用絕對(duì)定量的實(shí)時(shí)熒光PCR細(xì)胞因子mRNA檢測(cè)，能夠較早地從mRNA水平檢測(cè)到外周血細(xì)胞自發(fā)性細(xì)胞因子的表達(dá)，在某種程度上可以認(rèn)為更具有前瞻性和敏感性.

2.2 免疫球蛋白的檢測(cè)

免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)屬免疫活性分子，指存在于血漿中的一類具有抗體活性的或化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗體相似的球蛋白.主要參與機(jī)體的體液免疫，在免疫防御、免疫自穩(wěn)、免疫監(jiān)控中發(fā)揮作用.檢測(cè)運(yùn)動(dòng)中免疫球蛋白IgG,IgA,IgM等變化,可反映運(yùn)動(dòng)機(jī)體的體液免疫狀況.

免疫球蛋白的檢測(cè)方法有單向擴(kuò)散法、免疫濁度法(透射濁度法、散射濁度法)、免疫電泳法和酶聯(lián)免疫吸附法等.單向擴(kuò)散法、免疫電泳法操作簡(jiǎn)便，但準(zhǔn)確性較差.免疫濁度法是免疫定量檢測(cè)的一大進(jìn)步，它是將免疫沉淀反應(yīng)與現(xiàn)代光學(xué)測(cè)量?jī)x器、自動(dòng)化檢測(cè)系統(tǒng)相結(jié)合所進(jìn)行的定量檢測(cè)方法，具有快速、精確等特點(diǎn)，能夠檢測(cè)微量蛋白和超微量生物活性物質(zhì)，已普遍應(yīng)用于免疫球蛋白的檢測(cè)中.

3 結(jié) 語(yǔ)

隨著運(yùn)動(dòng)免疫檢測(cè)方法的日趨深入，尤其是生物技術(shù)在運(yùn)動(dòng)免疫研究中的不斷拓展，我們有理由相信，會(huì)有更多新的、有效的免疫學(xué)研究方法運(yùn)用于運(yùn)動(dòng)免疫的研究中，筆者將從更深層次上理解固有免疫和適應(yīng)性免疫、免疫細(xì)胞和免疫分子間的內(nèi)在聯(lián)系，運(yùn)動(dòng)所致的免疫機(jī)能變化及運(yùn)動(dòng)免疫抑制的機(jī)制將得到更進(jìn)一步地闡明.

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(責(zé)任編輯 杜利民)

Research progress on detection methods of sports immunology

WANG Tian

(HangzhouCollegeofPreschoolTeacherEducation,ZhejiangNormalUniversity,Hangzhou310012,China)

With the development of biotechnology, an increasing number of high technologies and methods had been used in research on sports immunology. By using literature method, it was discussed in detail on detection methods of cellular immunology and immune molecules, compared and analyzed different detection methods, provided methodology basis for sports immunology, and made reference for determining and identifying phenomena and mechanisms of sports immunosuppression through more effective research methods.

sports immunology; detection; methods; immune cells; cytokines

10.16218/j.issn.1001-5051.2016.04.019

2016-08-16；

2016-09-15

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30671012)

王 恬(1961-)，女，浙江金華人，教授，博士.研究方向:運(yùn)動(dòng)生理學(xué);運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué).

G804.2;G804.5

A

1001-5051(2016)04-0471-04