郭巖乳，曾繁光，姚景春，孫 蓉，劉兆華

（1.山東大學(xué)藥學(xué)院新藥評(píng)價(jià)中心，山東濟(jì)南 250012；2.魯南制藥集團(tuán)股份有限公司，山東臨沂273400；3.山東省中醫(yī)研究院，山東濟(jì)南 250014）

人免疫系統(tǒng)重建NPG小鼠不能誘發(fā)直接腘窩淋巴結(jié)試驗(yàn)陽性反應(yīng)

郭巖乳1，曾繁光1，姚景春2，孫 蓉3，劉兆華1

（1.山東大學(xué)藥學(xué)院新藥評(píng)價(jià)中心，山東濟(jì)南 250012；2.魯南制藥集團(tuán)股份有限公司，山東臨沂273400；3.山東省中醫(yī)研究院，山東濟(jì)南 250014）

目的 觀察陽性藥物D-鹽酸青霉胺（D-pen）和鏈脲佐菌素（STZ）誘發(fā)的人免疫系統(tǒng)重建NPG（hu-NPG）小鼠的直接腘窩淋巴結(jié)試驗(yàn)（d-PLNA）反應(yīng)，并比較其與NPG和BALB/c小鼠反應(yīng)的異同，探索可提高藥物超敏反應(yīng)預(yù)測價(jià)值的模型動(dòng)物。方法 雌性NPG小鼠，1.8 Gy的X線輻照后，植入人臍血造血干細(xì)胞，制備hu-NPG小鼠，取外周血，進(jìn)行淋巴細(xì)胞表型分析及淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。hu-NPG，NPG和BALB/c小鼠各10只，每種小鼠隨機(jī)分成D-pen和STZ組，每組5只。各組分別在右后肢足趾部sc給予D-pen每只1 mg或STZ 0.75 mg，左后肢不做處理作為對(duì)照。注射后7 d處死小鼠，取左、右側(cè)腘窩淋巴結(jié)稱重，計(jì)算質(zhì)量指數(shù)；將淋巴結(jié)制成單細(xì)胞懸液，計(jì)算細(xì)胞指數(shù)，并對(duì)部分淋巴結(jié)進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，以比較d-PLNA反應(yīng)。結(jié)果 注射陽性藥物D-pen和STZ后，各組小鼠一般狀態(tài)良好，均未見全身毒性，且至處死時(shí)局部炎性刺激癥狀消失。D-pen和STZ均能誘導(dǎo)BALB/c小鼠出現(xiàn)典型的d-PLNA陽性反應(yīng)，表現(xiàn)為注射側(cè)淋巴結(jié)質(zhì)量和細(xì)胞數(shù)量比對(duì)照側(cè)增加，平均質(zhì)量指數(shù)≥2或平均細(xì)胞指數(shù)≥5。而NPG小鼠和hu-NPG小鼠均未出現(xiàn)陽性反應(yīng)。病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，NPG和hu-NPG小鼠的腘窩淋巴結(jié)體積明顯小于BALB/c小鼠，發(fā)育不完善。淋巴細(xì)胞表型分析發(fā)現(xiàn)，NPG小鼠僅有少量淋巴細(xì)胞，而hu-NPG小鼠外周血中人源性淋巴細(xì)胞以CD45+CD19+的B細(xì)胞為主，CD45+CD3+T細(xì)胞較少，且絲裂原不能刺激NPG和hu-NPG小鼠體內(nèi)的人源或鼠源性淋巴細(xì)胞增殖。結(jié)論 D-pen和STZ所致的小鼠d-PLNA陽性反應(yīng)依賴于體內(nèi)正常的淋巴細(xì)胞數(shù)量及功能。NPG小鼠缺乏正常淋巴細(xì)胞，d-PLNA反應(yīng)陰性。hu-NPG小鼠體內(nèi)的人淋巴細(xì)胞功能不全，也不能誘發(fā)陽性反應(yīng)。因此，hu-NPG小鼠尚不能成為d-PLNA的敏感動(dòng)物。

藥物超敏反應(yīng)；直接腘窩淋巴結(jié)試驗(yàn)；人源化小鼠

藥物超敏反應(yīng)（drug hypersensitivity reaction，DHR）是藥物正常使用過程中出現(xiàn)的一種免疫激活性病理綜合征。該綜合征與藥物的藥理作用無直接關(guān)系，常在治療劑量下產(chǎn)生且無劑量依賴性，即具有B型藥物不良反應(yīng)的特征［1-2］。它的臨床表現(xiàn)和癥狀與多種疾病相似，缺乏有效的診斷方法，極易被誤診或漏診［3-4］；DHR可通過免疫或非免疫機(jī)制介導(dǎo)發(fā)生，同時(shí)還易受多種因素影響，這種復(fù)雜性致使目前尚無有效的臨床前評(píng)價(jià)方法準(zhǔn)確預(yù)測其發(fā)生，使之成為臨床用藥及藥物研發(fā)的瓶頸而廣受重視［5-6］。準(zhǔn)確預(yù)測DHR發(fā)生以及發(fā)現(xiàn)特異性診斷生物標(biāo)志物，需要新的評(píng)價(jià)模型。腘窩淋巴結(jié)試驗(yàn)（popliteal lymph node assay，PLNA）是一種預(yù)測小分子藥物致敏潛能的常用模型，盡管其機(jī)制不清，但目前被認(rèn)為是唯一可靠的有效模型。本實(shí)驗(yàn)室已成功構(gòu)建了小鼠的PLNA模型，并用于探索了中藥注射劑的致敏性［7-8］。但因動(dòng)物和人之間存在著種屬差異，妨礙了實(shí)驗(yàn)結(jié)果外推至臨床。本研究用人免疫系統(tǒng)重建NPG小鼠（humanized NPG mice with a reconstituted immune system，hu-NPG小鼠）復(fù)制直接PLNA（direct PLNA，d-PLNA）模型，比較其與NPG和BALB/c小鼠反應(yīng)的異同，探索尋找能消除種屬差異、提高DHR預(yù)測值的敏感動(dòng)物。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、藥品、試劑和儀器

8周齡雌性NPG小鼠，體質(zhì)量22 ～24 g，購自北京維通達(dá)生物技術(shù)有限公司，質(zhì)量合格證號(hào)：11806300000184；BALB/c小鼠，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001。D-鹽酸青霉胺（D-penicil?lamine hydrochloride，D-pen），美國Mp Biomedi?cals公司，批號(hào)151806；鏈脲佐菌素（streptozoto?cin，STZ）（批號(hào)S0130）、植物血凝素（phytohae?magglutinin，PHA）（批號(hào)L1668）和脂多糖（lipo?polysaccarides，LPS）（批號(hào)L4391），美國Sigma公司；PANSORBIN?細(xì)胞〔金黃色葡萄球菌細(xì)胞（Staphylococcus aureus cells，SAC）〕（批號(hào)507858），美國Millipore公司；抗小鼠流式檢測抗體：APC-CD45（103112），F(xiàn)ITC-CD3（100203），APC-B220（103311），APC-CD4（100411）和PE/ Cy5-CD8a（100709）為美國Biolegend產(chǎn)品；抗人流式檢測抗體：FITC-CD45（555482），PE-CD19（555413），F(xiàn)ITC-CD3（347344），APC-CD4（317415）和PE-CD8a（340046）為美國BD Biosciences產(chǎn)品；部分人臍帶血由濟(jì)南賽爾生物科技有限公司惠贈(zèng)。AB135-S型分析天平，瑞士梅特勒公司；Minispin型離 心機(jī) ，德 國 Appendorf公司 ；CYT-1000型細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，美國CytoreconTM公司；RS2000型X-ray生物學(xué)輻照儀，美國Rad Source公司。

1.2 hu-NPG小鼠的構(gòu)建和篩選

取采集好的人臍帶血樣品，分別用無菌PBS溶液稀釋2倍，緩慢加入預(yù)裝15 mL淋巴細(xì)胞分離液的離心管液面上，室溫下500×g離心25 min；收集單個(gè)核細(xì)胞富集的液體；加PBS洗滌1次，再用含0.1%BSA的PBS（BSA-PBS）離心洗滌1次后計(jì)數(shù)。按每2×108細(xì)胞加BSA-PBS 300 μL、阻斷液100 μL和CD34抗體磁珠100 μL，4 ～8℃保溫30 min，期間不斷搖動(dòng)混勻，PBS洗滌，離心。每2×108標(biāo)記的單個(gè)核細(xì)胞加入BSA-PBS 0.5 mL使分散成為單細(xì)胞懸液。將液體加入置于磁架上的預(yù)濕磁珠分離柱內(nèi)，待液體不再滴落后，用BSA-PBS 0.5 mL洗脫3次。將分離柱從磁鐵上取下，放在離心管中，加BSA-PBS 1.0 mL以筒芯推出，收集并計(jì)數(shù)細(xì)胞，備用。

取NPG小鼠35只，X-ray生物學(xué)輻照儀照射1.8 Gy。小鼠輻照處理后4 ～24 h內(nèi)，ip給予三溴乙醇（tribromethanol，Avertin）溶液20 mL·kg-1麻醉。用1 mL精細(xì)刻度胰島素注射器先在小鼠膝關(guān)節(jié)股骨面向骨髓腔鉆孔，然后用另一只相同規(guī)格注射器吸取20 μL上述制備的細(xì)胞懸浮液，從孔內(nèi)把人臍帶血CD34+細(xì)胞注射植入骨髓腔內(nèi)（每鼠1× 105細(xì)胞）。小鼠蘇醒后放回籠內(nèi)，在SPF環(huán)境下飼養(yǎng)，觀察并記錄小鼠的一般狀態(tài)。

照射處理的NPG小鼠移植人CD34+細(xì)胞12周，采血約50 μL放入肝素抗凝的1.5 mL離心管中，分別加入不同熒光標(biāo)記的抗小鼠或抗人的流式抗體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。利用BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測分析。以有核細(xì)胞群設(shè)門，分析小鼠外周血中人CD45+細(xì)胞占有核細(xì)胞的比例。選擇人CD45+細(xì)胞>20%的hu-NPG小鼠進(jìn)行d-PLNA。

1.3 直接腘窩淋巴結(jié)試驗(yàn)

NPG，hu-NPG和BALB/c小鼠各10只，每種小鼠均隨機(jī)分為D-pen和STZ組，每組5只，共6組。每組小鼠右后肢足趾部以75%乙醇消毒，用胰島素注射器分別皮下注射陽性藥物D-pen每只1 mg或STZ每只0.75 mg，給藥體積為50 μL，以0.9%生理鹽水為溶媒，左側(cè)不做處理。給藥后記錄小鼠一般狀態(tài)，用數(shù)顯游標(biāo)卡尺測量足趾厚度。給藥后7 d，頸椎脫臼法處死小鼠；迅速取出左、右側(cè)腘窩淋巴結(jié)（popliteal lymph node，PLN），放入置于冰上盛有1%BSA-PBS的培養(yǎng)皿中，去除脂肪組織，吸干水分，稱重。制備單細(xì)胞懸液。計(jì)算淋巴結(jié)質(zhì)量指數(shù)（mass index，MI）和細(xì)胞指數(shù)（cellularity index，CI）。MI=右側(cè)PLN質(zhì)量/左側(cè)PLN質(zhì)量，CI=右側(cè)PLN細(xì)胞計(jì)數(shù)/左側(cè)PLN細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.4 流式檢測外周血淋巴細(xì)胞增殖

照射處理的NPG小鼠移植人CD34+細(xì)胞12周，取肝素抗凝血約100 μL，加入PBS 1 mL，離心去上清，加入紅細(xì)胞裂解液0.6 mL，作用10 min。加入0.6 mL沖洗液離心去上清；PBS洗滌1次。用1 mL含5 μmol·L-1CFSE熒光染料的PBS懸浮細(xì)胞，室溫避光15 min。用10 mL PBS洗滌1次。以5 mL含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞；37℃溫育30 min。培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞1次，調(diào)細(xì)胞密度為1×109L-1。每孔加入100 μL。每份樣品接種3孔。一孔加入100 μL培養(yǎng)液稀釋的PHA，終濃度為5 mg·L-1；一孔加入100 μL培養(yǎng)液稀釋的0.01% PANSORBIN?細(xì)胞，終濃度為0.005%；另一空孔加入100 μL培養(yǎng)液作為空白對(duì)照。37℃，5%CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育72 h；收集細(xì)胞，加入抗CD45或CD19流式抗體，BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測分析人CD45+細(xì)胞在PHA刺激下有無CFSE熒光強(qiáng)度的倍減，及人CD19+B細(xì)胞在SAC刺激下有無CFSE熒光強(qiáng)度的倍減，計(jì)算熒光強(qiáng)度倍減細(xì)胞的比例。同樣檢測BALB/c和空白NPG小鼠外周血的淋巴細(xì)胞增殖，刺激B細(xì)胞的絲裂原為LPS 50 mg·L-1。

1.5 臟器系數(shù)和病理學(xué)檢查

各組小鼠均于給藥前和處死前稱量體質(zhì)量。給藥后每日用游標(biāo)卡尺測量足趾厚度。摘取心、肝、脾和腎等器官織稱重，計(jì)算臟器系數(shù)〔臟器濕重（g）/動(dòng)物體質(zhì)量（g）×100〕。組織病理學(xué)檢查時(shí)，標(biāo)本迅速投入4%中性多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋、手動(dòng)輪轉(zhuǎn)切片機(jī)制片，切片厚度3 μm，常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)果數(shù)據(jù)用x±s表示，采用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用t檢驗(yàn)。與對(duì)照側(cè)比較出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）且平均MI≥2或平均CI≥5時(shí)為PLNA反應(yīng)陽性。

2 結(jié)果

2.1 hu-NPG小鼠外周血淋巴細(xì)胞表型分析

35只NPG小鼠照射并移植人臍血來源的CD34+造血干細(xì)胞，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束存活率為85.7%（5只小鼠因照射死亡），存活小鼠的一般狀態(tài)良好。移植后12周，流式細(xì)胞術(shù)檢查可見26只小鼠外周血有核細(xì)胞中可見人CD45+陽性細(xì)胞，提示這些小鼠體內(nèi)不同程度地重建了人的免疫系統(tǒng)，其中10只小鼠人CD45+陽性細(xì)胞數(shù)>20%（29.8±4.7）%，達(dá)到本研究預(yù)定的hu-NPG小鼠標(biāo)準(zhǔn)。

10只hu-NPG小鼠外周血人源和鼠源T、B淋巴細(xì)胞表型分析發(fā)現(xiàn)，人的淋巴細(xì)胞以CD45+CD19+的B細(xì)胞為主，約為（75.5±6.6）%，CD45+CD3+T細(xì)胞占（17.1±6.6）%，其中CD45+CD3+CD4+T細(xì)胞為（11.6±3.7）%和CD45+CD3+CD8+T為細(xì)胞（5.5±3.1）%，即人T細(xì)胞的比例僅為hu-NPG小鼠外周血有核細(xì)胞總數(shù)的（5.0±1.7）%。同時(shí)，hu-NPG小鼠體內(nèi)也含有少量的鼠源性CD3+T和B220+B細(xì)胞，二者占有核細(xì)胞的比例分別約為（3.6±2.7）%和（0.1±0.2）%，這與NPG小鼠體內(nèi)鼠源性CD3+T（2.34±0.49）%和B220+B（0.40± 0.28）%占有核細(xì)胞的比例基本接近，但顯著低于BALB/c小鼠（P<0.01）（圖1）。

2.2 d-PLNA小鼠一般狀態(tài)、臟器系數(shù)、組織病理和足趾厚度的變化

表1數(shù)據(jù)顯示，足趾部sc給予兩種陽性藥物后7 d，NPG，hu-NPG和BALB/c小鼠一般狀態(tài)良好。與給藥前比較，同種小鼠之間體質(zhì)量比較未見明顯改變，且其心、肝和腎的濕重及臟器系數(shù)組間未見明顯差異。但NPG和hu-NPG小鼠的脾系數(shù)明顯低于BALB/c小鼠（P<0.01），且hu-NPG小鼠的脾系數(shù)顯著高于NPG小鼠（P<0.01）。組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，NPG小鼠脾缺乏脾小體和動(dòng)脈周圍淋巴鞘，細(xì)胞密度明顯減少，白髓和紅髓分界模糊。盡管hu-NPG小鼠脾淋巴細(xì)胞數(shù)量比BALB/c小鼠少，但比NPG小鼠明顯增多，且有明顯的脾白髓重建形成（圖2）。

Fig.1 Phenotype analysis of human or mouse derived lymphocytes in peripheral blood from humanized NPG mice with reconstituted immune system（hu-NPG），NPG and BALB/c mice.

Tab.1 Effect of D-pen and STZ treatment on body mass and organ coefficient in different strains of mice

Fig.2 Histopathology of spleen in direct popliteal lymph node assay（d-PLNA）in different strains of mice.See Tab.1 for the mouse treatment.A：spleen of normal BALB/c mice；B：spleen of NPG mice，lack of white pulp;C：spleen of hu-NPG mice，reconstitution ofwhitepulp.WP：white pulp；RP：red pulp；MZ：marginal zone.The arrow indicates periarterial lymphatic sheath around the central artery.

給藥局部觀察顯示（圖3），各組給藥前足趾部厚度左、右后肢無顯著差異；給藥后前4 d，與對(duì)照側(cè)比較，給藥側(cè)足趾厚度明顯腫脹增厚（P<0.05，P<0.01），主要表現(xiàn)為局部急性炎癥反應(yīng)，且BALB/c小鼠右側(cè)測量數(shù)值明顯大于NPG或hu-NPG小鼠右側(cè)數(shù)值（P<0.01），隨時(shí)間延長，局部炎癥逐漸消退，至給藥后6 d時(shí)，給藥局部已基本恢復(fù)正常，與左側(cè)比較無顯著差異。

2.3 陽性藥物注射后的d-PLNA

Fig.3 Effect of STZ（A）and D-pen（B)on thickness of lateral hind foot pad in direct popliteal lymph node assay in different strains of mice.See Tab.1 for the mouse treatment.*P<0.05，**P<0.01，compared with control lateral hind foot pad.

陽性藥物D-pen和STZ注射后，BALB/c小鼠出現(xiàn)典型的d-PLNA陽性反應(yīng)，表現(xiàn)為與對(duì)照側(cè)比較，給藥側(cè)PLN體積明顯增大，質(zhì)量增加（P<0.05）且組平均MI≥2（表2）。細(xì)胞計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，陽性對(duì)照藥可致PLN細(xì)胞增生，數(shù)量增多，細(xì)胞大小不一致，PLN單細(xì)胞懸液中可見體積較大的轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞，給藥側(cè)淋巴結(jié)細(xì)胞數(shù)量比對(duì)照側(cè)顯著增多（P< 0.05），組平均CI≥5（表3，圖4）。顯微鏡觀察可見，未給藥側(cè)BALB/c小鼠PLN的皮質(zhì)、副皮質(zhì)區(qū)與髓質(zhì)界線清楚，不含或很少淋巴濾泡，無明顯生發(fā)中心；副皮質(zhì)區(qū)內(nèi)高內(nèi)皮小靜脈（high endothelial ven?ule，HEV）較小，內(nèi)皮低矮，腔內(nèi)幾乎不含細(xì)胞成分；髓質(zhì)不含或含有很少數(shù)量的組織細(xì)胞、小淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞和肥大細(xì)胞。與前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同，STZ或D-pen均可致BALB/c小鼠給藥側(cè)PLN淋巴濾泡數(shù)量增加，生發(fā)中心明顯，致使PLN表面呈凹凸不平狀；細(xì)胞密度和HEV橫斷面增多，HEV的上皮呈高柱狀凸入血管腔中，且腔內(nèi)含有較多的淋巴細(xì)胞（圖5A，B）。NPG及hu-NPG小鼠給藥側(cè)，對(duì)照側(cè)PLN未見差異，二者均體積較小，僅為正常BALB/c小鼠的約1/3，辨認(rèn)困難，易遺漏。鏡下檢查發(fā)現(xiàn)，PLN缺乏正常的組織結(jié)構(gòu)，皮髓質(zhì)分界不清且表面光滑，淋巴結(jié)發(fā)育不完善（圖4，圖5C）。提示D-pen和STZ不能誘導(dǎo)NPG及hu-NPG小鼠產(chǎn)生d-PLNA陽性反應(yīng)。

Tab.2 Average popliteal lymph node（PLN）mass index（MI）of different mice

Tab.3 Average PLN cellularity index（CI）of different mice

Fig.4 Volume and lymphocyte changes of PLN in d-PLNA in different strains of mice.A：the photos from left to right are 2 PLN of NPG mice treated with STZ，hu-NPG mice treated with STZ，BALB/c mice treated with D-pen and BALB/c mice treated with STZ，respectively.Upper：treated lateral PLN；lower：control lateral PLN.The arrow indicates enlarged treated lateral PLN with STZ in BALB/c mice.B：cell counting of control lateral PLN in BALB/c mice；C：cell counting of STZ treated lateral PLN in BALB/c mice.The arrow indicates enlarged lymphocyte.

Fig.5 Histopathology of PLN in direct popliteal lymph node assay in different strains of mice.GC：germinal center.A：STZ treated lateral PLN of BALB/c mice，positive PLNA responses；B：same lymph node as Fig.A，lymphoid follicle formation and high endothelial venule（HEV）increase（arrow）. There were obvious lymphocytes in HEV；C：STZ treated lateral PLN of hu-NPG mice，lack of lymphoid tissue.

2.4 絲裂原不能刺激NPG和hu-NPG小鼠外周血中人源或鼠源性淋巴細(xì)胞增殖

Fig.6 Lymphocyte transformation in hu-NPG mice. Lymphocytes were incubated with PHA 5 mg·L-1or 0.005% PANSORBIN?cells for 72 h.

Fig.7 Lymphocyte transformation in BALB/c mice and NPG mice.Lymphocytes were incubated with PHA 5 mg·L-1or LPS 50 mg·L-1for 72 h.

圖6結(jié)果顯示，hu-NPG小鼠的外周血人CD45+或CD19+單核細(xì)胞的CFSE熒光強(qiáng)度減弱，細(xì)胞的比例分別為（1.2±0.7）%和（0.5±0.3）%，與未加絲裂原刺激的細(xì)胞對(duì)照組比較未見顯著性差異（n=5），提示絲裂原未能刺激hu-NPG小鼠的外周血人源性淋巴細(xì)胞發(fā)生明顯增殖。圖7結(jié)果顯示，NPG小鼠外周血鼠源CD45+單核細(xì)胞的CFSE熒光強(qiáng)度減弱，細(xì)胞的比例分別為（1.3±0.6）%和（1.8±1.3）%，與未加絲裂原刺激的細(xì)胞對(duì)照組比較未見顯著性差異（n=5）。而BALB/c小鼠外周血鼠源性CD45+單核細(xì)胞與PHA或LPS共孵育72 h后，CFSE熒光強(qiáng)度減弱，細(xì)胞的比例分別為（2.9± 0.6）%和（12.4±1.8）%，與未加絲裂原刺激的對(duì)照組比較顯著增加（n=5，P<0.01），表明絲裂原可刺激BALB/c小鼠淋巴細(xì)胞產(chǎn)生明顯的增殖反應(yīng)。提示BALB/c小鼠體內(nèi)淋巴細(xì)胞功能正常，但NPG和hu-NPG小鼠外周血中無論是人源還是鼠源性淋巴細(xì)胞的功能均有缺陷。

3 討論

小分子藥物所致的DHR目前尚無公認(rèn)有效的預(yù)測方法。對(duì)于靜脈給藥的這些化合物，國際上通常應(yīng)用PLNA研究評(píng)價(jià)其致敏性潛能，被公認(rèn)為是目前唯一可靠的致敏性檢測方法［9］。根據(jù)給藥處理方式的不同，PLNA可分為d-PLNA、間接PLNA等多種類型。其中d-PLNA周期短，操作簡單，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與人臨床DHR間具有較好的一致性和可重復(fù)性，最有可能通過驗(yàn)證而廣泛用于全身給藥新藥的DHR篩選和研究。然而d-PLNA陽性反應(yīng)的機(jī)制不清楚，易產(chǎn)生假陰性結(jié)果，不易區(qū)分免疫機(jī)制介導(dǎo)的反應(yīng)和刺激性因素引起的炎癥反應(yīng)，妨礙了d-PLNA結(jié)果的外推至人。已證實(shí)，對(duì)氨基苯可誘導(dǎo)嚴(yán)重的DHR，卻不能誘發(fā)d-PLNA陽性反應(yīng)，而非致敏物丙酮或乙醇卻能誘導(dǎo)明顯的d-PLNA陽性反應(yīng)［10-14］。因此，d-PLNA作為常規(guī)評(píng)價(jià)方法還需要進(jìn)一步的發(fā)展和完善。近年來應(yīng)用人源化動(dòng)物對(duì)藥物進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的毒性測試取得了較大進(jìn)展［15-16］，但尚無人源化小鼠用于d-PLNA的報(bào)道。

NOD-PrkdcscidIl2rgnull小鼠由于突變基因而影響到自身淋巴細(xì)胞的分化和發(fā)育，但是其淋巴細(xì)胞發(fā)育微環(huán)境正常，成為目前國際公認(rèn)的免疫缺陷程度最高、最適合人源細(xì)胞移植的工具小鼠，為在小鼠體內(nèi)重建人的免疫系統(tǒng)和功能奠定了基礎(chǔ)［17］。NPG小鼠是北京維通達(dá)生物技術(shù)有限公司自主研發(fā)的同類小鼠。為了消除種屬差異，提高臨床前預(yù)測DHR的能力及闡明d-PLNA反應(yīng)機(jī)制，本研究將人臍血CD34+造血干細(xì)胞移植入照射后NPG小鼠體內(nèi)，以期在免疫缺陷小鼠體內(nèi)重建人的免疫系統(tǒng)和功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，接受人臍血移植的小鼠外周血中可檢測到人CD45+白細(xì)胞表型，且有人的B和T細(xì)胞分化，表明hu-NPG小鼠模型復(fù)制成功。但hu-NPG小鼠體內(nèi)的人源性細(xì)胞以B細(xì)胞為主，T細(xì)胞僅為少數(shù)（約5%）。而正常人外周血中以T為主，B細(xì)胞僅占淋巴細(xì)胞總數(shù)的10% ～20%，這種明顯差異提示hu-NPG小鼠重建的免疫系統(tǒng)與人的免疫系統(tǒng)之間存在較大差異。進(jìn)一步利用淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測hu-NPG小鼠體內(nèi)人源化T和B細(xì)胞的功能發(fā)現(xiàn)，PHA和SAC均不能誘導(dǎo)人源性細(xì)胞發(fā)生明顯增殖反應(yīng)，表明這些淋巴細(xì)胞盡管具有人淋巴細(xì)胞的表面標(biāo)志物，但免疫功能卻不完善，這可能與該小鼠缺乏主要組織相容性復(fù)合體分子，T細(xì)胞不能在胸腺選擇成熟有關(guān)［17］。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)NPG小鼠和hu-NPG小鼠的外周血內(nèi)含有少量鼠源性T和B細(xì)胞，但這些鼠源性T和B細(xì)胞也均不能對(duì)有絲分裂原刺激產(chǎn)生增殖反應(yīng)。上述結(jié)果表明hu-NPG小鼠的免疫功能不全。這與重建具有一定人免疫功能的人源化小鼠還需提供人淋巴細(xì)胞發(fā)育相關(guān)因子的文獻(xiàn)報(bào)道相一致［17-20］。鑒于缺乏有效免疫功能，提示hu-NPG小鼠不能對(duì)藥物產(chǎn)生特異性的免疫應(yīng)答反應(yīng)。

1981年Gleichmann等［21］首次將苯妥英注射入小鼠足趾部發(fā)現(xiàn)，PLN產(chǎn)生與移植物抗宿主反應(yīng)相似的病變，由此開始了PLNA在DHR研究中的應(yīng)用。不同實(shí)驗(yàn)室間已經(jīng)用PLNA檢測了130余個(gè)已知具有致敏性的小分子化合物，獲得了較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。PLNA以藥物在致敏誘導(dǎo)階段局部引流淋巴結(jié)細(xì)胞的增殖為觀察終點(diǎn)。因此，動(dòng)物的免疫功能或局部炎癥反應(yīng)可以影響PLNA反應(yīng)。前期我們已經(jīng)成功建立了BALB/c小鼠d-PLNA模型，并研究了中藥注射劑的致敏性［8，22-23］。本研究進(jìn)一步利用可致敏的陽性藥物在hu-NPG小鼠中復(fù)制d-PLNA模型，觀察比較其與NPG小鼠和BALB/c小鼠的反應(yīng)差異。分別以STZ和D-pen為陽性藥物，是因?yàn)樗鼈兛煞謩e誘導(dǎo)Th1和Th2型免疫反應(yīng)，利于進(jìn)一步利用報(bào)告抗原PLNA闡明藥物引起d-PLNA陽性反應(yīng)的發(fā)生機(jī)制［24-25］。研究結(jié)果顯示，BALB/c，NPG和hu-NPG小鼠足趾部注射陽性藥物后，小鼠一般狀態(tài)良好，給藥前后體質(zhì)量沒有明顯變化。盡管因年齡、種系差異，BALB/c，NPG和hu-NPG小鼠的體質(zhì)量有一定差異，但其心、肝、腎的臟器系數(shù)之間比較未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，結(jié)合病理組織學(xué)檢查未見異常，表明陽性藥物無全身毒性作用。給藥局部觀察顯示，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)局部炎癥反應(yīng)消失，足趾厚度恢復(fù)正常，表明本試驗(yàn)的陽性反應(yīng)與炎癥刺激無關(guān)，即所選的劑量不會(huì)產(chǎn)生明顯的局部刺激。上述結(jié)果表明，本研究的劑量和時(shí)間選擇符合d-PLNA要求。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，陽性藥物可引起B(yǎng)ALB/c小鼠產(chǎn)生顯著的d-PLNA反應(yīng)，但卻不能誘導(dǎo)NPG和hu-NPG小鼠產(chǎn)生陽性反應(yīng)。結(jié)合前述淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果，表明STZ和D-pen所致小鼠d-PLNA反應(yīng)與體內(nèi)淋巴細(xì)胞的數(shù)量和功能密切相關(guān)，缺少淋巴細(xì)胞或淋巴細(xì)胞功能不正常均不能誘導(dǎo)d-PLNA陽性反應(yīng)。故這種hu-NPG小鼠尚不適用于d-PLNA。最近有文獻(xiàn)報(bào)道，免疫缺陷小鼠同時(shí)移植人胚胎胸腺組織和肝組織或敲入人細(xì)胞因子基因可產(chǎn)生具有一定功能的T細(xì)胞，并可產(chǎn)生T細(xì)胞介導(dǎo)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)［17-18］，這為進(jìn)一步完善d-PLNA提供了新模型動(dòng)物。

實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，NPG和hu-NPG小鼠脾系數(shù)明顯低于BALB/c小鼠，且肉眼檢查可見NPG小鼠和hu-NPG小鼠的脾均顯著小于BALB/c小鼠。組織病理學(xué)檢查可見，NPG小鼠脾缺乏脾小體和動(dòng)脈周圍淋巴鞘，細(xì)胞密度明顯減少，白髓和紅髓分界模糊，這與這些小鼠的自身免疫系統(tǒng)功能缺陷有關(guān)。值得注意的是，hu-NPG小鼠的脾系數(shù)盡管低于正常BALB/c小鼠，但卻顯著大于NPG小鼠，脾細(xì)胞數(shù)量盡管比BALB/c小鼠少，但比NPG小鼠明顯增多，且有脾小體和動(dòng)脈周圍淋巴鞘形成?？紤]到NPG和hu-NPG小鼠淋巴結(jié)大小未見區(qū)別，提示hu-NPG小鼠脾的免疫結(jié)構(gòu)或功能重建比淋巴結(jié)重建更完善。事實(shí)上，已有一些實(shí)驗(yàn)證實(shí)免疫缺陷小鼠脾內(nèi)人造血細(xì)胞出現(xiàn)多系重建，可檢測到人CD45+，CD4+和CD8+表達(dá)細(xì)胞［18，20］。因?yàn)槠⒖梢哉J(rèn)為是靜脈給藥的引流淋巴結(jié)，靜脈給藥是否較易引起hu-NPG小鼠脾發(fā)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

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Positive reaction of direct popliteal lymph node assay isn′t induced in humanized NPG mice with reconstituted immune system

GUO Yan-ru1，ZENG Fan-guang1，YAO Jing-chun2，SUN Rong3，LIU Zhao-hua1
（Center for New Drug Evaluation School，of Pharmaceutical Sciences of Shandong University，Jinan 250012，China；2.Lunan Pharmaceutical Group Co.，Ltd.，Linyi 273400，China；3.Shandong Academy of Chinese Medicine，Jinan 250014，China）

OBJECTIVE To perform direct popliteal lymph node assay（d-PLNA）induced by D-penicillamine hydrochloride（D-pen）or streptozotocin（STZ）in humanized NPG（hu-NPG）mice with a reconstituted immune system，NPG mice and BALB/c mice respectively，and to compare the responses in these mice to elucidate the mechanism of d-PLNA.METHODS Female NPG mice were ir?radiated and transplanted with human hematopoietic stem cells isolated from cord blood to form hu-NPG mice.The number and function of peripheral blood lymphocytes in hu-NPG mice were detected by flow cytometry and lymphocyte proliferation test.The hu-NPG，NPG and BALB/c mice were randomly divided into D-pen group and STZ group（5 mice per group），respectively.Then，the positive chemical D-pen（1 mg per mouse）or STZ（0.75 mg per mouse）was injected subcutaneously into the right hind footpad of these mice using the established d-PLNA protocol.On the 7thday after injection，the mice were sacrificed.The bilateral popliteal lymph nodes（PLNs）were weighed.The difference of d-PLNA response was evaluated at 7 d after the injection of positive drugs.RESULTS All the NPG，hu-NPG and BALB/c mice behaved normally after the injection of positive drugs.No systemic toxicity was observed.The symptom of local irritation disappeared within 7 d.As in previous studies，the BALB/c mice showed a typical positive response of d-PLNA，as evidenced by the increase in both mass and cell count of the PLNs in the treated lateral（mass index>2 and cellularity index>5），while NPG mice and hu-NPG mice showed a negative resoponse.Pathological examinations demonstrated that the PLNs of NPG mice and hu-NPG mice had developmental defect in lymphoid tissue and were smaller in size than BALB/c mice.Phenotypic analysis of the peripheral blood lymphocytes in hu-NPG mice showed that the majority of human lymphocytes expressed B cell markers CD45+CD19+（75.5±6.6）%，and only about（17.1±6.6）%of the lymphocytes expressed T cell markers CD45+CD3+.There were few lymphocytes in NPG mice.In addition，these cells did not proliferate with mitogen stimulation in the lymphocyte proliferation test.CONCLUSION The d-PLNA reaction induced by D-pen or STZ in mice is closely related to the number and normal function of lymphocytesin vivo.Negative d-PLNA reaction results from a lack of normal lymphocytes in NPG mice or from defected human lymphocyte function in hu-NPG mice.Thus hu-NPG mice are currently not suitable for d-PLNA.

drug hypersensitivity reaction；direct popliteal lymph node assay；humanized mice

LIU Zhao-hua，E-mail：liuzhaohua@sdu.edu.cn，Tel：（0531）88382186

R967

A

1000-3002-（2016）08-0839-09

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.08.007

Foundation item：The project supported by Shandong Provincial Natural Science Foundation（ZR2012HM056）；and Shandong Provincial Independent Innovation and Transformation of Achievements Foundation（2014ZZCX02104）

2015-10-23接受日期：2016-07-15）

（本文編輯：齊春會(huì)）

山東省自然科學(xué)基金（ZR2012HM056）；山東省自主創(chuàng)新及成果轉(zhuǎn)化專項(xiàng)（2014ZZCX02104）

郭巖乳，女，碩士研究生，主要從事藥物免疫毒性研究；劉兆華，男，高級(jí)工程師，碩士生導(dǎo)師，主要從事藥物免疫毒性和毒性病理學(xué)研究。

劉兆華，E-mail：liuzhaohua@sdu.edu.cn，Tel：（0531）88382186