竭航，雷美艷，曾德軍，張承露,封孝蘭，余米

(重慶市藥物種植研究所藥用動物研究室，重慶408435)

動物藥是我國傳統(tǒng)中藥材重要的組成部分，具有顯效性、特需性、廣泛性、緊缺性等特點(diǎn)。隨著人們生活水平的提高和對健康關(guān)注的加強(qiáng)，動物藥越來越引起人們的重視。傳統(tǒng)的動物藥生產(chǎn)方式主要是獵殺野生藥用動物和人工養(yǎng)殖藥用動物。然而，過度獵殺造成了許多野生藥用動物數(shù)量急劇減少，如野生林麝資源量已經(jīng)下降了近90%，在10年～20年間，野生麝的數(shù)量將降到0.5～1.0萬頭[1，2]；另一方面，大多數(shù)藥用動物馴化程度很低，藥用動物的遺傳育種、營養(yǎng)飼料及疾病防疫等方面有諸多困難[3]，這使得動物藥的產(chǎn)量和質(zhì)量難以控制。因此，亟待開辟新的動物藥生產(chǎn)方法來滿足人民群眾對動物藥的需要。

經(jīng)過幾十年的發(fā)展，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)成為生物和醫(yī)學(xué)研究中廣泛采用的技術(shù)方法，本文就藥用植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物和部分藥用動物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)動物藥的成功經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行了總結(jié)，并對細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在動物藥生產(chǎn)中的應(yīng)用進(jìn)行了展望，以期為動物藥生產(chǎn)提供新的思路和理論基礎(chǔ)。

1　藥用植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的現(xiàn)狀

藥用植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物可在完全人工控制的條件下不間斷進(jìn)行生產(chǎn)，并不受地區(qū)和季節(jié)限制，還對珍稀瀕危藥用植物的保護(hù)起到非常重要的作用。藥用植物細(xì)胞培養(yǎng)用于生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物方面的研究已經(jīng)取得了長足的進(jìn)步[4，5]。研究者們在人參[6～8]、西洋參[9]、紫草[10，11]、紅豆杉[12～14]、雪蓮[15]、銀杏[16]、三七[17]等藥用植物細(xì)胞培養(yǎng)方面取得了可喜的成績。目前，實(shí)現(xiàn)藥用植物細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模化生產(chǎn)的有紫草細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫草素、紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇和紫衫烷、人參細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)人參皂苷。藥用植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的成功不僅緩解了市場對藥用植物的需求，保護(hù)了野生珍稀瀕危藥用植物資源的多樣性和生態(tài)環(huán)境，還為珍稀瀕危藥用動物、藥用真菌的生產(chǎn)提供了新的思路和發(fā)展方向。

2　藥用動物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)動物藥的嘗試

2.1　細(xì)胞培養(yǎng)在重組水蛭素生產(chǎn)中的應(yīng)用

水蛭素(Hirudin)是從醫(yī)用水蛭的唾液腺中提取分離得到的一種多肽，是迄今發(fā)現(xiàn)的活性最強(qiáng)的凝血酶抑制劑[18]。天然水蛭素產(chǎn)量極低，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床應(yīng)用的要求。1986年，Harvey[19]等人首次通過提取水蛭唾液腺RNA，克隆出水蛭素cDNA，并將該基因片段轉(zhuǎn)移至大腸桿菌中，通過對大腸桿菌的培養(yǎng)從而表達(dá)大量的水蛭素。從此以后，重組水蛭素的研究取得了很大的進(jìn)步，獲得了建立在酵母菌[20～22]、大腸桿菌[23～25]、枯草桿菌[26，27]甚至煙草[28]等多種載體上的重組水蛭素。經(jīng)過20余年的臨床試驗(yàn)[29～33]，重組水蛭素已經(jīng)被FDA批準(zhǔn)生產(chǎn)[34]，從而克服了天然水蛭素產(chǎn)量不足的劣勢。重組水蛭素的成功經(jīng)驗(yàn)，為通過細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)其他多肽類和蛋白類動物藥提供了理論基礎(chǔ)和方法指導(dǎo)。

2.2　麝鼠細(xì)胞培養(yǎng)研究進(jìn)展

麝鼠(Muskrat)又名青根貂，成年雄性麝鼠具有一對香腺囊，繁殖期在雄激素和雌激素的調(diào)控下分泌麝鼠香[35～37]。麝鼠香與林麝麝香類似，主要藥用成分為麝香酮、降麝香酮等，具有抗炎鎮(zhèn)痛[38，39]、活血[40，41]、耐缺氧[42，43]等療效，在醫(yī)藥化工等領(lǐng)域具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[44]，被吉林康乃爾藥業(yè)有限公司用于生產(chǎn)國家二類新藥復(fù)方制劑康心滴丸。目前，麝鼠香的生產(chǎn)主要是靠野生和人工飼養(yǎng)的麝鼠香囊中獲取，但產(chǎn)量較低，不能滿足市場需要。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所陳玉山等人對麝鼠的研究在全國前列，通過光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡對麝鼠香腺結(jié)構(gòu)的觀察表明，麝鼠香腺位于成年雄性麝鼠下腹部的腹肌與皮膚之間的陰囊兩側(cè)，由腺細(xì)胞、支持細(xì)胞和排香管組成，以頂漿分泌方式泌香[45，46]。在此基礎(chǔ)上，2007年，姜峰[47]等對麝鼠香腺上皮細(xì)胞進(jìn)行了體外培養(yǎng)的初步嘗試，結(jié)果表明，麝鼠腺上皮細(xì)胞可進(jìn)行傳代培養(yǎng)，也可用常規(guī)方法進(jìn)行冷凍保存和復(fù)蘇，體外培養(yǎng)傳代到第5代依然生長旺盛，細(xì)胞內(nèi)有豐富的脂滴。這說明，通過體外分離培養(yǎng)麝鼠香腺上皮細(xì)胞，建立香腺干細(xì)胞系，用細(xì)胞工程方法大量生產(chǎn)人工麝鼠香是可行的。而后，陳玉山[48]等通過體外培養(yǎng)麝鼠香腺上皮細(xì)胞的克隆和傳代，成功獲得了麝鼠香，在此基礎(chǔ)上申請了體外細(xì)胞分泌麝香的制備和分離工藝的專利，并采用GC-MS技術(shù)將體外細(xì)胞分泌麝鼠香與天然麝鼠香的化學(xué)成分進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，體外細(xì)胞分泌的麝鼠香其化學(xué)成分與自然分泌的麝鼠香相近，均含有環(huán)酮類、烷類、酯類、醛類和有機(jī)酸類成分[49]。這說明，體外細(xì)胞培養(yǎng)的麝鼠香一定程度上能替代天然麝鼠香甚至林麝麝香，在醫(yī)藥和香料領(lǐng)域發(fā)揮一定作用。麝鼠香腺細(xì)胞體外培養(yǎng)生產(chǎn)麝鼠香的成功為此類藥用動物(特別是林麝)細(xì)胞培養(yǎng)打下了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

2.3　細(xì)胞培養(yǎng)法生產(chǎn)王漿酸

王漿酸又名10-羥基-2-葵烯酸(10-Hydroxy-2-Decenoic酸，10-HDA)，由工蜂上顎腺分泌，是蜂王漿的主要活性成分之一和評價(jià)蜂王漿質(zhì)量的重要指標(biāo)，具有抗菌[50]、免疫調(diào)節(jié)[51]、抗腫瘤[52～55]等作用。但在蜂王漿中的含量極低，約為1.4%～2.0%[55]。為了解決天然蜂王漿中10-HDA無法滿足市場需求的問題，王騰飛[56]等從鮮王漿、蜂巢和蜂尸中篩選得到3株產(chǎn)王漿酸的菌株，并利用培養(yǎng)基法結(jié)合搖床培養(yǎng)法生產(chǎn)10-HDA，HPLC和GC-MS法檢測結(jié)果表示，篩選到1個菌株的10-HDA含量能達(dá)到0.25%。此外，王海燕[57]通過紫外線復(fù)合氯化鋰法誘變處理，篩選出1株分泌10-HDA相對較高且較穩(wěn)定的菌株Uv90s-29，在搖瓶培養(yǎng)條件的基礎(chǔ)上，還進(jìn)行了50L發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)，最高產(chǎn)量達(dá)到29.5342μg/mL。這說明，有些藥用動物所產(chǎn)動物藥，并不是藥用動物細(xì)胞所分泌，而是藥用動物體內(nèi)的某些微生物的發(fā)酵產(chǎn)物。分泌10-HDA菌株的成功篩選為藥用動物細(xì)胞培養(yǎng)大規(guī)模生產(chǎn)動物藥提供了新的思路和方法。

2.4　梅花鹿鹿茸細(xì)胞培養(yǎng)研究進(jìn)展

鹿茸為成年雄性梅花鹿和馬鹿等鹿科動物尚未骨化而帶有絨毛的幼角。鹿茸具有溫腎壯陽、益精補(bǔ)血、強(qiáng)筋健骨等功效。近年來研究表明，鹿茸多肽是鹿茸的主要藥效成分之一，具有極其重要的地位。翁梁[58]等報(bào)道了從馬鹿茸中新發(fā)現(xiàn)了一個3.2kDa的多肽，具有刺激鼠上皮細(xì)胞和兔肋軟骨細(xì)胞生長活性的功能。Guan[59]等人也從梅花鹿茸中分離得到了大小相近的一個同源多肽。但這并不能明確是單一成分起主要作用還是多種多肽成分協(xié)同作用的結(jié)果。因此，為了解決該問題，查恩輝[60]從采用Tricine-SDS-PAGE法和飛行質(zhì)譜法從新鮮梅花鹿茸中提取制備得到一個具有32個氨基酸的多肽鏈，并根據(jù)該多肽的氨基酸序列和大腸桿菌偏愛密碼子表，構(gòu)建原核表達(dá)載體，通過大腸桿菌體外培養(yǎng)產(chǎn)生大量目的多肽片段，并分離純化。藥理試驗(yàn)表明，重組多肽具有同天然目的多肽類似的修復(fù)皮膚損傷、上調(diào)NK細(xì)胞吞噬能力及上調(diào)IL-2、IL-12、IFN-gamma和IFN-alpha的功能。這說明細(xì)胞培養(yǎng)法生產(chǎn)的重組鹿茸多肽具有潛在的臨床組織修復(fù)藥的開發(fā)優(yōu)勢。雖然目前鹿茸生產(chǎn)主要依靠梅花鹿的飼養(yǎng)獲取，但通過細(xì)胞培養(yǎng)法生產(chǎn)重組鹿茸多肽的成功經(jīng)驗(yàn)為研究鹿茸藥用功能的機(jī)制提供了新的思路。此外，與重組水蛭素類似，重組鹿茸多肽也為細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)傳統(tǒng)動物藥提供了理論基礎(chǔ)和方法指導(dǎo)，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

3　問題與展望

3.1　存在的問題

3.1.1動物藥成分復(fù)雜目前，雖然部分動物藥的主要藥用成分已經(jīng)明確(如水蛭唾液腺中的水蛭素、林麝麝香中的麝香酮、斑蝥卵塊中的斑蝥素)，但動物藥種類繁多，其成品藥的成分也相當(dāng)復(fù)雜。動物藥的藥理作用常常是多種藥用成分之間的按照一定比例相互協(xié)調(diào)相互作用的結(jié)果，這給藥用動物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)動物藥帶來了不小的困難。

3.1.2大部分動物藥生成的機(jī)制尚不明確藥用動物生產(chǎn)動物藥的機(jī)制研究是中藥領(lǐng)域非常重要的一個環(huán)節(jié)。例如，水蛭素是由水蛭頭部唾液腺分泌的發(fā)現(xiàn)，為后來水蛭素基因的克隆和重組進(jìn)而進(jìn)行水蛭素的生產(chǎn)提供了基礎(chǔ)。除了水蛭素[19]、10-HDA[56]、鹿茸[61～63]等少數(shù)幾種動物藥的生成機(jī)制較明確以外，大部分動物藥的生成機(jī)制尚不夠深入。例如，對于最需要細(xì)胞培養(yǎng)的林麝來講，目前僅知道麝香由成年雄性林麝香腺分泌[3]，由于成熟的麝香呈耵聹狀，而初香液是乳白色液體，且初香液麝香酮的含量尚不得而知，在麝香的形成和成熟過程中是否存在微生物的發(fā)酵作用也需要進(jìn)一步探討。動物藥生成機(jī)制不明確，是目前藥用動物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)動物藥最大的不利因素。

3.1.3藥用動物目標(biāo)細(xì)胞難以獲取利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)動物藥的藥物動物恰恰也是資源量最少、極度瀕危的國家級野生保護(hù)藥用動物，此類動物常常具有馴化程度低、動物藥生成機(jī)制研究不深入等特點(diǎn)。我們以林麝為例，林麝野性強(qiáng)、馴化程度低，在采集林麝相關(guān)樣品時會對林麝造成強(qiáng)烈的應(yīng)激反應(yīng)，還會給實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性與穩(wěn)定性造成一定程度地影響。更重要的是，活體采集林麝香腺細(xì)胞時可能會導(dǎo)致林麝的死亡，因此，目前尚無研究者開展此類工作。藥用動物目標(biāo)細(xì)胞的難以獲取也在一定程度上制約著通過細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)動物藥技術(shù)的應(yīng)用。

3.1.4從實(shí)驗(yàn)室到臨床應(yīng)用之間存在較大差距雖然重組水蛭素已經(jīng)成功進(jìn)入市場[34]，但對絕大多數(shù)采用細(xì)胞培養(yǎng)法生產(chǎn)的動物藥而言，從實(shí)驗(yàn)室到臨床應(yīng)用之間存在著巨大的差距。主要原因有2點(diǎn)：1)臨床應(yīng)用之前，細(xì)胞培養(yǎng)法生產(chǎn)的動物藥必須經(jīng)過長期而嚴(yán)謹(jǐn)?shù)脑囼?yàn)對其理化特性、藥理作用、副作用、配伍和藥物安全性等進(jìn)行評估；2)現(xiàn)有動物藥已有幾千年的入藥歷史，已經(jīng)形成了一套較為完善合理的入藥體系，而細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)的動物藥在理化特性、藥理藥效方面都與傳統(tǒng)動物藥之間存在著較大差異。因此通過細(xì)胞培養(yǎng)的動物藥很難在短時間內(nèi)廣泛用于中醫(yī)臨床上。

3.2　展望

3.2.1珍稀瀕危藥用動物資源的急劇減少成為巨大的動力隨著經(jīng)濟(jì)社會的發(fā)展，人類活動對珍稀瀕危藥用動物棲息地造成大量破壞，加之人類對野生藥用動物的非法捕殺，在人工養(yǎng)殖野生藥用動物亦不能有效解決馴化和死亡問題的情況下，野生藥用動物數(shù)量急劇減少，這與人們對健康的越來越高的關(guān)注度和對動物藥的重視之間存在著巨大的矛盾。因此，亟待開辟新的動物藥生產(chǎn)方法來滿足人民群眾對動物藥的需要。

3.2.2現(xiàn)有成功經(jīng)驗(yàn)為藥用動物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)動物藥提供了技術(shù)指導(dǎo)現(xiàn)有藥用動物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)藥物的方法，歸結(jié)起來包括目標(biāo)細(xì)胞分離培養(yǎng)法[4，8，47]、目的基因克隆-基因重組-工程菌構(gòu)建法[19-27，60]和微生物直接發(fā)酵培養(yǎng)法[56，57]。雖然大部分藥用動物的動物藥生成機(jī)制尚不明確，但幾乎都可以參照上述3種方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。例如林麝泌香是個數(shù)量性狀，不適宜通過基因克隆-基因重組-工程菌構(gòu)建法來生產(chǎn)麝香，而林麝與麝鼠有類似的泌香過程，可以參照香腺細(xì)胞分離培養(yǎng)法來進(jìn)行。而對于某些藥用成分單一的多肽或蛋白則可以嘗試參照重組水蛭素的方法通過基因克隆-基因重組-工程菌構(gòu)建法來大量獲取蛇毒多肽。此外，上述3種方法的目標(biāo)產(chǎn)物分離提純技術(shù)也較成熟，為今后其他珍稀瀕危藥用動物的細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)動物藥提供了珍貴的技術(shù)指導(dǎo)。

3.2.3新技術(shù)的應(yīng)用將加快藥用動物細(xì)胞培養(yǎng)研究進(jìn)展近年來，中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展正方興未艾，特別是生物技術(shù)、基因工程、酶工程、細(xì)胞工程等高新技術(shù)的興起，如UPLC技術(shù)、GC-MS技術(shù)、飛行質(zhì)譜技術(shù)等，為動物藥的成分分析、藥用動物產(chǎn)藥機(jī)理等研究提供了良好的方法。這都會為藥用動物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)動物藥技術(shù)的發(fā)展打下有利的基礎(chǔ)。此外，隨著新的制藥技術(shù)的迅猛發(fā)展，將縮短細(xì)胞培養(yǎng)動物藥從實(shí)驗(yàn)室到臨床應(yīng)用之間的時間差。因此，隨著新技術(shù)的應(yīng)用，藥用動物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)動物藥將迎來新的發(fā)展階段。

綜上，雖然藥用動物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)動物藥已有近30年歷史，但發(fā)展非常緩慢，也存在著各種各樣的問題。但隨著人們對動物藥的逐漸重視和野生藥用動物資源量的日益減少以及國家對該領(lǐng)域的支持和先進(jìn)生產(chǎn)技術(shù)的應(yīng)用，藥用動物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)動物藥將會產(chǎn)生新的突破，為滿足人們對動物藥日益增長的需求和促進(jìn)我國中醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展做貢獻(xiàn)。

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