董玲玲,曹瑩, 于曉輝,王靜文,萬仁玲,顧進(jìn)華*

(1中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所 北京 100081；2 上海市獸藥飼料檢測所 上海 201103 )

HPLC-PDA聯(lián)合UPLC-Q/TOF法確證硫酸卡那霉素注射液中的非法添加物

董玲玲1,曹瑩2, 于曉輝1,王靜文1,萬仁玲1,顧進(jìn)華1*

(1中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所 北京 100081；2 上海市獸藥飼料檢測所 上海 201103 )

確證1批硫酸卡那霉素注射液中的非法添加物。在對該批樣品進(jìn)行非法添加物常規(guī)篩查時發(fā)現(xiàn)其含有未知色譜峰，且紫外光譜具有特征性，但與現(xiàn)有的紫外光譜庫進(jìn)行比對，無法確定該未知物的結(jié)構(gòu)。結(jié)合UPLC-Q-TOF法給出的未知物的分子量信息推導(dǎo)出疑似添加物，再用HPLC-PDA和UPLC-Q/TOF兩種方法進(jìn)行驗(yàn)證，最終確證非法添加物。結(jié)果顯示該批樣品中的非法添加物為尼可剎米。通過檢查該批樣品中的非法添加物，總結(jié)出確證非法添加物的一般模式，從而為獸藥處方外非法添加物的篩查與確證提供思路。

尼可剎米；非法添加

隨著國家對農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全的日益重視，農(nóng)業(yè)部對獸藥處方外非法添加的監(jiān)管與打擊力度也不斷加大，近年來發(fā)布了大量公告作為獸藥處方外非法添加物檢查的檢驗(yàn)依據(jù)，比較常見的是采用HPLC-PDA法，也有UPLC-MS方法[1-3]。但判斷獸藥制劑中是否存在非法添加,添加了何種藥物，一直以來都是工作中的難點(diǎn)。目前，本團(tuán)隊已建立了非法添加的常見化學(xué)藥物紫外光譜數(shù)據(jù)庫，能夠提供紫外光譜圖與保留時間等信息，是獸藥處方外非法添加物常規(guī)篩查的重要依據(jù)，但其存在一定的局限性，對于未收入光譜庫的化合物會有漏查的風(fēng)險。UPLC-Q-TOF MS法能提供精確分子量，在化合物確證方面應(yīng)用廣泛[4-5],但由于其昂貴的成本，較高的技術(shù)壁壘，再加上二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)龐大的信息量和易受分子量較小的化合物干擾的特點(diǎn)，該方法目前在獸藥處方外非法添加物的篩查領(lǐng)域應(yīng)用尚處于初級探索階段。本團(tuán)隊建立了部分化學(xué)藥物的一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，用于非法添加物的初篩。近日，在1批監(jiān)督抽檢樣品硫酸卡那霉素注射液中的處方外非法添加物檢查中，發(fā)現(xiàn)添加物，通過一級質(zhì)譜庫篩查，并結(jié)合紫外光譜特征，最終鎖定疑似添加物，再用HPLC-PDA法聯(lián)合UPLC-Q-TOF MS法進(jìn)行雙重確證。通過檢查該批樣品中的非法添加物，總結(jié)出確證非法添加物的一般模式，以期為獸藥處方外非法添加物的篩查與確證開辟出新的思路。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀(Waters e2695-2996)，配二極管陣列檢測器(PDA)；超高效液相色譜儀(Waters ACQUITY UPLC)-四極桿/飛行時間質(zhì)譜儀(Q/TOF MS，Waters Synapt HDMS)；XS205分析天平(Mettler Toledo)；資生堂?C18 4.6 mm×250 mm，5 μm；ACQUITY HSS T3色譜柱(1.7 μm，100 mm×2.1 mm)。甲醇為色譜純，購自Merck公司。尼可剎米，購自ACROS公司，純度99.9%，批號：A0344236。硫酸卡那霉素注射液為2016年度監(jiān)督抽檢樣品，批號20140101。

2 方法

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液 取供試品1.0 mL，置100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻；取1.0 mL，置10 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得UPLC-PDA初篩用供試品溶液；用乙腈-0.1%甲酸(10∶90)將上述溶液稀釋10倍，作為UPLC-Q/TOF MS初篩用供試品溶液；未知物HPLC-PDA驗(yàn)證用供試品溶液同初篩，未知物UPLC-Q/TOF MS驗(yàn)證用供試品溶液同UPLC-Q/TOF MS初篩。

2.1.2 對照品溶液 取尼可剎米對照品，加流動相使溶解并稀釋制成5 μg/mL的溶液，作為HPLC-PDA驗(yàn)證用對照品溶液；用乙腈-0.1%甲酸(10∶90)將上述溶液稀釋成50 ng/mL的溶液，作為UPLC-Q/TOF MS驗(yàn)證用對照品溶液。

2.2 試驗(yàn)條件

2.2.1 硫酸卡那霉素注射液 HPLC-PDA初篩：采用ACQUITY HSS T3色譜柱(1.7 μm，100 mm×2.1 mm)色譜柱，以甲醇(含0.01 mol/L醋酸銨)-0.01 mol/L醋酸銨為流動相，梯度洗脫(0～0.25 min，保持2%A；0.25～12.25 min，由2%A線性變化為99%A；12.25～13.0 min，由99%A線性變化為2%A，13.0～17.0 min，保持2%A)，流速0.25 mL/min。UPLC-PDA初篩采集波長范圍為210～400 nm。

2.2.2 硫酸卡那霉素注射液 UPLC-Q/TOF MS初篩：采用ACQUITY HSS T3(1.7 μm，100 mm×2.1 mm)色譜柱，流動相A為含0.1%甲酸的乙腈，B為0.1%甲酸，梯度洗脫(0～5 min，由20%A線性變化為95%A；5.0～6.0 min，由95%A線性變化為20%A)；流速0.45 mL/min；Q/TOF MS采用電噴霧正離子源(ESI+)，毛細(xì)管電壓3.0 kV，電離源溫度110 ℃，錐孔電壓為35 V，數(shù)據(jù)采集質(zhì)量范圍為50～1000 Da，二級質(zhì)譜(MS/MS)碰撞電壓為25 eV；采用甲酸鈉溶液進(jìn)行精確質(zhì)量校正，并用亮氨酸-腦啡肽溶液([M+H]+，m/z556.2 Da)進(jìn)行實(shí)時質(zhì)量鎖定。2.2.3 非法添加物HPLC-PDA驗(yàn)證 采用資生堂C18( 4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱。以水- 甲醇(70∶30)為流動相；流速1.0 mL/min。采集波長范圍為200～400 nm；記錄263 nm波長處的色譜圖。

2.2.4 非法添加物UPLC-Q/TOF MS驗(yàn)證 色譜柱及流動相同2.2.2項(xiàng)，流動相A:流動相B(20:80)；流速0.4 mL/min；Q/TOF MS參數(shù)同初篩，數(shù)據(jù)采集質(zhì)量范圍為50～800 Da。

3 結(jié)果與分析

3.1 非法添加物的發(fā)現(xiàn)和初步分析 在非法添加物常規(guī)篩查中發(fā)現(xiàn)有1批硫酸卡那霉素注射液有一未知色譜峰(tR=6.7 min)見圖1，且紫外光譜具有特征性，最大吸收波長為264.0 nm(圖2)。將該光譜圖與已建立的非法添加物光譜圖庫進(jìn)行比對，沒有查到疑似添加物。

遂對該批供試品進(jìn)行UPLC-Q/TOF MS初篩，采用電噴霧正離子源模式(ESI+)，全掃描范圍(100～1000 Da)，采集得到供試品的一級質(zhì)譜(MS)信息；在TIC圖(圖3)中，除卡那霉素峰(tR=0.41 min)外，還發(fā)現(xiàn)了另一明顯的色譜峰(tR=1.73 min)。從質(zhì)譜圖(圖4)中看出強(qiáng)度最高的m/z值為179.11 Da，將該值在已建立的一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行查找，查到疑似添加物6種，具體信息見表1。

圖1 供試品色譜圖

圖2 未知峰紫外光譜圖

圖3 供試品總離子流圖

圖4 供試品質(zhì)譜圖

編號化合物分子式峰類型m/z/Da紫外光譜吸收波長/nm?類別?1無水葡萄糖C6H12O6[M-H]-179．0556無營養(yǎng)藥2阿司匹林C9H8O4[M-H]-179．0344276解熱鎮(zhèn)痛、非甾體抗炎藥3氨茶堿C7H8N4O2[M-H]-179．0569275平滑肌松弛藥；利尿藥4茶堿C7H8N4O2[M-H]-179．0569271平滑肌松弛藥5丙硫異煙胺C9H12N2S[M-H]-179．0643291抗結(jié)核病藥6尼可剎米C10H14N2O[M+H]+179．1184263中樞興奮藥

*參見《中華人民共和國藥典》2015年版二部

UPLC-Q/TOF MS初篩時所用流動相含有0.1%甲酸，更易形成 [M+H]+峰，且未知峰的紫外光譜圖中最大吸收波長為264 nm，考慮到以上兩點(diǎn)，懷疑添加物為尼可剎米。尼可剎米結(jié)構(gòu)式見圖5，為酰胺類化合物，易發(fā)生酰胺鍵的斷裂，丟失N,N-二乙基碎片，形成二級碎片(C6H6NO+)，m/z108，進(jìn)一步佐證了猜想。繼而對添加物利用HPLC-PDA法和UPLC-Q/TOF MS法進(jìn)行驗(yàn)證。

圖5 尼可剎米結(jié)構(gòu)式

3.2 添加物驗(yàn)證3.2.1 HPLC-PDA 與對照品保留時間及紫

外光譜進(jìn)行比對，以及不同濃度本底添加試驗(yàn)峰純度檢查和光譜相似度檢查的方式對供試品中的未知物進(jìn)行驗(yàn)證。供試品在該試驗(yàn)條件下檢出1個未知色譜峰，其與該條件下尼可剎米對照品的保留時間一致，紫外光譜相似；同時，不同濃度(取對照品溶液與供試品溶液按1∶4、1∶1、4∶1 的比例混合)的本底添加試驗(yàn)峰純度檢查結(jié)果顯示：添加前后，供試品色譜圖相應(yīng)位置上色譜峰的純度角度小于純度閾值，為單一物質(zhì)峰；光譜相似度檢查結(jié)果顯示：添加前后，供試品色譜圖相應(yīng)位置上色譜峰的光譜匹配角度小于匹配閾值，與對照品的光譜相似。保留時間、紫外光譜驗(yàn)證結(jié)果及峰純度檢查、光譜相似度檢查結(jié)果見表2、表3。

表2 保留時間、紫外光譜驗(yàn)證結(jié)果表

表3 峰純度檢查與光譜相似度檢查結(jié)果表

3.2.2 UPLC-Q/TOF MS 采用UPLC-Q/TOF MS 驗(yàn)證試驗(yàn)條件，提取供試品與對照品在[M+H]+m/z179.01 Da的質(zhì)譜圖，采取與對照品保留時間、準(zhǔn)分子離子峰及碎片峰比對的方式對供試品中的非法添加物進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。在相同試驗(yàn)條件下，添加物的保留時間、準(zhǔn)分子離子峰及碎片離子峰與尼可剎米對照品完全一致，進(jìn)一步證明添加物為尼可剎米。結(jié)果見表4。

表4 UPLC-Q-TOF MS法驗(yàn)證結(jié)果

4 討論

4.1 確證非法添加物的一般模式 此次非法添加物的檢查過程中將UPLC-Q-TOF法和HPLC-PDA法結(jié)合起來，相互佐證，最大限度的提供非法添加物的信息，為非法添加物的確證提供了雙重保險。據(jù)此次尼可剎米的發(fā)現(xiàn)與確證過程，總結(jié)出獸藥非法添加物確證的一般模式：若供試品中發(fā)現(xiàn)添加物，采用HPLC-PDA法進(jìn)行初篩，將所得添加物的紫外光譜圖與已建立的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配，若匹配成功，找到疑似添加物，用HPLC-PDA法對添加物進(jìn)行確證；若匹配不成功，用UPLC-Q-TOF法采集添加物質(zhì)譜信息，分析準(zhǔn)分子離子峰并與已建立的一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配，同時根據(jù)所給出的質(zhì)譜信息推導(dǎo)結(jié)構(gòu)特征，找到疑似添加物，再建立UPLC-Q-TOF法或HPLC-PDA法對添加物進(jìn)行確證。

4.2 非法添加物篩查的合理性分析 在非法添加物篩查時不僅要依靠技術(shù)手段，也要講究“合情合理”。尼可剎米在獸醫(yī)臨床中用于解救呼吸中樞抑制，用于各種原因引起的呼吸中樞抑制，如中樞抑制藥中毒，疾病引起的中樞性呼吸抑制，新生仔畜窒息或加速麻醉動物的蘇醒等。硫酸卡那霉素為氨基糖苷類廣譜抗菌藥，臨床上用于治療敗血癥及泌尿道、呼吸道感染，也用于豬氣喘病[6]。從兩者的臨床應(yīng)用可以看出，在硫酸卡那霉素注射液中添加尼可剎米，是為了在治療呼吸道感染、氣喘病的同時興奮呼吸中樞，達(dá)到增強(qiáng)療效的目的；再者，尼可剎米合成簡單，價格低廉，這符合不良商家的利益訴求，因此存在添加的可能性。一切非法添加都不是盲目的，對目的性的分析看似不相干，實(shí)際很重要，這在確證非法添加物的時候可以幫助排除因之前檢測樣品的殘留而造成“假陽性”的結(jié)果。對非法添加物的篩查既要符合技術(shù)層面的推理也要符合邏輯規(guī)律。

5 展望

目前，獸藥制劑中非法添加物的篩查主要基于紫外光譜數(shù)據(jù)庫和質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，庫容量的大小直接影響到能否成功鎖定疑似添加物，若添加物信息未被收入數(shù)據(jù)庫中，則需要進(jìn)一步借助質(zhì)譜或核磁共振等波譜解析手段推導(dǎo)添加物的結(jié)構(gòu)，這將極大的增加篩查的難度。因此，筆者認(rèn)為應(yīng)該不斷擴(kuò)充兩個數(shù)據(jù)庫，增加庫容量；同時，篩查目標(biāo)不能僅囿于藥物，應(yīng)將防腐劑、增溶劑、穩(wěn)定劑等常用添加劑的信息也擴(kuò)充到數(shù)據(jù)庫里，避免假陽性結(jié)果。

[1] 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第1848 號.黃芪多糖注射液中非法添加解熱鎮(zhèn)痛類、抗病毒類、抗生素類、喹諾酮類等11 種化學(xué)藥物(物質(zhì))檢查方法和肥豬散、健胃散、銀翹散等中獸藥散劑中非法添加氟喹諾酮類化學(xué)藥物(物質(zhì))檢查方法[S].

[2] 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第2508號. 注射用青霉素鉀(鈉)中非法添加解熱鎮(zhèn)痛藥物檢查方法等11 個獸藥非法添加化學(xué)藥物(物質(zhì))檢查方法[S].

[3] 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第2320號. 魚腥草注射液中非法添加林可霉素檢查方法、魚腥草注射液中非法添加水楊酸氧氟沙星檢查方法和中藥散劑中非法添加金剛烷胺和金剛乙胺檢查方法等3項(xiàng)檢查方法標(biāo)準(zhǔn)[S].

[4] Ren Q, Wang Y L, Wang M L,etal. Screening and identification of the metabolites in rat urine and feces after oral administration of Lycopus lucidus Turcz extract by UHPLC-Q-TOF-MS mass spectrometry [J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 2016,1027 (8):64-73.

[5] 藍(lán)芳,張毅,岳振峰,等.液相色譜-四極桿/飛行時間質(zhì)譜快速篩查飼料中36種違禁藥物[J].分析測試學(xué)報,2012,31(12):1471-1478.

[6] 中國獸藥典委員會.獸藥使用指南化學(xué)藥品卷[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社，2010: 31.

(編輯：侯向輝)

Identification of Compound Illegally Adulterated in One Batch of Kanamycin Sulfate Injection by UPLC-Q/TOF MS and HPLC-PDA Method

DONG Ling-ling1, CAO Ying2, YU Xiao-hui1, WANG Jin-wen1, WAN Ren-ling1, GU Jin-hua1*

(1.ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081，China; 2.ShanghaiMunicipalVeterinaryDrugsandFeedstuffControlInstitute,Shanghai201103，China)

To identify the unknown adulterated compound in one batch of kanamycin sulfate injection in the common screening course，an unknown compound was observed with characteristic UV spectra, and couldn’t confirm its structure．The target compound was deduced with the information provided by UPLC-Q/TOF MS and HPLC-PDA，and finally validated by the two methods above．Results showed that the unknown adulterated compound in this sample was identified as nikethamide．A model of the unknown compound identification was generalized through the progress of deduction and validation described above，which provided a reference for the future inspection of adulteration in veterinary drugs．

nikethamide; illegal drug adulteration

“十二五”科技支撐計劃(2015BAD11B03-4)

董玲玲，碩士研究生，從事獸醫(yī)藥品檢驗(yàn)工作。

顧進(jìn)華。E-mail：gujinhua@ivdc.org.cn

2016-06-12

A

1002-1280 (2016) 08-0015-05

S859.83