王亦琳，葉妮，尹暉，孫雷，王鶴佳

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測牛奶中4種阿維菌素類藥物殘留量的研究

王亦琳，葉妮，尹暉，孫雷*，王鶴佳

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

建立了一種可同時檢測牛奶中4種阿維菌素類藥物(阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素和埃譜利諾菌素)殘留的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法(LC-MS/MS)。牛奶樣品經(jīng)乙腈提取，高速離心去除蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，C18柱凈化。以0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈溶液為流動相進行洗脫，流速0.4 mL/min，采用基質(zhì)匹配標準溶液外標法定量。結(jié)果表明：阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素和埃譜利諾菌素在0.5～100 ng/mL濃度范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.996；4種阿維菌素類藥物的定量限均為0.5 μg/kg。阿維菌素在0.5～5 μg/kg添加濃度范圍內(nèi)，伊維菌素在0.5～20 μg/kg添加濃度范圍內(nèi)，多拉菌素在0.5～30 μg/kg添加濃度范圍內(nèi)，埃譜利諾菌素在0.5～40 μg/kg添加濃度范圍內(nèi)，回收率為66.4%～120%；批內(nèi)與批間相對標準偏差均小于20%。該方法具有簡便快速、靈敏度高、定性準確，重復(fù)性好等特點，可以滿足牛奶中4種阿維菌素類藥物殘留檢測的要求。

阿維菌素類藥物；殘留；牛奶；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

阿維菌素類藥物(avermectins, AVMs)是由鏈霉菌Streptomycesavermitilis產(chǎn)生的一組大環(huán)內(nèi)酯類抗生素[1]，其作用機制獨特，具有較高的驅(qū)蟲活性，因而作為一種抗寄生蟲藥被廣泛應(yīng)用于牛、羊等動物。目前已商品化的阿維菌素類藥物主要包括阿維菌素(Avermectin)、伊維菌素(Ivermectin)、多拉菌素(Doramectin)和埃普利諾菌素(Eprinomectin)等，其中阿維菌素和伊維菌素是目前獸醫(yī)臨床上用量最大的抗寄生蟲藥物[2-4]。阿維菌素類藥物具有較高的脂溶性，在體內(nèi)主要分布于動物肝臟和脂肪組織中，且在體內(nèi)殘留時間較長。阿維菌素類藥物對哺乳動物的毒性很低，但是長期食用含有此類藥物的奶產(chǎn)品會對人類健康產(chǎn)生潛在威脅。我國農(nóng)業(yè)部第235號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》中規(guī)定阿維菌素禁用于泌乳期牛、羊，多拉菌素禁用于泌乳期牛，伊維菌素在牛奶中的最高殘留限量(MRL)為10 μg/kg。歐盟等世界其他國家組織也都制定了阿維菌素類藥物的最高殘留限量，2015年國際食品法典委員會(Codex Alimentarius Committee)發(fā)布的獸藥最高殘留限量標準中，牛奶中伊維菌素的MRL為10 μg/kg、多拉菌素的MRL為15μg/kg、埃譜利諾菌素的MRL為20 μg/kg, 阿維菌素在牛奶中不得檢出[5-7]。

阿維菌素類藥物分子量大，極難氣化，主要采用高效液相色譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進行分析。20世紀80年代以來，隨著穩(wěn)定、簡便的熒光衍生化條件和串聯(lián)質(zhì)譜以及相應(yīng)的樣品提取和凈化方法的不斷完善，該類藥物的殘留分析技術(shù)也有了較大發(fā)展，但該類藥物的多殘留檢測方法多集中于對豬、牛、羊等動物組織樣品中的殘留分析研究，而有關(guān)牛奶中的殘留檢測較少[8-13]?，F(xiàn)有國標中針對牛奶中阿維菌素類藥物殘留的檢測，樣品前處理方法比較復(fù)雜，且方法的靈敏度也較低[14-15]。本文建立的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法操作步驟簡單，檢測靈敏度高，可以滿足阿維菌素類藥物在牛奶中的多殘留檢測要求。

1 材料與方法

1.1 儀器 日本島津公司Shimadzu 30A液相色譜儀-美國AB SCIEX公司QTRAP 6500質(zhì)譜儀(配電噴霧離子源)； AE260電子天平，Mettler Toledo公司；BiofugeStrators高速冷凍離心機，賀利氏公司；Organomation Associates氮吹儀，Jnc公司；SIR4渦旋混合器，IKA公司。1.2 藥品和試劑 阿維菌素、伊維菌素、埃普利諾菌素標準品，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，含量≥98%；多拉菌素標準品，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，含量≥94.3%；甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)，美國Fisher公司；正己烷(分析純)、異辛烷(分析純)，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；Bond ElutC18固相萃取柱：500mg/6mL，美國Agilent公司；所用水為超純水。

1.3 標準溶液配制 精密稱定阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素和埃譜利諾菌素標準品各約10 mg，分別置于10 mL棕色量瓶中，用乙腈溶解并稀釋成濃度為1 mg/mL的標準儲備液；準確量取標準儲備液各100 μL，分別于10 mL量瓶中，用乙腈溶解并稀釋成濃度為10 μg/mL的阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素和埃譜利諾菌素標準工作液；準確量取10 μg/mL的標準工作液各100 μL，分別于10 mL量瓶中，用50%乙腈水溶液溶解并稀釋成濃度為100 ng/mL的阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素和埃譜利諾菌素標準工作液。

1.4 洗滌液配制 取乙腈30 mL、水70 mL和三乙胺20 μL，混勻。

1.5 樣品前處理

1.5.1 樣品的提取 稱取試料(2+0.02)g于50 mL離心管中，加乙腈8 mL，渦旋混勻后中速水平振蕩5 min，8000 r/min離心8 min，轉(zhuǎn)移上清液至另一50 mL離心管中，加水10 mL、三乙胺25 μL，混勻，備用。1.5.2 樣品的凈化 C18固相萃取柱依次用乙腈5 mL和洗滌液5 mL活化，取備用液過柱，依次用洗滌液5 mL、異辛烷5 mL淋洗，抽干，用乙腈5 mL洗脫，收集洗脫液于10 mL試管中，于50 ℃水浴氮氣吹干。用50%乙腈水溶液1.0 mL溶解殘余物，渦動1 min。過微孔濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.6 儀器條件

1.6.1 色譜條件 色譜柱為BEH C18(50×2.1 mm，1.7 μm)，流動相A相為0.1%甲酸水溶液；B相為0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脫：0～1 min保持70% B；1～3 min，70% B線性變化到100% B；3～4 min保持100% B；4～6 min保持70% B；流速：0.4 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量5 μL。

1.6.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI+)；電噴霧電壓為5500 V；離子源溫度為550 ℃；輔助氣1為50 psi；輔助氣2為50 psi；氣簾氣為30 psi；碰撞氣為Medium；檢測方式為多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)。待測藥物定性、定量離子對及對應(yīng)去簇電壓、碰撞能量參考值見表1。

表1 待測藥物定性、定量離子對及對應(yīng)去簇電壓、碰撞能量參考值

2 結(jié)果與分析

2.1 基質(zhì)添加標準曲線 精密量取適宜濃度的阿維菌素類標準工作液適量，用50%乙腈水溶液稀釋成含各藥物濃度分別為0.5、1、2、5、10、20、50和100 ng/mL的系列混合標準工作液，從中各取1.0 mL，分別加入到空白牛奶經(jīng)提取、凈化和吹干后的殘余物中，充分溶解，過微孔濾膜，作為基質(zhì)匹配標準溶液上機測定。分別以阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素和埃譜利諾菌素的特征離子質(zhì)量色譜峰面積與其對應(yīng)的基質(zhì)匹配標準溶液濃度作圖，得到相應(yīng)的標準曲線，線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表2。阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素和埃譜利諾菌素在0.5～100 ng/mL濃度范圍內(nèi)，特征離子質(zhì)量色譜峰面積與濃度均呈良好的線性關(guān)系，R2均大于0.996。

表2 阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素和埃譜利諾菌素的線性范圍、回歸方程和相關(guān)系數(shù)

2.2 方法準確度及精密度 采用標準添加法，在空白牛奶中添加適宜濃度的阿維菌素類標準工作液，阿維菌素的添加濃度為0.5、1、2、5 μg/kg；伊維菌素的添加濃度為0.5、5、10、20 μg/kg；多拉菌素在牛奶中的藥物濃度為0.5、7.5、15、30 μg/kg；埃譜利諾菌素的添加濃度為0.5、10、20、40 μg/kg。每種濃度5個樣品平行試驗，重復(fù)3批次，按照1.5項樣品前處理方法處理之后上機測定，基質(zhì)匹配標準溶液外標法定量，計算回收率、批內(nèi)、批間變異系數(shù)，結(jié)果匯總見表3。試驗結(jié)果表明，牛奶中阿維菌素在0.5～5 μg/kg添加濃度范圍內(nèi)，回收率范圍為84.9%～120%；伊維菌素在0.5～20 μg/kg添加濃度范圍內(nèi)，回收率范圍為66.4%～107%；多拉菌素在0.5～30 μg/kg添加濃度范圍內(nèi)，回收率范圍為76.1%～107%；埃譜利諾菌素在0.5～40 μg/kg添加濃度范圍內(nèi)，回收率范圍為78.4%～103%；批內(nèi)與批間RSD均小于20%。結(jié)果表明本方法定量準確，重復(fù)性好。

表3 空白牛奶中4種阿維菌素類藥物的回收率(n=5)

2.3 方法靈敏度 添加適量濃度的阿維菌素類標準工作液于2 g空白牛奶中，經(jīng)前處理后測定，觀察藥物特征離子質(zhì)量色譜峰信噪比(S/N) 和對應(yīng)藥物濃度， S/N>10(按PtP算)作為方法的定量限，得出阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素和埃譜利諾菌素的定量限為0.5 μg/kg。由表3可見，添加濃度為0.5 μg/kg時，阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素和埃譜利諾菌素的回收率均大于76.0%，批內(nèi)、批間的RSD分別低于8.5%、7.5%。表明該方法在定量限水平的可靠性好，且靈敏度高，完全滿足阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素和埃譜利諾菌素在牛奶中殘留檢測的需要[16]。0.5 μg/kg空白牛奶基質(zhì)匹配標準溶液中4種阿維菌素類藥物的特征離子質(zhì)量色譜圖見圖1。

(1：阿維菌素(895.5>751.4，895.5>449.1)；2：伊維菌素(897.5>753.2，897.5>329.2)；3：多拉菌素(921.5>449.1，921.5>353.2)；4：埃普利諾菌素(936.5>490.1，936.5>352.1)圖1 0.5 ng/g空白牛奶添加試樣溶液中阿維菌素類藥物特征離子質(zhì)量色譜圖

3 討論與小結(jié)

3.1 提取條件的選擇 已有文獻或國家標準方法記載的提取過程，多數(shù)用乙腈提取兩次后加2～3倍的水或淋洗液作為凈化備用液，或者用乙腈-二氯甲烷提取并正己烷去脂后直接過濾檢測。前者過柱體積較大，耗時且容易堵塞萃取柱，后者未經(jīng)萃取柱凈化，上機液體雜質(zhì)干擾較大。本方法根據(jù)稱樣量，選擇適宜體積的乙腈提取一次，在上清液中加1倍體積的水，可以有效提取其中的阿維菌素類藥物，同時通過高速離心又能很好地去除蛋白質(zhì)等大量雜質(zhì)的干擾，并且在不影響回收率的前提下盡可能減少過柱體積，為實際應(yīng)用過程中進行大批量樣品檢測節(jié)省了時間，提高了檢測效率。

3.2 凈化條件的選擇 已有方法的凈化過程，有的用氧化鋁柱凈化，有的用C18柱，經(jīng)過比較試驗，發(fā)現(xiàn)采用C18柱(500 mg/6 mL)進行凈化效果最好。由于牛奶樣品中可能含有脂肪或其他雜質(zhì)成分，因此，淋洗時在原標準基礎(chǔ)上增加了洗滌液淋洗的步驟，能夠較為有效地去除雜質(zhì)，降低雜質(zhì)及樣品基質(zhì)對有效成分的干擾，使本方法的各項技術(shù)參數(shù)均滿足獸藥殘留檢測方法的要求。

3.3 定量方法的選擇 采用本方法對牛奶試料經(jīng)前處理后上機測試發(fā)現(xiàn)存在一定的基質(zhì)效應(yīng)，因此在定量方法選擇時采用了基質(zhì)匹配標準溶液法進行定量，可以很好的消除基質(zhì)帶來的基質(zhì)效應(yīng)干擾，提高方法定量的準確性。

3.4 儀器檢測條件的建立 通過大量查閱國內(nèi)外相關(guān)文獻及已頒布的阿維菌素類藥物殘留檢測方法國家標準，歸納總結(jié)其中的儀器檢測條件作為參考，結(jié)合本實驗室實際的儀器設(shè)備條件和工作經(jīng)驗，反復(fù)優(yōu)化各項檢測參數(shù)，使得建立的檢測方法能夠滿足阿維菌素類藥物殘留檢測。如在實驗中發(fā)現(xiàn)：4種阿維菌素類藥物在ESI+模式下， [M+ Na]+峰強度最高，響應(yīng)值穩(wěn)定。因此在建立MRM檢測方法時，采用各個藥物的[M+ Na]+峰作為母離子進行二級質(zhì)譜掃描，選取信號強度最高的兩個特征碎片離子作為子離子，分別優(yōu)化各項質(zhì)譜參數(shù)，使方法的靈敏度和準確度滿足相關(guān)的要求。

本文建立了一種同時檢測牛奶中阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素和埃譜利諾菌素的多殘留分析方法。該方法具有良好的可操作性和重現(xiàn)性，方法靈敏度和精密度均能滿足獸藥殘留分析方面的要求。

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(編輯：侯向輝)

The Research of Avermectins Residues in Milk by LC-MS/MS

WANG Yi-lin, YE Ni, YIN Hui, SUN Lei*, WANG He-jia

(ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081，China)

A LC-MS/MS method was established for the determination of avermectins residues in milk. Avermectin, ivermectin, doramectin and eprinomectin were extracted with acetonitrile and the protein was deposited by high speed centrifugation, then the sample solution was purified with C18 column. The mobile phase were water (0.1% formic acid) and acetonitrile (0.1% formic acid), the flow rate was 0.4 mL/min. The method was quantified by matrix matching standard curves. A good linearity of the calibration curves was obtained with the range of 0.5～50 ng/mL for avermectin, ivermectin, doramectin and eprinomectin,the correlation coefficientR2>0.996. The limit of quantification of 4 avermectins was 0.5 μg/kg. The average recoveries of avermectins residues from spiked milk were 66.4%～120%, for avermectin at the concentrations of 0.5～5 μg/kg, ivermectin at the concentrations of 0.5～20 μg/kg, doramectin at the concentrations of 0.5～30 μg/kg, and for eprinomectin at the concentrations of 0.5～40 μg/kg. The intra- and inter-batch variation coefficients were both less than 20%. This method can be applied for the determination of avermectins residues in milk.

avermectins; residues; milk；LC-MS/MS

王亦琳，碩士，從事獸藥殘留研究工作。

孫雷。E-mail:sunlei@ivdc.org.cn

2016-06-30

A

1002-1280 (2016) 08-0033-06

S859.84