孫嘉，楊樹青，孫珂，黨斌，鞠孜敬，孫淑紅**

（1.山東農(nóng)業(yè)大學，山東 泰安 271018；2.濟南賽斯家禽科技有限公司，山東 濟南 250000)

采用血液、羽毛等材料鑒別雞性別PCR方法的應用研究*

孫嘉1，楊樹青1，孫珂2，黨斌2，鞠孜敬1，孫淑紅1**

（1.山東農(nóng)業(yè)大學，山東 泰安 271018；2.濟南賽斯家禽科技有限公司，山東 濟南 250000)

公母雞染色體上的染色體螺旋蛋白基因（chromobox-he-licase-DNA binding gene，CHD 1基因）的內含子基因序列存在差異,通過PCR方法可擴增該基因內含子的保守序列,可對雞等非平胸禽類的性別進行鑒定。本研究首先采集42只28日齡肉雞抗凝血，完成血液DNA PCR鑒定性別，結果表明，42只商品肉雞中22只公雞、20只母雞，與剖檢結果相同；其次，采集20只90日齡SPF雞（13只公雞、7只母雞）和15只2日齡SPF雞的抗凝血和羽毛，完成其DNA的 PCR鑒定以及與微量血的PCR檢測結果的比較。結果表明，90日齡、2日齡SPF雞的微量血PCR與抗凝血、羽毛提取DNA的PCR鑒定結果均相同，其中，90日齡SPF雞與其外觀性別完全吻合；另外，采集12枚15日齡雞胚的尿囊液、羽毛、肌肉，提取DNA后PCR方法可擴增出區(qū)分性別的特異性條帶，鑒定結果一致，12枚15日齡雞胚中均為7個雄性、5個雌性。本研究表明，微量血PCR和血液、羽毛等材料提取DNA后的 PCR方法均可準確快速鑒定雞和雞胚的性別，可作為家禽育種過程中常規(guī)鑒定方法的有力補充，適合大型養(yǎng)殖場規(guī)?；b定，也滿足科研領域區(qū)分雞和雞胚性別的需求。

雞；血液；羽毛；性別鑒定

雞在我國畜牧飼養(yǎng)業(yè)中占據(jù)很大比重，而且它是進行科學研究的主要模型動物之一，在科學研究領域也占據(jù)重要地位。飼養(yǎng)繁育過程中，根據(jù)不同的生產(chǎn)需求，需要對雞的性別進行區(qū)分。為使原有品種的主要生產(chǎn)性能能夠整齊、穩(wěn)定、規(guī)格化的提高，或者為了獲得優(yōu)良性狀穩(wěn)定的新品種，需要進行育種工作。育種過程中，由于雌雄個體的發(fā)育差異，對營養(yǎng)的需求有所不同，要求在早期就區(qū)分出雌雄個體，以便于分群飼養(yǎng)，不同品種的雞在進行育種時，也需要合適的雌雄比例。PCR方法對雞進行性別鑒定，生產(chǎn)上可作為傳統(tǒng)鑒別方法的一種補充方法，在新品種的繁育上起到重要作用；科研方面，可滿足形態(tài)學、內分泌學、遺傳學等學科在早期區(qū)分性別的需求。

1 材料方法

1.1 主要儀器及試劑 DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司，2×Taq Master Mix（含Taq DNA Polymerase，dNTP，優(yōu)化的緩沖體系）購自諾唯贊生物科技有限公司，性別鑒定引物由鉑尚生物科技有限公司合成，其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗動物 12枚SPF胚、15只2日齡SPF雞、90日齡SPF雞20只 （13只公雞、7只母雞），均購自濟南賽斯家禽科技有限公司；28日齡商品肉雞42只。

1.3 材料采集 SPF雞胚孵化至15日齡，4℃放置10h凍死雞胚，吸取尿囊液并采集胚體羽毛和腿部肌肉；心臟采血法采取2日齡雛雞血液，翅根靜脈采取28日齡商品肉雞和90日齡SPF雞血液，采取血液均為100μl/ml肝素抗凝血（肝素：血液=1：4）；采集雞翅膀或尾部羽毛囊內容物較多的羽毛。

1.4 材料中雞基因組DNA的提取與PCR的擴增 本研究通過雞ZW染色體上CHD 1基因內含子大小的差異，針對以羽毛等基因組DNA PCR擴增鑒定雞性別的方法選取一對引物SF/SR[1]，引物序列為：

另外，針對直接以雞微量血液為模板進行PCR擴增選取另一對引物2550F/2718R[2]，引物序列為：

1.4.1 材料中基因組DNA的提取 按照DNA提取試劑盒說明書，提取肝素抗凝血、尿囊液的基因組DNA；采用傳統(tǒng)的苯酚氯方法提取肌肉組織和羽毛的DNA。羽毛含有大量的角質蛋白，苯酚氯仿法提取羽毛DNA時，取羽毛根部中空部位，剪成1cm長度小段，放入2ml離心管中，加入700μl組織抽提液、15μl胰蛋白酶 K，55～60℃消化8h。抽提 DNA時，Tris平衡酚和氯仿的用量加大至350μl。若經(jīng)12000rpm離心10min，上清層和蛋白質層難以分離，可將上清層和蛋白質層一同吸出，用Tris平衡酚和氯仿進行第二次抽提。

1.4.2 基因組DNA的PCR擴增 PCR反應體系為 25μl：2×Taq Master Mix 12.5μl，上、下游引物（25μmol/ml）各1μl，基因組DNA 1μl。PCR反應程序：94℃預變性 5min；94℃變性 40s，55℃退火30s，72℃延伸 40s， 進行 30個循環(huán)；72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外凝膠成像儀讀取結果。

1.4.3 微量全血的PCR擴增 PCR反應體系25 μl：2×Taq Master Mix 12.5μl，ddH2O 9.9μl，上、下游引物（25μmol/ml）各1μl，抗凝血0.1μl。

根據(jù)文獻報道[3]，采用該PCR反應程序：在PCR反應管中加入上述PCR 反應體系中各物品，95℃ 3min，55℃ 3min，4個循環(huán)使紅細胞模板的細胞膜變性裂解，釋放出細胞核內的DNA。變性結束后，按如下程序進行PCR擴增反應：94℃預變性5min；93℃變性 40s，52℃退火 30s，72℃延伸 40s，進行35個循環(huán)；72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外凝膠成像儀讀取結果。

2 結果

2.1 90日齡SPF雞血液DNA和羽毛DNA性別鑒定 通過PCR方法擴增雞的血液和羽毛的基因組DNA，電泳結果見圖1。20只90日齡SPF雞（13只公雞，7只母雞）的PCR鑒定結果與表觀性別吻合。

圖1 90日齡SPF雞血液DNA、羽毛DNA PCR擴增結果

2.2 28日齡商品肉雞的性別鑒定 血液DNA為模板，PCR鑒定結果表明，42只28日齡商品肉雞中有22只為公雞，20只為母雞，結果與剖檢結果完全吻合，部分電泳結果見圖2。

圖2 商品肉雞血液DNA PCR電泳結果

2.3 2日齡雛雞的性別鑒定 以2日齡雛雞的血液DNA和羽毛DNA為模板進行PCR擴增，電泳后出現(xiàn)區(qū)分性別的特異性條帶，電泳結果見圖3。結果顯示，15只雛雞中9只為公雞，6只為母雞。

圖3 雛雞血液DNA和羽毛DNA PCR電泳結果

2.4 15日齡雞胚的性別鑒定 以尿囊液、胚羽、腿肌的基因組DNA為模板進行PCR擴增，電泳后出現(xiàn)目的條帶，同一雞胚尿囊液、胚羽、腿肌提取的基因組DNA PCR擴增結果一致。部分電泳結果見圖4。

圖4 雞胚各材料DNA PCR電泳結果

2.5 微量血方法 以微量血為模板進行性別鑒定，2日齡SPF雞的微量血鑒定結果與血液DNA、羽毛DNA的鑒定結果一致，90日齡SPF雞的微量血鑒定結果與雞的性別一致。電泳結果見圖5。

圖5 微量血PCR擴增電泳結果

3 討論

雞性別由ZW染色體決定（雄性為ZZ，雌性為ZW），對性染色體上的CHD1、ATP5A1、EE0.6等特異性基因序列進行PCR擴增，任意一特異性基因序列的擴增產(chǎn)物都能夠鑒定雞的性別，其中CHD1基因在平胸鳥類的性別領域應用最為廣泛，其擴增方法簡單，擴增的片段本身就可作為對照，避免假陰性或假陽性結果。染色體螺旋蛋白基因（chromobox-he-licase-DNA bingding gene，CHD 1基因）是性染色體上編碼調節(jié)整個染色體水平上轉錄活性蛋白的一個功能性基因[4]，其在非平胸鳥類中存在兩個同源拷貝基因，分別是與Z染色體連鎖的CHD1-Z和與W染色體連鎖的CHD1-W。1995年，Griffiths等[4]首次發(fā)現(xiàn)CHD1基因，并針對CHD1基因上的保守序列設計了一對引物（P2/ P3），展開了鳥類性別的分子鑒定工作。在非平胸鳥類的性別鑒定研究中,很多學者[5-10]采取糞便、羽毛等材料進行鳥類的性別鑒定工作,成功鑒定出了多種野生鳥類和來亨雞的性別。Jensen等[11]利用卵殼膜提取基因組DNA，通過擴增CHD基因上的保守基因片段成功鑒定出鳥類的性別，李振剛等[12]對雞胚血管的分布情況和形態(tài)制定了雄性雞胚的標準血線判定方法。

目前，雞一般是通過體貌特征和行為方式[13]、荷爾蒙水平測定[14]和腹腔剖檢[15]等辦法進行性別鑒定，但是這些方法存在一定的局限性。采用翻肛法對雞進行性別鑒定，其成本低廉，鑒定速度較快，準確率可達95%以上,可應用于生產(chǎn)上雞的大批量鑒定，但頻繁的接觸雛雞會引起多種疾病的橫向傳播,并且翻出肛門會造成一定的機械損傷，也要求鑒定性別的工作人員積累充足的經(jīng)驗，該方法存在一定的局限性。翻肛法適用于生產(chǎn)上雞的性別鑒定，其95%的準確率無法滿足科研領域區(qū)分性別的需求。

隨著對鳥類性別鑒定的不斷研究以及分子生物學技術的不斷發(fā)展，PCR擴增技術成為鑒定雞性別的一種比較理想的方法。應用非傷害性取樣法抽取血液、采集羽毛等材料，在不觸及或損傷雞的情況下采集材料，對雞的應激小，結合普通PCR操作簡便、周期短的特點，可對大量材料同時進行檢測，即適用于小群育種時性別的鑒定，也可滿足科研對鑒定準確率的要求。

根據(jù)CHD1基因的內含子基因序列在Z、W染色體上大小的差異，利用內含子兩側的保守序列設計特異性引物，用該引物進行PCR擴增后，雌性會出現(xiàn)450bp、600bp的兩條帶，雄性只會出現(xiàn)600bp大小的一條帶，電泳后僅根據(jù)條帶的數(shù)目就可判斷雞的雌雄。

本研究對雞胚和不同日齡的雞進行性別鑒定，采集雞的羽毛、血液、肌肉以及雞胚的尿囊液、胚體羽毛、肌肉組織，提取基因組DNA，PCR擴增后電泳均出現(xiàn)鑒別雌雄的特異性目的條帶。同一雞或雞胚不同材料的基因組DNA經(jīng)PCR方法鑒定性別的結果一致。另外，同一只雞微量血PCR的鑒定結果與基因組DNA的PCR鑒定結果相同。在應用PCR方法鑒定雞的性別時，雞的羽毛、血液、肌肉均可作為雌雄鑒別的材料，尿囊液、胚體羽毛、肌肉組織可用于雞胚的雌雄鑒別。

新生雛雞的翅靜脈和頸靜脈細小，采血困難。通過心臟采血法可以采集到足夠的雛雞血液，但該采血方法對新生雛雞的傷害極大，易致雛雞死亡。羽毛的再生能力強，并且可通過非傷害性采樣獲得，對雞的應激和傷害小，在應用PCR方法鑒定新生雛雞的性別時，羽毛是最理想的材料。通過測定尿囊液中雌激素水平也可區(qū)分16～18日齡雞胚的雌雄，但PCR方法鑒定性別可將鑒定時間提早至5～6胚齡。12.5日齡雞胚的尿囊液中含有少量脫落的胚胎細胞，200μl尿囊液可提取足夠的基因組DNA，避開血管及胚體抽取尿囊液后用石蠟封口仍可孵化出殼。PCR方法鑒定雛雞和雞胚的性別，靈敏準確，樣品用量少且提取的DNA不需要純化，適合在大型養(yǎng)雞場進行規(guī)模化鑒定[16]。

[1]劉宏祥，姬改革，胡艷，等.基于性染色體CHD基因序列差異鑒定雞的性別[J].中國家禽，2013，35(23)：7-10.

[2]Fridolfsson A.K.,Ellegren H.Journal of Avian Biology [J].Journal of Avian Biology,1999,30:116-121.

[3]李智利，秦清明，施振旦，等.微量全血 PCR技術鑒定雛雞及雞胚性別[J].中國畜牧獸醫(yī),2012,39(9): 74-78.

[4]Griffiths R.,Tiwari B.Sex of the last wild Spix's macaw[J].Nature,1995,375(6531):454.

[5]Rebertson B.C.,Minot E.O.,Lambert D.M.Molecular sexing individual kakapo (Strigops habroptilus) Aves,from faeces[J].Molecular Ecology,1999,8: 1349-1350.

[6]Nota Y.,Takenaka O.DNA extraction from urine and sex identification ofbirds [J].Molecular Ecology, 1999,8:1235-1238.

[7]Trefil P.,Bruno M.M.,Mikus T.,et al.Sexing of chicken feather follicle, blastodermal and blood cells[J]. Folia Biologica Prague,1999,45(6):253-256.

[8]Bello N.,Francino O.,Sanchez A.Isolation of genomic DNA from feathers [J].J Vet Diagnost Invest,2001, 13(2):162-164.

[9]Horvath M.B.,Martinez-Cruz B.,Negro J.J.,et al.An overlooked DNA Source fornon-invasive genetic analysis in birds[J].J Avian Biol,2005,36(1): 84-88.

[10]胡飛,張紅霞,包文獻,等.黑冠鶴性別的分子鑒定方法[J].中國畜牧獸醫(yī),2008,34(11):61-63.

[11]Jensen T.,Pernasetti F.M.,Durrant B.Conditions for rapid sex determination in 47 avian speciesby PCR ofgenomic DNA from blood,shellmembrane blood vessels,and feathers [J].Zoo Biology,2003,22(6):561-571.

[12]李振剛，王濤寬，李瑞仁，等.雞胚蛋血線方向與性別關系的統(tǒng)計研究[J].天津師大學學報:自然科學版,2000,20(5):36-39.

[13]Gray C.M.,Hamer K.C.2001.Food-provisioning behavior of male and female Manx shearwaters,Puffinus puffinus[J].Animal Behaviour,62(1):117-121.

[14]Bercovitz A.B.,Czekala N.M.,Lasley B.L.1978,A new meth-od ofsex determination in monomorphic birds[J].The journal of Zoo Animal medicine,9(4): 114-124.

[15]Maron J.L.,Myers J.P.1984.A description and evaluation of two techniques for sexing wintering sanderlings[J].journal of Field Ornithology,55(3): 336-342.

[16]林金杏.雞和雞胚性別鑒定技術的研究概況[A].中國黃羽肉雞行業(yè)發(fā)展大會會刊[C],2008:141-144.

Sex Identification of Chicken with Blood,Feathers and Other Materials by PCR

SUN Jia1,YANG Shu-qing1,SUN Ke2,DANG Bin2,JU Zi-jing1,SUN Shu-hong1
(1.Shanong Agricultural University,Shandong Tai'an 271018，China; 2.Jinan SAIS Poultry Co.,Ltd,Shandong Ji'nan 250000,China)

The intron gene sequence of CHD1 gene(chromobox-he-licase-DNA binding gene) was different between the chromosomes of hens and roosters.PCR(Polymerase Chain Reaction)was used to amplified the conserved sequence of the intron gene sequence in order to identified the sex of non-ratite birds such as chickens. First of all,we collected 42 anticoagulant blood samples of 28-day-old broilers,extracted DNA from the blood and used PCR to indentify the sex.Theresultsshowed that therewere22 roosters and 20 hens,thesameasthenecropsy result. Secondly,we collected anticoagulant blood and feathers samples of 20 90-day-old SPF chickens(13 roosters,7 hens)and 15 2-day-old SPF chickens,DNA was extracted and was used in PCR. Meanwhile,PCR amplification were taken on microscale blood samples and the result were identical to the PCR(with DNA)result.Among the result,all the 90-day-old SPF chickens' sex were identical to their appearance sex. Thirdly, we collected feathers, muscles and allantoic fluid samples of 12 15-day-old chicken embrysos and then extracted DNA. sexspecific bands were amplified by PCR and the result showed that there were 7 male embrysos and 5 female embrysos.In conclusion,both PCR with microscale blood samples and PCR with DNA extracted from blood and feathers could quickly and accurately identify the sex of embrysosand chickens. Itcould be a strong complementto conventionalmethodsofsex identification among poultry breeding process.

chicken;blood;feather;identified the sex

S814.7

B

1673-1085（2016）07-0011-05

2016-06-11

山東省科技發(fā)展計劃。

孫嘉（1990-），男，執(zhí)業(yè)獸醫(yī)師，碩士研究生，主要從事禽病學研究，E-mail:416211484@qq.com。

**通訊作者。