劉 芳，張 沖,，王寅彪，趙 樸，鄧瑞廣，李學(xué)伍*(.河南科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 47003； .河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院/河南省動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 45000)

豬偽狂犬病毒gD蛋白抗原表位的克隆及表達(dá)

劉 芳1，張 沖1,2，王寅彪2，趙 樸2，鄧瑞廣2，李學(xué)伍2*
(1.河南科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471003； 2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院/河南省動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002)

依據(jù)GenBank中豬偽狂犬病毒(PRV) BJ/YT株gD基因設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增gD蛋白抗原表位，其設(shè)計(jì)擴(kuò)增長(zhǎng)度為702 bp，將擴(kuò)增片段克隆到pMD19-T載體獲得pMD19-T-gD。 利用BamHⅠ和Hind Ⅲ限制性內(nèi)切酶雙酶切pMD19-T-gD質(zhì)粒，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并回收酶切片段，將回收片段與原核表達(dá)載體pET-28a連接，成功構(gòu)建了pET-28a-gD表達(dá)載體。將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞Rosetta，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示，在25 ku處出現(xiàn)特異性蛋白質(zhì)條帶。Western blot分析結(jié)果表明，表達(dá)產(chǎn)物能夠被PRV的陽(yáng)性血清識(shí)別。綜上，成功克隆并表達(dá)了gD蛋白抗原表位，且其表達(dá)產(chǎn)物具有較好的生物學(xué)活性。

豬偽狂犬病病毒;gD基因； 抗原表位; 蛋白質(zhì)表達(dá)

豬偽狂犬病(PR)是嚴(yán)重威脅我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的主要傳染病之一[1-3]。臨床表現(xiàn)為妊娠母豬的繁殖功能障礙和新生仔豬的體溫升高、腦脊髓炎及神經(jīng)癥狀?；疾∽胸i的死亡率較高，有時(shí)甚至高達(dá)100%[4-7]。成年豬感染后多能耐過，無(wú)明顯臨床癥狀，但終生帶毒且成為最危險(xiǎn)的潛在傳染源。豬群一旦感染豬偽狂犬病毒(PRV)將很難根除。因此，偽狂犬病被列為生豬產(chǎn)業(yè)的第三大疫病[8]。

PRV屬于孢疹病毒科，豬孢疹病毒屬，可在多種組織細(xì)胞如扁桃體、鼻黏膜、局部淋巴結(jié)和肺臟等組織中增殖[9]。PRV是線性雙股DNA病毒，基因組全長(zhǎng)約150 kb，由長(zhǎng)獨(dú)特區(qū)(UL)、短獨(dú)特區(qū)(US)及位于US兩端的末端重復(fù)序列(TR)和內(nèi)部重復(fù)序列(IR)組成[10]，基因組中平均GC含量高達(dá)74%且結(jié)構(gòu)復(fù)雜。目前已發(fā)現(xiàn)11種PRV糖蛋白[11]，其中g(shù)D糖蛋白是成熟的PRV粒子囊膜表面的主要生物學(xué)活性糖蛋白，也是PRV增殖所必需的糖蛋白,在病毒粒子與宿主細(xì)胞間的不可逆吸附過程中發(fā)揮著重要的作用[12]?，F(xiàn)已有多個(gè)PRV毒株的gD序列在GenBank登錄，其全長(zhǎng)約為1 250 bp，GC含量為74.5%，能夠編碼約400個(gè)氨基酸的糖蛋白[13]。鑒于PRV gD蛋白的重要性，本研究表達(dá)了gD抗原表位，并測(cè)定了其生物學(xué)活性，旨在為豬偽狂犬病疫苗免疫效果檢測(cè)方法的建立奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和載體 大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根生物(北京)有限公司，pMD19-T 克隆載體購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。表達(dá)載體pET-28a、Rosetta感受態(tài)細(xì)胞、PRV陽(yáng)性血清及陰性血清、羊抗豬IgG、His單抗等均由河南省動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑 DNA提取試劑盒，DNA膠回收試劑盒，LATaqDNA聚合酶，ExTap預(yù)混酶，限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ,dNTP及2×GC Buffer等均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 PRV 基因組DNA的制備 PK-15 細(xì)胞形成單層后，棄去生長(zhǎng)液，接種 PRV病毒液200 μL，吸附2 h后加維持液，當(dāng)70%細(xì)胞出現(xiàn)病變和脫落時(shí)，收集所有細(xì)胞培養(yǎng)物。取500 μL細(xì)胞培養(yǎng)物，加入94 μL 10%(m/V)SDS、6 μL蛋白酶K，顛倒混勻，55 ℃水浴加熱30 min；再加入等體積酚-氯仿，顛倒混勻，12 000 r/min離心5 min；取上清，再加入等體積氯仿，顛倒混勻，12 000 r/min離心5 min；取上清加入2倍體積冷乙醇顛倒混勻，-20 ℃靜置10～20 min，12 000 r/min離心10 min；棄去上清，沉淀用70%酒精洗滌1次，置超凈臺(tái)揮發(fā)干凈；用25 μL含RNase (20 μg/mL) 的滅菌去離子水溶解，立即使用或置-20 ℃保存。

1.2.2 PRV基因組DNA的鑒定 根據(jù)文獻(xiàn)[14]的方法，在gD基因保守序列區(qū)域設(shè)計(jì)合成1對(duì)引物，用于鑒定偽狂犬病毒DNA，其引物序列如下為p1:5′-CACGGAGGACGAGCTGGGGCT-3′，p2:5′-GTCCACGCCCCGCTTGAAGCT-3′，預(yù)期擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度為217 bp。

以PRV病毒DNA作為模板，PCR反應(yīng)體系為：ExTap預(yù)混酶10 μL，上、下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 7 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?95 ℃ 5 min，94 ℃ 40 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min；取PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠上電泳，用凝膠成像系統(tǒng)拍照并記錄結(jié)果。

1.2.3 gD蛋白抗原表位的擴(kuò)增 依據(jù)GenBank中PRV 毒株(BJ/YT)gD蛋白的基因序列設(shè)計(jì)引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列為gD-1：5′-CCGGGATCCCCCCAGGTTCCCATACACTC-3′，gD-2：5′-CCCAAGCTTCTATTACGGCGTCAGGAATCGCATCAC-3′，預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為702 bp。

以提取的PRV DNA為模板，用引物gD-1、gD-2進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系20 μL：LATaq酶0.2 μL，上、下游引物各0.5 μL，dNTP 1 μL，模板DNA 1 μL，2×GC Buffer 10 μL，ddH2O 6.8 μL 。反應(yīng)條件： 95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄結(jié)果并進(jìn)行回收。

1.2.4 gD蛋白抗原表位的克隆 將回收的DNA片段與pMD19-T載體16 ℃連接過夜，將10 μL連接產(chǎn)物加入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30 min，42 ℃熱激90 s，迅速置冰上1～2 min，隨后加入1 mL LB培養(yǎng)液，37 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)1 h。3 000 r/min離心5 min，棄上清，加入200 μL LB培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞沉淀，涂布LB平板(含100 μg/mL Ampicillin、24 μg/mL IPTG、40 μg/mL X-gal)，37 ℃過夜培養(yǎng)至藍(lán)白菌落出現(xiàn)，挑取白色菌落進(jìn)行PCR及雙酶切鑒定pMD19-T-gD質(zhì)粒。

1.2.5 gD蛋白抗原表位表達(dá)載體的構(gòu)建 利用BamHⅠ、Hind Ⅲ雙酶切pMD19-T-gD質(zhì)粒和pET-28a表達(dá)載體，用連接酶連接回收的目的片段和表達(dá)載體。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Rosetta感受態(tài)細(xì)胞，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行PCR及雙酶切鑒定pET-28a-gD質(zhì)粒，并對(duì)其進(jìn)行序列測(cè)定。

1.2.6 gD蛋白抗原表位的誘導(dǎo)表達(dá) 挑取陽(yáng)性菌落過夜培養(yǎng)后，取100 μL菌液接種于100 mL LB培養(yǎng)液中(含100 μg/mL Ampicillin)，37 ℃、230 r/min培養(yǎng)至OD600為0.6～1.0，加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG，37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)8 h。收集1 mL菌液分裝于1.5 mL的離心管中，12 000 r/min離心5 min，沉淀用100 μL PBS緩沖液重懸，加入25 μL 5×SDS上樣Buffer，煮沸8 min。將未誘導(dǎo)的重組菌作為對(duì)照進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

1.2.7 gD蛋白抗原表位表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE電泳 配制15%的分離膠，取上述誘導(dǎo)表達(dá)菌液200～300 μL于1.5 mL eppendorf 管中，8 000 r/min離心1～2 min，棄去上清，用20 μL PBS緩沖液重懸，加入5 μL 5×Buffer(用前加熱)。放入浮漂中，煮沸8～10 min。12 000 r/min離心2 min，取上清上樣。考馬斯藍(lán)染色，脫色后觀察。

1.2.8 gD蛋白抗原表位Western blot檢測(cè) 取硝酸纖維素膜(NC膜)，依據(jù)所切下蛋白質(zhì)膠的大小，小心裁剪。將膜、蛋白質(zhì)膠、濾紙分別用甲醇、轉(zhuǎn)膜緩沖液浸泡處理好之后按照濾紙、NC膜、SDS-PAGE膠、濾紙的順序放入電轉(zhuǎn)儀，15 V電轉(zhuǎn)1 h。取出樣品，SDS-PAGE膠用考馬斯亮藍(lán)繼續(xù)染色，NC膜用5%的脫脂奶封閉過夜，依次加入一抗(His單抗、PRV陽(yáng)性血清及陰性血清)、二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體及羊抗豬IgG抗體)進(jìn)行處理，并用AEC顯色方法進(jìn)行顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 gD蛋白抗原表位的PCR擴(kuò)增及克隆

以PRV病毒培養(yǎng)物的總DNA為模板，用引物p1、p2進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得與預(yù)期大小一致的特異性目的條帶,證明了模板DNA中PRV DNA的存在(圖1)，為目的序列的擴(kuò)增奠定了基礎(chǔ)。

M.DNA Marker DL2000； 1.正常細(xì)胞DNA模板擴(kuò)增產(chǎn)物； 2—4.病毒培養(yǎng)物DNA模板擴(kuò)增產(chǎn)物圖1 PRV DNA模板PCR擴(kuò)增

以上述鑒定正確的DNA為模板，利用引物gD-1、gD-2進(jìn)行擴(kuò)增獲得與預(yù)期大小一致的特異性目的條帶(圖2)，成功擴(kuò)增了gD蛋白的抗原表位?；厥諗U(kuò)增產(chǎn)物并將其克隆于pMD19-T載體，成功構(gòu)建了pMD19T-gD重組質(zhì)粒。

M.DNA Marker DL2000； 1.gD 抗原表位圖2 gD抗原表位擴(kuò)增結(jié)果

2.2 pET-28a-gD表達(dá)載體鑒定

2.2.1 酶切鑒定結(jié)果 培養(yǎng)重組工程菌，提取制備pET-28a-gD重組質(zhì)粒，經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ、Hind Ⅲ酶切后，瓊脂糖凝膠電泳可見702 bp的目的條帶和5 900 bp的載體條帶，與預(yù)期片段的大小一致(圖3)。

M.DNA Marker DL2000； 1.pET-28a-gD 雙酶切產(chǎn)物圖3 pET-28a-gD 表達(dá)載體雙酶切鑒定

2.2.2 PCR鑒定結(jié)果 以pET-28a-gD表達(dá)載體質(zhì)粒為模板，利用引物gD-1、gD-2進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳，結(jié)果顯示擴(kuò)增出了約702 bp大小的特異條帶，與預(yù)期片段的大小一致(圖4)。

以上結(jié)果表明，目的片段已插入表達(dá)載體。

M.DNA Marker DL2000； 1.pET-28a-gD PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物圖4 pET-28a-gD質(zhì)粒PCR鑒定

2.3 gD蛋白抗原表位片段序列測(cè)定結(jié)果

對(duì)pET-28a-gD表達(dá)載體進(jìn)行序列測(cè)定分析，結(jié)果顯示，所插入的目片段的序列完整，在表達(dá)載體的閱讀框內(nèi)能夠獲得正確的閱讀，其編碼的氨基酸序列與天然gD抗原表位氨基酸序列一致。結(jié)果表明，成功的構(gòu)建了pET-28a-gD表達(dá)載體。

2.4 gD蛋白抗原表位SDS-PAGE鑒定結(jié)果

重組陽(yáng)性菌用IPTG于37 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)后，經(jīng)SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示，誘導(dǎo)重組菌比未誘導(dǎo)重組菌多出1條蛋白質(zhì)條帶，其分子質(zhì)量約25 ku，與預(yù)期表達(dá)蛋白的大小一致(圖5)。

2.5 gD蛋白抗原表位Western blot分析結(jié)果

gD蛋白抗原表位經(jīng)SDS-PAGE電泳后，將凝膠上的蛋白質(zhì)條帶電轉(zhuǎn)移到NC膜上，并進(jìn)行Wes-tern blot分析。結(jié)果顯示，在25 ku大小的位置呈現(xiàn)特異性反應(yīng)條帶(圖6)。表明，表達(dá)產(chǎn)物能被偽狂犬陽(yáng)性血清特異性識(shí)別，具有生物學(xué)活性。

M.廣譜彩虹預(yù)染蛋白Marker; 1.IPTG誘導(dǎo)菌； 2.IPTG未誘導(dǎo)菌圖5 gD蛋白抗原表位SDS-PAGE 電泳

M.預(yù)染蛋白質(zhì)Marker； 1.His單抗(誘導(dǎo))； 2.His單抗(未誘導(dǎo))； 3.PRV 陽(yáng)性血清(誘導(dǎo))； 4.PRV 陽(yáng)性血清(未誘導(dǎo))；5.PRV 陰性血清(誘導(dǎo))； 6.PRV 陰性血清(未誘導(dǎo))圖6 gD蛋白抗原表位Western blot分析結(jié)果

3 結(jié)論與討論

PRV gD蛋白作為成熟病毒粒子囊膜表面主要糖蛋白，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，而這些抗體無(wú)論在有無(wú)補(bǔ)體存在的情況下，都具有中和PRV的能力[15]，在機(jī)體保護(hù)方面發(fā)揮主要作用。表達(dá)gD糖蛋白，利用表達(dá)蛋白建立ELISA檢測(cè)方法，檢測(cè)免疫豬血清中的對(duì)應(yīng)抗體效價(jià)，是評(píng)價(jià)疫苗的免疫效果的有效方法之一[16]。

由于PRV病毒基因組的GC含量較高，使得目的片段的擴(kuò)增難度增加，常用的ExTaq酶擴(kuò)增方法往往無(wú)法得到目的片段，使用LATaq酶及GC Buffer方可有效擴(kuò)增[17]。前人研究表明，gD蛋白存在一定數(shù)量的線性抗原表位[18-19]，這些抗原表位能夠被不同的單克隆抗體識(shí)別，具有較強(qiáng)的抗原反應(yīng)原性。因此，體外表達(dá)抗原表位蛋白用于疫苗免疫效果的評(píng)價(jià)，是一種行之有效的方法。此外，該方法也可用于缺失疫苗免疫豬群的鑒別診斷。在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)PRV蛋白的表達(dá)有一定的難度，構(gòu)建的表達(dá)載體往往不能夠表達(dá)，其主要原因可能是PRV 蛋白與工程菌體的兼容性較小所致。因此，在研究PRV蛋白體外表達(dá)時(shí)最好采用真核表達(dá)系統(tǒng)。本研究采用原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了PRV gD抗原表位，為豬群PRV免疫效價(jià)的檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。

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Cloning and Expression of Epitopes of gD Protein of Pseudorabies Virus

LIU Fang1,ZHANG Chong1，2,WANG Yinbiao2,ZHAO Pu2,DENG Ruiguang2,LI Xuewu2*
(1.College of Animal Science and Technology,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China;2.Henan Key Laboratory of Animal Immunology/Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China)

According to the pseudorabies virus strain BJ/YTgDgene sequences in GenBank,a pair of primers were designed .The B-cell epitopes of gD was amplified,and the length of PCR product was 702 bp.The amplified fragment was cloned into the cloning vector pMD19-T successfully named pMD19-T-gD.The fragment was digested byBamH I andHindIII restriction enzymes and then cloned into the expression vector pET-28a named pET-28a-gD.The expression of protein was induced with IPTG,specific protein bands appeared at the site of 25 ku by SDS-PAGE electrophoresis.Western blot analysis showed that the expression product could be identified by pseudorabies virus positive serum .In this study，gD protein epitope was cloned and expressed successfully,and the expression product had good biological activity.

pseudorabies virus;gDgene; epitope; protein expression

2015-11-20

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31172348)

劉 芳(1988-)，女，河南洛陽(yáng)人，在讀碩士研究生，研究方向：畜禽疫病快速檢測(cè)與防制。 E-mail：346103828@qq.com

*通訊作者：李學(xué)伍(1964-)男，河南通許人，研究員，博士，主要從事動(dòng)物病毒生物學(xué)研究。E-mail：lixuewu2002@126.com

S855.3

A

1004-3268(2016)04-0122-04