葛 婧，郭永軍，王慶奎，徐大為，孫學(xué)亮，陳成勛，邢克智

（天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384）

連翹、黃連、穿心蓮對(duì)半滑舌鰨血液抗氧化指標(biāo)的影響

葛 婧，郭永軍通信作者，王慶奎，徐大為，孫學(xué)亮，陳成勛，邢克智

（天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384）

為了解連翹、黃連、穿心蓮對(duì)半滑舌鰨血液抗氧化能力的影響。本文采用單因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將連翹、黃連、穿心蓮按0、5、10、15 g/kg添加到飼料中，7，14，21 d后取樣，檢測(cè)半滑舌鰨血液總超氧化物歧化酶（T-SOD），過氧化氫酶（CAT），總抗氧化能力（T-AOC），丙二醛（MDA），總膽固醇（T-CHO），甘油三酯（TG）等指標(biāo)。結(jié)果表明，連翹組：14 d后，5 g/kg組T-SOD活力達(dá)到最高。21 d后，5 g/kg組CAT活力最高。14 d后15 g/kg組MDA值顯著低于對(duì)照組。黃連組：14 d后15 g/kg組T-SOD活力達(dá)到最高。21 d后，15 g/kg組T-AOC活力顯著高于對(duì)照組。穿心蓮組：14 d后，10 g/kg組T-SOD活力，CAT活力及T-AOC活力都達(dá)到最高。21 d后，5g/kg組MDA值顯著低于對(duì)照組。10 g/kg組T-CHO值和TG值在7 d后均顯著高于對(duì)照組。結(jié)果顯示，連翹、黃連及穿心蓮單獨(dú)添加對(duì)半滑舌鰨血液抗氧化指標(biāo)均有不同程度的影響。

連翹；黃連；穿心蓮；半滑舌鰨；抗氧化指標(biāo)

近年來，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，化學(xué)藥物的濫用，導(dǎo)致養(yǎng)殖水域環(huán)境惡化，水產(chǎn)動(dòng)物疾病頻發(fā)[1]。水產(chǎn)動(dòng)物在應(yīng)激和疾病時(shí)，抗氧化能力下降，體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和消除失衡，機(jī)體出現(xiàn)氧化性損傷[2]。半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）屬鰈形目（Pleuronectiformes）、舌鰨科（Cynoglossidae）、舌鰨屬（Cynoglossus），是我國(guó)北方常見的底棲魚類，屬暖溫性，自然分布區(qū)集中于我國(guó)的黃、渤海海域[3]。其肉味鮮美，經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高。近年來，半滑舌鰨作為重要的養(yǎng)殖水產(chǎn)品種，具有較高的經(jīng)濟(jì)效益，且發(fā)展?jié)摿艽?。研究表明，半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）在高密度（8.20 kg/m2）養(yǎng)殖條件下，其肝胰臟超氧化物歧化酶（SOD）活力顯著低于中（4.83 kg/m2）、低（2.32 kg/m2）密度養(yǎng)殖條件[4]。半滑舌鰨經(jīng)受 3 h急性擁擠（14 kg/m2）脅迫后，血液過氧化氫酶（CAT）活力顯著降低[5]。牙鲆幼魚（Paralichthys olivaceus）養(yǎng)殖1 d 時(shí)，隨著溫度的升高其肝臟過氧化氫酶（CAT）和超氧化物岐化酶（SOD）活力逐漸升高[6]。因此，抗氧化劑在保護(hù)水產(chǎn)動(dòng)物不受自由基引起的氧化損傷、增強(qiáng)抗病力方面有著重要的作用。

中草藥作為一種無抗藥性，低毒性的天然藥物，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中廣泛應(yīng)用，不僅能促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物的生長(zhǎng)，還能增強(qiáng)其抗氧化性能[7-8]。中草藥植物體內(nèi)具有防御、清理和恢復(fù)過量自由基的體制，如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）等抗氧化酶是其重要組成[9]，另一方面，如多酚、黃酮、多糖類化合物等抗氧化酶活性增強(qiáng)劑，可調(diào)節(jié)和增強(qiáng)機(jī)體抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT等）活性[10]。研究報(bào)道，餌料中添加3％的大黃，可使得鯉魚免疫器官增重，溶菌活性增強(qiáng)，吞噬細(xì)胞吞噬能力加強(qiáng)[11]；半滑舌鰨飼料中添加黃芩能顯著增強(qiáng)半滑舌鰨的吞噬活性及，溶菌酶活性[12]；鯉魚飼料中添加2％的野菊花可顯著增強(qiáng)魚體血液吞噬細(xì)胞的吞噬能力以及溶菌酶活力，且魚體頭腎的重量顯著增高[13]。因此，中草藥作為天然且環(huán)保型的飼料添加劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用越來越常見。

連翹是木犀科連翹屬落葉灌木植物，常以果實(shí)入藥，具有清熱解毒、消腫散結(jié)之功效[14]，歷來被視為瘡家要藥[15]。黃連為毛茛科植物，根莖入藥，性寒，味苦，有清熱解毒、瀉火等功效[16]。穿心蓮為爵床科穿心蓮屬植物穿心蓮的干燥地上部分，性寒，味苦，具有清熱解毒、消腫止痛等功效?；诖?，本文將連翹（Forsythia suspense），黃連（Coptidis rhizoma），穿心蓮（Andrographis paniculata）按不同劑量分別添加到飼料中喂食半滑舌鰨，研究其對(duì)半滑舌鰨血液抗氧化指標(biāo)的影響，為連翹，黃連，穿心蓮在半滑舌鰨健康養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料的處理

半滑舌鰨取自天津市海發(fā)珍品實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司養(yǎng)成車間，健康狀況良好，體重（95.45± 5.29）g。試驗(yàn)前將半滑舌鰨放在方形聚乙烯箱（78 cm×58 cm×46 cm）中暫養(yǎng)7 d，養(yǎng)殖水溫為（21±1）℃，鹽度為（20±1）‰，pH為（8±0.5），NH4＋-N為（0.026±0.003）mg/L，NO2－-N為（0.028±0.001）mg/L，DO為（8±1）mg/L，自然光照。每日8:00和16:00飼喂，每次投料量為魚體重1％，30 min后吸除殘餌并換水1/3，試驗(yàn)開始前1天停食。

連翹、黃連及穿心蓮原藥（購(gòu)自天津市藥材公司）按比例稱量，溫水浸泡50 min，砂鍋3次煎煮（加入20倍量水，湯藥微微沸騰前用武火，沸騰后改用文火，一煎40 min，二煎35 min，三煎30 min，連續(xù)煎煮）后濾除藥渣，湯劑全部添加到半滑舌鰨基礎(chǔ)餌料中?；A(chǔ)餌料（表1）以魚粉、魚油、食用淀粉等為原料制成。

表1 餌料配方組成和營(yíng)養(yǎng)組成 ％

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

連翹、黃連及穿心蓮分別按0、5、10、15 g/kg的添加量（添加的湯劑量為相當(dāng)于g/kg中草藥熬制出來的，文中后面以g/kg中草藥表示湯劑的添加量），配制成等氮等能飼料。飼養(yǎng)周期21 d，每個(gè)水平3個(gè)重復(fù)，每箱20尾。馴化7 d后投喂試驗(yàn)餌料，分別于投喂試驗(yàn)餌料的7、14、21 d后取樣。

1.3 樣品采集，處理和測(cè)定

在投喂試驗(yàn)餌料的7、14、21 d后，試驗(yàn)魚停食24 h后取樣，MS-222麻醉（100 mg /L），每箱隨機(jī)取6尾魚，2 mL無菌注射器尾柄采血，肝素鈉（50 U/mL）抗凝，4 ℃下5 000 r/min離心10 min，取上清，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?yīng)用試劑盒（南京建成生物工程研究）測(cè)定血液中總超氧化物歧化酶（T-SOD），過氧化氫酶（CAT），總抗氧化能力（T-AOC），丙二醛（MDA），總膽固醇（T-CHO），甘油三酯（TG）的活力。

1.3.1 總超氧化物歧化酶（T-SOD）活力測(cè)定

采用羥胺法，用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定。單位定義：每mL反應(yīng)液中SOD的抑制率達(dá)50％時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為一個(gè)酶活力單位。血清SOD活力（U/mL）＝（OD對(duì)照－OD測(cè)定）/OD對(duì)照÷50％×稀釋倍數(shù)。

1.3.2 丙二醛（MDA）含量測(cè)定

采用硫代巴比妥酸（TBA）法，用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定。計(jì)算公式：血清中 MDA 含量（nmol/mL）＝（OD測(cè)定-OD空白）/（OD標(biāo)準(zhǔn)-OD空白）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（10 nmol/mL）/樣本測(cè)試前稀釋倍數(shù)。

1.3.3 過氧化氫酶（CAT）活力測(cè)定

采用可見光法，用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定。單位定義：以每mL血清每秒鐘分解1 μmol的H2O2的量為一個(gè)酶活力單位。計(jì)算公式：血清CAT活力（U/mL）＝（OD對(duì)照－OD測(cè)定）×271×1/60/取樣量×樣本測(cè)試前稀釋倍數(shù)。

1.3.4 總抗氧化（T-AOC）能力測(cè)定

用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定。單位定義：在37 ℃時(shí)，以每分鐘每毫升血清（血漿）使反應(yīng)體系的吸光度（OD）值每增加0.01時(shí)，為一個(gè)總抗氧化能力單位。計(jì)算公式：血清CAT活力（U/mL）＝（OD測(cè)定－OD對(duì)照）/0.01/30×反應(yīng)液總量/取樣量×樣本測(cè)試前稀釋倍數(shù)。

1.3.5 總膽固醇（CHO）含量測(cè)定

采用COD-PAP法，用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定。

1.3.6 甘油三酯（TG）含量測(cè)定

采用GPO-PAP酶法，用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)作單因素方差分析（One-Way ANOVA），LSD和Duncan法比較數(shù)據(jù)間差異顯著性，P＜0.05為差異顯著。統(tǒng)計(jì)值均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 連翹對(duì)半滑舌鰨血液抗氧化指標(biāo)的影響

飼料中添加不同含量的連翹對(duì)半滑舌鰨血液抗氧化指標(biāo)的影響見表2。在14 d后，5 g/kg組T-SOD活力達(dá)到最高值。在21 d后，各組CAT活力均達(dá)到最高值，且在5 g/kg組CAT活力最高。在7 d，14 d后，各組T-AOC活力均低于對(duì)照組，但在21 d后均高于對(duì)照組。不同含量組MDA值在14 d，21 d后均低于對(duì)照組，且在14 d后15 g/kg組顯著低于對(duì)照組。

表2 連翹對(duì)半滑舌鰨血液抗氧化指標(biāo)的影響

續(xù)表2

2.2 黃連對(duì)半滑舌鰨血液抗氧化指標(biāo)的影響

飼料中添加不同含量的黃連對(duì)半滑舌鰨血液抗氧化指標(biāo)的影響見表3。在14 d后15 g/kg組T-SOD活力達(dá)到最高值。各組CAT活力在21 d后顯著升高，但CAT活力均低于對(duì)照組。7 d后各組T-AOC活力均低于對(duì)照組，且在21 d后，15 g/kg組顯著高于對(duì)照組。各組MDA值在21 d后，15 g/kg組顯著低于對(duì)照組。不同含量組黃連對(duì)血液T-CHO值有顯著影響，但各組T-CHO值均低于對(duì)照組。

表3 黃連對(duì)半滑舌鰨血液抗氧化指標(biāo)的影響

2.3 穿心蓮對(duì)半滑舌鰨血液抗氧化指標(biāo)的影響

飼料中添加不同含量的穿心蓮對(duì)半滑舌鰨血液抗氧化指標(biāo)的影響見表4。在14 d后，10 g/kg組T-SOD活力達(dá)到最高值。僅在14 d后，各組CAT活力高于對(duì)照組，且10 g/kg組CAT活力最高。各組T-AOC活力在14 d，21 d后顯著高于對(duì)照組，且10 g/kg組T-AOC活力最高。不同含量組MDA值在21 d后，5 g/kg組顯著低于對(duì)照組。10 g/kg組T-CHO值和TG值在7 d后均顯著高于對(duì)照組。

表4 穿心蓮對(duì)半滑舌鰨血液抗氧化指標(biāo)的影響

3 討論

生命體在其生命活動(dòng)中不斷產(chǎn)生活躍的自由基，而自由基會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)分子、酶分子甚至整個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生傷害，導(dǎo)致機(jī)體損傷及衰老[17]。在一定程度上，自由基的產(chǎn)生與機(jī)體抗氧化防護(hù)體系處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。SOD可將自由基轉(zhuǎn)化成過氧化氫，進(jìn)而CAT 將過氧化氫還原成氧分子和水，以此來維持機(jī)體細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的平衡[18]。SOD 和 CAT活性可以準(zhǔn)確地反映機(jī)體內(nèi)自由基的代謝情況，從而有效地判斷機(jī)體的抗氧化防御功能及健康情況[19]。當(dāng)機(jī)體不能清除多余的自由基時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生氧化壓力[19-21]。多余的自由基會(huì)侵犯生物膜，生成脂質(zhì)過氧化物（LPO），并最終生成丙二醛（MDA）[22]。MDA可使生物膜結(jié)構(gòu)改變，細(xì)胞膜的流動(dòng)性降低，導(dǎo)致細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化損傷，因此MDA含量不僅能顯示機(jī)體脂質(zhì)過氧化程度的高低，也能間接反映其抗氧化能力的強(qiáng)弱[23]。

研究表明，許多疾病的發(fā)生發(fā)展與自由基及其誘導(dǎo)的氧化反應(yīng)有關(guān)[24-26]。中草藥低毒，無抗藥性，能促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)，增強(qiáng)抗氧化能力[27-29]，有效清除自由基對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物機(jī)體的氧化損傷[30]。研究發(fā)現(xiàn)，中草藥作為天然植物，具有防御、清除和修繕多余自由基的系統(tǒng)，而超氧化物歧化酶、過氧化氫酶等抗氧化酶是其重要組成部分[31]。因此尋求能有效清除水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)自由基，減少疾病發(fā)生，促進(jìn)生長(zhǎng)的中草藥飼料添加劑極其重要。

3.1 連翹對(duì)半滑舌鰨血液抗氧化指標(biāo)的影響

本試驗(yàn)中，不同含量的連翹可顯著影響半滑舌鰨血清T-SOD，CAT，T-AOC活力以及MDA含量，說明連翹可不同程度的提高半滑舌鰨血液抗氧化機(jī)能。其中7 d，14 d后，各組T-AOC活力均低于對(duì)照組，在21 d后高于對(duì)照組。而不同含量組連翹對(duì)半滑舌鰨血液T-CHO值和TG值均無顯著影響。其影響原因可能是，連翹有效成分復(fù)雜，其添加方式不同對(duì)生物體影響結(jié)果不同。如研究表明，用連翹葉提取物給小鼠灌胃，可顯著降低其腦組織中 MDA水平，增強(qiáng)腦組織中SOD活性[32]。凡納濱對(duì)蝦飼料中添加2％的黃芪，可顯著增強(qiáng)其超氧化物歧化酶活力和血清總蛋白含量[33]；大蒜、螺旋藻、刺五加、黃芪可顯著提高銀鯽血清LSZ活性、SOD活力[34]。

3.2 黃連對(duì)半滑舌鰨血液抗氧化指標(biāo)的影響

該試驗(yàn)中，不同含量組黃連雖顯著影響半滑舌鰨血液中T-SOD，CAT，T-AOC活力以及MDA，T-CHO含量，但結(jié)果有一定偏差。各組CAT活力在21 d后雖顯著升高，但均低于對(duì)照組。7 d后各組T-AOC活力也均低于對(duì)照組。不同含量組T-CHO值均低于對(duì)照組，且不同含量組黃連對(duì)血液TG值無顯著影響。研究表明，不同劑量的杜仲葉添加到草魚飼料中，能顯著增強(qiáng)草魚血清的非特異性免疫能力[35]；大黃、穿心蓮、板藍(lán)根和金銀花能顯著增強(qiáng)魚類血液以及體表粘液中的溶菌酶活性[36]。

3.3 穿心蓮對(duì)半滑舌鰨血液抗氧化指標(biāo)的影響

研究表明，將穿心蓮浸膏粉添加到羅非魚飼料中，可顯著降低其肝臟中MDA含量，并顯著提高其血清中SOD活力[37]。白芍、五味子、黨參、刺五加、黃芪和魚腥草的醇提取物添加到鯽基礎(chǔ)飼料中，可顯著提高鯽魚的免疫力，且抗病能力增強(qiáng)[38]；鯉飼料中添加刺五加、蒲公英、枸杞子、金銀花和大蒜等，可顯著增強(qiáng)鯉血清中和免疫器官中的溶菌酶活性[38]。該試驗(yàn)表明，不同含量組穿心蓮在一定程度上可顯著影響半滑舌鰨抗氧化指標(biāo)能力，與上述研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，不同梯度的連翹，黃連，穿心蓮均能不同程度的提高半滑舌鰨的血液抗氧化能力。但連翹，黃連，穿心蓮的最適宜添加量以及適宜的飼喂時(shí)間要做進(jìn)一步的試驗(yàn)進(jìn)行研究分析。

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Effect ofForsythia suspensa,Coptidis rhizoma,Andrographis paniculataon Blood Antioxidant Parameters inCynoglossus semilaevis

GE Jing, GUO Yong-junCorrespondingAuthor, WANG Qing-kui, XU Da-wei, SUN Xue-liang,
CHEN Cheng-xun, XING Ke-zhi
（Tianjin Key Laboratory of Aqua-Ecology and Aquaculture, College of Fisheries, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

The study was conducted to understand the effect ofForsythia suspensa,Coptidis rhizoma,Andrographis paniculataon the blood antioxidant function inCynoglossus semilaevis. A factorial experiment was designed to evaluate the blood parameters（the total superoxide dismutase（T-SOD）, total antioxidant capacity（T-AOC）, catalase（CAT）, malonaldehyde（MDA）, triglyceride（TG）, total cholesterol（T-CHO））inC. semilaevisafter 7 days, 14 days and 21 days. Fish were fed diets containing different doses ofF. suspensa,C. rhizoma,A. paniculata（0, 5, 10, 15 g/kg）. The results, diet supplemented with 5 g/kgF. suspensaresulted in significantly highest T-SOD activity after 14 days, diet supplemented with 5 g/kg ofF. suspensaresulted in significantly highest CAT activity 21 days, diet supplemented with 15 g/kgF. suspensaresulted in significantly lower MDA content than the control group after 14 days. Diet supplemented with 15 g/kgC. rhizomaresulted in significantly highest T-SOD activity after 14 days. Diet supplemented with 15 g/kg ofC. rhizomaresulted in significantly higher T-AOC activity than the control group after 21 days. Diet supplemented with 10 g/kgA. paniculataresulted in significantly highest T-SOD activity, CAT activity and T-AOC activity after 14 days. Diet supplemented with 5 g/kgA. paniculataresulted in significantly lower MDA content than the control group after 21 days. Diet supplemented with 10 g/kgA. paniculataresulted in significantly higher T-CHO content and TG content than the control group after 7 days. The results indicated thatF. suspensa,C. rhizoma,A. paniculataadded individually had different degrees of influences on blood antioxidant parameters inC. semilaevis.

Forsythia suspense;Coptidis rhizoma;Andrographis paniculata;Cynoglossus semilaevis; antioxidant parameters

S963

A

1008-5394（2016）04-0021-07

2016-03-28

國(guó)家星火計(jì)劃項(xiàng)目“漁用中草藥添加劑的開發(fā)與應(yīng)用”（2013GA610002）；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目“當(dāng)歸多糖對(duì)點(diǎn)帶石斑魚非特異性免疫和抗氧化機(jī)理的研究”（31270456）；天津市科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目“中草藥在水產(chǎn)健康養(yǎng)殖中的應(yīng)用與開發(fā)”（13ZCZDNC00700）；天津市高等學(xué)校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)基金項(xiàng)目“現(xiàn)代水產(chǎn)生態(tài)健康養(yǎng)殖”（TD12-5018）

葛婧（1989-），女，安徽亳州人，碩士在讀，研究方向：水產(chǎn)動(dòng)物病害防治與免疫學(xué)。E-mail：532462825@qq.com。

郭永軍（1969-），男，天津市人，研究員，碩士，研究方向：水產(chǎn)動(dòng)物病害防治與免疫學(xué)。E-mail：guoyongjun@tjau.edu.cn。