謝旖,田亞南,文利新,鄔靜,周煜,黃衛(wèi)梅(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,湖南長沙410128)

豬孕烷X受體研究進(jìn)展

謝旖,田亞南,文利新,鄔靜,周煜,黃衛(wèi)梅
(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,湖南長沙410128)

孕烷X受體(NR 1I2,pregnane X receptor,PXR)是一類配體依賴型的轉(zhuǎn)錄因子,為核受體超家族NRl I亞家族成員,由Kliewer等于1998年首次發(fā)現(xiàn)[1].PXR作為體內(nèi)非常重要的一種外源性受體,與配體結(jié)合后可將各種結(jié)構(gòu)中的外源性與內(nèi)源性化合物(如臨床治療藥物、環(huán)境化合物和膽汁酸等)代謝排出體外.此外,PXR還是一種多效性基因調(diào)節(jié)蛋白,它除了能夠高效的調(diào)控異生物質(zhì)代謝外,在調(diào)節(jié)動物的生理和病理過程中如炎癥反應(yīng),細(xì)胞增殖與腫瘤發(fā)生,控制致癌物導(dǎo)致的DNA損傷,通過表觀遺傳學(xué)機(jī)理調(diào)控基因表達(dá)等過程中也起著非常重要的作用.而近年來,豬作為臨床研究的可行動物模型正獲得廣泛關(guān)注,Pollock及其同事于2007年克隆出豬孕烷X受體(pgPXR) mRNA的全長[2].

1　pgPXR的分子生物學(xué)特性

1.1pgPXR基因組成豬PXR mRNA基因組全長約有2 469 bp,pgPXR包含9個外顯子.pgPXR外顯子長度和剪接位點位置與hPXR類似,hPXR的2-9外顯子包含一個可編碼434個氨基酸的開放閱讀框(Open reading frame,ORF),而pgPXR基因中2-9外顯子的ORF編碼421個氨基酸的多肽.雖然pgPXR與hPXR在N-末端存在14個氨基酸的大小差異,但該區(qū)域還沒被定性為重要的配體結(jié)合域或功能結(jié)合域.人類與小鼠PXR之前的研究表明,小鼠蛋白序列與人蛋白序列有77%的氨基酸序列同源性和86%的相似性,單個氨基酸差異就可改變PXR的活性,當(dāng)轉(zhuǎn)基因小鼠在4個位置(R203,P205,Q404,Q407)分別引入人類殘基并結(jié)合SR12813,其作用與hPXR相似[3].而豬蛋白序列與人蛋白序列具有85%的氨基酸序列同源性和95%的相似性,且在R203,P205, Q404和Q407這4個位置包含人類殘基,這表明豬可能是研究人藥物基因組學(xué)的的較適當(dāng)模型.

1.2pgPXR結(jié)構(gòu)及組織分布PXR具有高度保守的結(jié)構(gòu)域.N端激活功能區(qū)高度可變,包含非依賴性的轉(zhuǎn)錄激活域(activation function 1,AF-1),DNA結(jié)合域(DNA binding domain,DBD),配體結(jié)合域(Ligand binding domain,LBD).PXR的LBD非常大從而允許外源性和內(nèi)源性化合物作為活化配體廣泛存在,PXR在經(jīng)配體活化構(gòu)象改變后與視黃醇X受體(Retinoid X receptor,RXR)形成異源二聚體參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控.LBD存在物種差異,不同物種間配體激活程度存在差異.Moore等克隆pgPXR的LBD發(fā)現(xiàn)pgPXR與hPXR的LBD同源性為87%,pgPXR與hPXR在配體結(jié)合上具有較高的相似性[4].Ott等研究發(fā)現(xiàn)pgPXR能被hPXR激動劑利福平(RIF)和貫葉金絲桃素激活[5].

pgPXR基因在腎上腺,顎下淋巴節(jié),胸腺,卵巢,子宮,氣管,膀胱,脾和間質(zhì)淋巴結(jié)中表達(dá)量較低,在腎臟,肝臟,小腸和大腸組織中高表達(dá),其中在肝臟和小腸的表達(dá)量最高.與hPXR在骨髓中特有表達(dá)不同,pgPXR在胸腺,下頜,間質(zhì)淋巴結(jié),膀胱,脾臟,睪丸,氣管,卵巢和子宮特有表達(dá).

1.3pgPXR剪接變體選擇性剪接在核受體中十分常見,hPXR中也多有報道[6].核受體剪接變體(Splice Variants,SVs)可改變其生物學(xué)功能. pgPXR有7個SVs,除了最豐富的野生型mRNA亞型(ssPXR.1,DQ531717),ssPXR.2-ssPXR.7均是豬特有的變體,ssPXR.1-ssPXR.6(DQ531716,DQ531-718,DQ531719,DQ531720,DQ53172)由6,7,8和6a外顯子的選擇性剪接獲得,大小分別為853,670,528, 536,422 bp和411 bp.ssPXR.1被翻譯成一個含有421個氨基酸(aa)的多肽,ssPXR.2保留了完整的內(nèi)含子6(144 bp),這導(dǎo)致371個氨基酸蛋白的移碼和截短,ssPXR.3變體有剪切的外顯子6(144 bp),生成截短的275個氨基酸的多肽,ssPXR.4同時剪切外顯子6和8,出現(xiàn)與ssPXR.3相似的275aa后翻譯提前終止.ssPXR.5剪切外顯子6,但保留外顯子6a 3'端的17 bp,從而生成比野生型短42aa的多肽, ssPXR.6變體剪接外顯子5和7,并獲得與預(yù)期相符的298aa的多肽.剪接外顯子2-4獲得含有外顯子3中51 bp內(nèi)含子的ssPXR.7,研究表明,ssPXR.7的出現(xiàn)很可能是轉(zhuǎn)錄錯誤.

pgPXR轉(zhuǎn)錄剪接位置主要分布在外顯子6, 6a,7和8,而人的SVs只涉及外顯子2和外顯子5,通過外顯子之間的對比可確定人和豬PXR基因高序列保守區(qū)域,外顯子3是最保守的外顯子,具有99%的序列同一性.外顯子3編碼DBD,在人和豬PXR中均未被剪接.編碼LBD的外顯子4-8(具有82%序列同一性)和外顯子2(具有94%的序列同一性)在不同種屬中被選擇性剪接,pg?PXR SVs和hPXR SVs均主要位于LBD.在10個 hPXR轉(zhuǎn)錄物中,7個LBD存在缺失,與之相似,5個豬SVs也在LBD中參與剪接.

1.4單核苷酸多態(tài)性與剪接變體相似,豬序列變異單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymor?phism,SNP)也在LBD(外顯子5),pgPXR 727bp和760 bp(密碼子169和180)上被檢測出2個同義變化的SNPs,惟一的非同義多態(tài)性變化的S178L位于PXR特有的a2螺旋上且在PXR混雜配體結(jié)合中發(fā)揮重要作用.S178L分布僅限于個別豬種,導(dǎo)致LBD中胸腺嘧啶/胞嘧啶替換信使密碼子178中亮氨酸與絲氨酸切換,發(fā)生極性氨基酸被非極性氨基酸取代的顯著變化,而LBD的關(guān)鍵區(qū)域中極性的改變可能影響配體的結(jié)合能力.

2　pgPXR的生物學(xué)功能

2.1藥物代謝細(xì)胞色素酶(CYP)是I相代謝酶,參與體內(nèi)外源性物質(zhì)的轉(zhuǎn)化,是藥物代謝的關(guān)鍵酶.PXR是藥物代謝的關(guān)鍵調(diào)控因子,pgPXR參與調(diào)控CYP1A1、CYP1A2、CYP1B1、CYP17A1等細(xì)胞色素酶基因的表達(dá).Nannelli A等通過hPXR強(qiáng)效激動劑RIF誘導(dǎo)CYP3A亞型和CYP2B在豬肝臟、腎臟和氣管中組織特異性的表達(dá)發(fā)現(xiàn)CYP3A22, CYP3A29和CYP3A46在豬肝中高表達(dá),CYP2B22和CYP3As在腎臟中的表達(dá)水平較低,盡管CYP亞科在除肝以外的組織中不易被誘導(dǎo)[7],但CYP2B22在豬腎臟中能被RIF誘導(dǎo)且CYP2B22 mRNA在肺中的水平比腎臟和肝臟都要高.腎臟中CYP2B22誘導(dǎo)機(jī)制與在肝臟中類似,RIF激活PXR-RXR二聚體與HNF4-HNF4同源二聚體,使其結(jié)合CYP2B22啟動子中的多種反應(yīng)元件,誘導(dǎo)CYP2B22基因轉(zhuǎn)錄[8].Xiao wen Li等報道,IFN-a、IFN-y可在轉(zhuǎn)錄水平誘導(dǎo)豬肝臟關(guān)鍵藥物代謝酶CYP3A29基因的表達(dá),pgPXR先于CYP3A29被激活,pgPXR高表達(dá)能增強(qiáng)IFN-a、IFN-y對CYP3A29啟動子的上調(diào),使CYP3A29酶活性升高.如果用RNA抑制劑干擾pgPXR基因表達(dá),CYP3A29啟動子活性也無變化[9].

2.2類固醇激素代謝PXR能被許多內(nèi)源性化合物如孕酮激活,導(dǎo)致參與類固醇相關(guān)代謝的細(xì)胞色素B5A(CYB5A)和細(xì)胞色素b5還原酶1 (CYB5R1),以及羥(17-β)4脫氫酶(HSD17B4)和視黃醇脫氫酶12(RDH12)的表達(dá)增加[10].CYP5A的增加轉(zhuǎn)變細(xì)胞色素P45017A1(CYP17A1)的活性,使CYP17A1結(jié)合細(xì)胞色素B5(CYPB5)形成孕烯醇酮,孕烯醇酮在睪丸中進(jìn)一步生成雄烯酮(5α-androst-16-en-3-one,AND)前體.CYB5R,也稱為NADH-細(xì)胞色素b5的還原酶,可增強(qiáng)CYB5A對CYP17A1的影響[11].AND可轉(zhuǎn)換為3α-AND和3β-AND兩種16雄甾類固醇(16A),PXR介導(dǎo)CYB5R1增加有利于16A的合成.膽汁酸磺基轉(zhuǎn)移酶(SULT2A1)是AND磺酸結(jié)合的關(guān)鍵酶,促使70%以上的AND與磺酸結(jié)合,激活PXR可下調(diào)SULT2A1水平從而降低睪丸中AND磺酸代謝的百分比,維持睪丸中AND的水平.3-甲基吲哚(糞臭素,3MI)作為PXR拮抗劑影響PXR活性,調(diào)節(jié)CYP2B22和CYB5R1的表達(dá),但3MI不影響16A的形成和性類固醇的產(chǎn)生.AND和3MI是公豬異味的主要組成部分.AND和3MI的水平成正相關(guān).CYP2E1參與3MI的代謝,PXR下調(diào)CYP2E1的表達(dá)或直接抑制CYP2E1酶后,3MI代謝對AND呈負(fù)面影響[12-13]. 2.3血腦屏障P-糖蛋白(P-glycoprotein,AB?CB1,MDR1)是血-腦屏障中最突出的轉(zhuǎn)運蛋白,起屏障作用.MDR1和流出轉(zhuǎn)運蛋白限制治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)疾病的藥物穿過血腦屏障滲入中樞神經(jīng)系統(tǒng).Bauer等的研究表明,在多藥耐藥相關(guān)蛋白2(MBP2)和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶協(xié)調(diào)下PXR介導(dǎo)MDR1上調(diào),影響藥物的藥代動力學(xué)和藥效學(xué),降低藥物作用[14]. pgPXR能在豬血腦屏障細(xì)胞中功能性表達(dá),在分子水平,配體結(jié)合引發(fā)PXR從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核,在細(xì)胞核內(nèi)PXR激活I(lǐng)相,II相酶轉(zhuǎn)錄和III相酶轉(zhuǎn)運,從而影響許多藥物的代謝和轉(zhuǎn)運,造成嚴(yán)重的臨床后果.Ott等用hPXR配體RIF和貫葉金絲桃素,嚙齒動物PXR配體PCN激活pgPXR并誘導(dǎo)mRNA,蛋白表達(dá)和MDR1轉(zhuǎn)運活性.用定量PCR法檢測MDR1 mRNA,蛋白印跡檢測MDR1表達(dá),鈣熒光素試驗檢測MDR1轉(zhuǎn)運活性.結(jié)果顯示三者同時增加,這表明pgPXR可調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯.PXR是控制藥物外排轉(zhuǎn)運的關(guān)鍵,對血-腦屏障功能的調(diào)節(jié)和CNS疾病治療具有重要的臨床意義.

3　結(jié)語

pgPXR與hPXR具有95%氨基酸序列相似性,單核苷酸多態(tài)性和選擇性剪接變體能影響pgPXR與配體結(jié)合的能力及其生物學(xué)功能,且pgPXR在配體結(jié)合上與hPXR相似性較高,這充分顯示豬可能是藥物學(xué)和毒理學(xué)研究的最適當(dāng)模型.另外,研究表明,pgPXR在豬體內(nèi)參與多種細(xì)胞色素酶的代謝及類固醇激素代謝,因此,進(jìn)一步探討pgPXR在藥物代謝和動物營養(yǎng)中的作用變得極為關(guān)鍵,并可為提高動物的抗病能力和生產(chǎn)性能提供重要的理論依據(jù)和研究基礎(chǔ).

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S858.28文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

0529-6005(2016)02-0063-03

2015-04-15

謝旖(1991-),女,碩士生,研究方向為動物非傳染性群發(fā)病與動物保健,E-mail:xieyini1991happy@163.com

田亞南,E-mail:yanantian@gmail.com