基金項目:浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃資助項目(2015YB262)。

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應用EP7-A2文件探討溶血對重氮法測定總膽紅素的干擾情況*

*基金項目:浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃資助項目(2015YB262)。

管華玲1，吳健1，王源2，張漢東3△

(1.鹽城市第一人民醫(yī)院檢驗科，江蘇鹽城 224005；2.浙江省中醫(yī)院檢驗科,浙江杭州 310006；

3.鹽城市第三人民醫(yī)院檢驗科,江蘇鹽城 224001)

摘要:目的應用EP7-A2文件評價溶血對臨床總膽紅素測定的干擾。方法依據EP7-A2文件要求的“配對-差異”實驗對干擾物進行確認，并使用“劑量-效應”實驗來分析干擾物濃度與干擾程度之間的關系。結果“配對-差異”實驗結果顯示5 g/L血紅蛋白對A、B兩種總膽紅素試劑均有負干擾，但A試劑盒明顯受溶血干擾程度小；“劑量-效應”實驗結果顯示血紅蛋白對總膽紅素檢測A試劑盒可產生線性負干擾，低值標本的線性方程為Y=-0.146X+14.1，r=0.964，中值標本的線性方程為Y=-0.546X+92.24，r=0.947，高值標本的線性方程為Y=-1.153X+307.2，r=0.979。結論溶血對臨床總膽紅素測定的有線性負干擾，可以利用標本的血紅蛋白濃度對總膽紅素的值進行校正；EP7-A2文件在分析干擾評價方面具有一定的應用價值。

關鍵詞:總膽紅素；重氮法；EP7-A2文件；干擾實驗

人體內的膽紅素大部分來自衰老紅細胞裂解釋放出的血紅蛋白代謝，其對神經系統(tǒng)功能具有嚴重的影響和干擾作用。肝臟是人體重要的代謝器官，對包括膽紅素在內的代謝產物具有強大的處理能力。因此，在臨床中，血清中膽紅素濃度的高低是診斷肝病的重要指標。目前，全自動生化分析儀在絕大多數醫(yī)院得到了使用，其檢測膽紅素的主要方法是重氮試劑法，通過儀器自動比色測定，因此，血標本的溶血、脂濁、黃疸等情況對檢測結果具有很大的影響[1]。本研究擬依據美國臨床實驗室標準化委員會(CLSI)制定的評價方案EP7-A2文件[2-3]，分析和評價溶血對重氮法試劑測定血清總膽紅素的干擾情況。

1材料與方法

1.1材料溶血干擾物(血紅蛋白儲存液)的制備嚴格按照EP7-A2標準程序，采集5 mL肝素抗凝血；離心10 min制備壓積紅細胞；棄掉血漿，加入10 mL等滲鹽水；輕輕顛倒試管10次，離心10 min，棄掉鹽水洗滌液，重復用等滲鹽水洗滌2次；用等體積的蒸餾水稀釋細胞，顛倒試管10次充分混勻，冰凍過夜；解凍細胞，使其恢復至室溫；離心30 min，除去細胞基質，保留上清液(血紅蛋白溶血液)，除掉紅細胞碎片；測定溶血液的血紅蛋白濃度為125 g/L。

1.2儀器與試劑(1)儀器。檢測采用雅培公司生產的Architect ci8200全自動生化免疫分析儀，其生化部分的膽紅素檢測方法為重氮試劑法，通過儀器自動比色測定。(2)試劑。總膽紅素測定(重氮鹽法)試劑盒(A試劑批號為41174UQ04；B試劑批號為93035HW00)，校準品為雅培公司提供的生化多項校準品，室內質控品為美國Bio-Rad公司生產的液體多項質控(水平2、3)。

1.3方法

1.3.1總膽紅素測定的主要參數A、B試劑盒測定的方法均為一點終點法，測光點分別為20～22和31～33，主/副波長均為548 nm/604 nm。兩個試劑盒使用的標本、R1試劑量、R2試劑量分別為，A試劑盒：2.6、160、40 μL，B試劑盒：5、160、40 μL。

1.3.2基礎標本的制備選取無溶血、無黃疸、無脂濁的本院健康體檢者的新鮮混合血清作為低值標本；采用無溶血、無脂濁的膽紅素中度升高的患者混合血清作為中值標本；采用無溶血、無脂濁的膽紅素重度升高患者混合血清為高值標本。

1.3.3對照標本和干擾標本的制備溶血干擾標本為1 920 μL 基礎標本加入80 μL血紅蛋白儲存液，其血紅蛋白濃度為5 g/L；對照標本為1 920 μL基礎標本加入80 μL生理鹽水。

1.3.4“劑量-效應”標本的配制及分析依據EP7-A2文件的要求，制備5個濃度的干擾測試標本，來確定1個線性的劑量效應關系。0濃度標本和1濃度標本按1.3.3要求制備的對照標本和干擾標本，并以此為基礎按不同比例配成5種測試混合液，見表1。在同一分析批之內檢測5種測試混合液，第1組按照升序測定各標本，第2組按降序測定，第3組按照升序，以降低系統(tǒng)漂移對檢測的影響。

表1　　“劑量-效應”標本的配制

2結果

2.1溶血對總膽紅素的干擾對測得的干擾標本和對照標本的結果進行數據分析，并根據1.2.6中的公式進行干擾判斷，可見血紅蛋白濃度為5 g/L時，溶血對A、B試劑盒的檢測均有負性干擾，但A試劑盒抗干擾能力明顯優(yōu)于B試劑盒。見表2。

表2　　干擾標本和對照標本的測定結果與干擾判斷

2.2溶血對總膽紅素檢測干擾的“劑量-效應”分析對A試劑盒進行劑量效應分析，不同濃度的血紅蛋白對總膽紅素測定產生的負干擾呈線性，低值標本的線性方程為Y=-0.146X+14.1，r=0.964；中值標本的線性方程為Y=-0.546X+92.24，r=0.947；高值標本的線性方程為Y=-1.153X+307.2，r=0.979。干擾效應結果見表3，“劑量-效應”回歸分析圖分別見圖1～3(見《國際檢驗醫(yī)學雜志》網站主頁“論文附件”)。

表3　　溶血對總膽紅素檢測的干擾劑量效應結果

3討論

在臨床工作中，血清總膽紅素測定是了解人體肝臟功能的重要指標之一，特別是當膽紅素濃度顯著升高時，常常反映人體肝臟有嚴重的細胞損傷；另外，在區(qū)分新生兒生理性、病理性黃疸時，血清總膽紅素亦是主要指標之一。有研究者認為，在使用重氮法檢測膽紅素時，標本輕度溶血對檢測結果沒有明顯的干擾，但當標本嚴重溶血時可使測定值低于實際值，其原因可能是血紅蛋白與重氮試劑反應形成的產物可破壞偶氮膽紅素，還可被亞硝酸氧化為高鐵血紅蛋白而干擾吸光度測定[5-6]。溶血是常見的影響檢測結果的分析前原因，新生兒采血比較困難，更易導致標本溶血，因此評價血紅蛋白對總膽紅素的分析干擾是有重要臨床意義的。EP7-A2文件是干擾評價的標準方法，該文件對臨床實驗室中各種檢測方法、儀器以及各種類型標本都有較好的適用，可用于分析臨床多種可疑干擾物。依據EP7-A2文件，可先利用“配對-差異”方法來確認疑似干擾物是否對該檢測項目的測定產生干擾，如果發(fā)現(xiàn)有干擾，則可以利用“劑量-效應”方法進一步評價干擾物濃度與干擾程度之間的相互關系[7-8]。

定了高、中、低值3個組。本實驗應用EP7-A2文件建議的血紅蛋白儲存液對A、B兩種總膽紅素檢測試劑盒在3個膽紅素濃度水平進行可“配對-差異”分析，可知血紅蛋白液對兩種試劑均具有負干擾，但由實驗數據可知A明顯較B試劑盒受溶血干擾程度小，更具臨床應用價值。本實驗對總膽紅素檢測A試劑盒進行了“劑量-效應”分析，可知在低、中、高3個膽紅素濃度，總膽紅素的測定值與血紅蛋白濃度間具有良好的相關性，因此，對于一些嚴重溶血的標本，總膽紅素的檢測值應為假性降低，可以本實驗得出的線性方程，計算出總膽紅素的真實值。

當然，EP7-A2文件也有其自身的局限性。在臨床工作中，干擾常常來自于多種干擾物，而目前仍沒有一種有效的試驗方法可以同時鑒別所有的干擾物[9]。另外，一方面溶血的干擾可以降低總膽紅素檢測的數值，另一方面當嚴重溶血產生的未結合膽紅素可以導致標本中總膽紅素濃度增高，而最終總膽紅素的測定結果是否會偏高，有待進一步的研究。所以醫(yī)務人員應充分了解造成溶血的原因，在采集、處理標本的過程中，盡量避免溶血，為臨床提供準確的診斷依據。

另外，在臨床生物化學分析中，可以根據EP7-A2文件，利用已經上市使用的試劑盒，應用醫(yī)學統(tǒng)計軟件，對其他檢測項目進行干擾評價，這樣可以給臨床和患者提供更加可靠的檢驗結果。

參考文獻

[1]許曉文．溶血對血清總膽紅素測定方法的影響[J]．吉林師范大學學報：自然科學版，2004(2)：107-111.

[2]Clinical and Laboratory Standards Institute.EP7-A Interference testing in clinical chemistry[S].Wayne,PA,USA:CLSI,2002.

[3]Clinical and Laboratory Standards Institute.EP7-A2 Interference Testing in Clinical Chem istry,Approved Guideline-Second Edition[R].Wayne,PA,USA:CLSI,2005.

[4]姚少羽，劉一鳴，喻雄文，等．應用EP7-A2文件評價脂濁對淀粉酶的干擾及其定量化[J]．中山大學學報：醫(yī)學科學版，2008，29(4S)：109-111.

[5]朱忠勇．實用醫(yī)學檢驗學[M].北京：人民軍醫(yī)出版社，1997．408-415．

[6]安崇文，曹晨影，焦莉莉，等．4種總膽紅素檢測系統(tǒng)的性能評價[J]．臨床檢驗雜志，2014，32(3)：230-235.

[7]Bossuyt x,Blanckaert N.Evaluation of interference in rate and fixed-time nephelometic assays of specific serum proteins[J].Clin Chem.,1999,45(1):62-67.

[8]孫虹，牛華，趙崇吉，等.膽紅素、血紅蛋白和乳糜微粒對生化檢測結果的干擾評價[J]．國際檢驗醫(yī)學雜志，2011,32(21)：2509-2512.

[9]徐建華，何敏，柯培鋒，等．CLSI EP7-A2文件在臨床化學分析干擾試驗中的應用評價[J]．檢驗醫(yī)學，2010，25(12)：971-974.

·論著·

Application of EP7-A2 document for investigating interference of hemolysis on total

bilirubin detection by diazonium method*

GuanLinghua1,WuJian1,WangYuan2,ZhangHandong3△

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,YanchengMunicipalFirstPeople′sHospital,Yancheng,

Jiangsu224005,China;2.DepartmentofClinicalLaboratory,JiangsuProvincialHospitalofChinese

Medicine,Hangzhou,Jiangsu310006,China;3.DepartmentofClinicalLaboratory,Yancheng

MunicipalThirdPeople′sHospital,Yancheng,Jiangsu224001,China)

Abstract:ObjectiveTo apply EP7-A2 document for evaluating the interference of hemolysis the total bilirubin detection in clinic.MethodsThe interferent was affirmed according to the "paired-difference" test required by the EP7-A2 document.The relation between interferent concentration and interference degree was analyzed by using the "dose-effect" test.ResultsThe "paired-difference" test results showed that 5.00 g/L hemoglobin had negative interference effect on two kinds of total bilirubin reagents.But the reagent kit A had little interference degree of hemolysis;The dose-effect test results showed that hemoglobin produced the linear negative interference effect on the reagent kit A of total bilirubin detection.The linear equation of low value sample was Y=-0.146X+14.1,r=0.964,which of middle value sample was Y=-0.546X+92.24,r=0.947 and which of high value sample was Y=-1.153X+307.2,r=0.979.ConclusionHemolysis has a negative interference effect on total bilirubin detection in clinic.The total bilirubin value could be corrected by using the hemoglobin concentration of sample;the EP7-A2 document has certain application value in the aspect of analyzing interference and evaluation.

Key words:total bilirubin;diazonium method;EP7-A2 document;interference test

收稿日期：(2015-05-08)

文獻標識碼：

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2015.24.007A

文章編號：1673-4130(2015)24-3525-03

通訊作者△，E-mail：piaoxue1982717@sina.com。

作者簡介：管華玲，女，副主任技師，主要從事臨床檢驗基礎的研究。