基金項(xiàng)目:江西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20114BAB215031)；江西省衛(wèi)生廳科技計(jì)劃項(xiàng)目(20141152)。

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CRLF2實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用*

*基金項(xiàng)目:江西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20114BAB215031)；江西省衛(wèi)生廳科技計(jì)劃項(xiàng)目(20141152)。

付晶晶，李紅△，易麗君，樂(lè)萍，黃慧

(江西省兒童醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，江西南昌 330006)

摘要:目的建立人細(xì)胞因子受體樣因子2(CRLF2)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法。方法設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增目的基因CRLF2及管家基因ABL，將純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆，經(jīng)菌落PCR篩選并測(cè)序鑒定后，提取重組質(zhì)粒DNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度換算成copies/mL濃度，稀釋制備成質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線觀察靈敏度和線性范圍，同時(shí)對(duì)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)估。初步應(yīng)用該方法檢測(cè)10例健康兒童和10例急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)初診兒童的骨髓單個(gè)核細(xì)胞CRLF2水平。結(jié)果CRLF2 PCR產(chǎn)物具有單一特異的熔解曲線；標(biāo)準(zhǔn)品的線性檢測(cè)范圍為103～108copies/mL；質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品反復(fù)凍融 3 次仍舊穩(wěn)定；臨床標(biāo)本的 CRLF2 水平均在標(biāo)準(zhǔn)品線性檢測(cè)范圍。結(jié)論該實(shí)驗(yàn)室建立的 CRLF2 實(shí)時(shí)定量 PCR 檢測(cè)方法具有良好的特異性、線性范圍和穩(wěn)定性，可應(yīng)用于臨床 ALL 兒童 CRLF2 基因的定量檢測(cè)。

關(guān)鍵詞:實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)；急性淋巴細(xì)胞白血??；細(xì)胞因子受體樣因子2；質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品

盡管新化療藥物及聯(lián)合化療方案應(yīng)用，使得兒童急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL) 無(wú)事件生存率取得長(zhǎng)足進(jìn)步，但仍有 20% 患兒對(duì)化療不敏感或因化療過(guò)度導(dǎo)致復(fù)發(fā)或第二腫瘤發(fā)生。因此，尋找與預(yù)后相關(guān)的分子靶標(biāo)進(jìn)行分層治療和療效評(píng)估，將有益于進(jìn)一步提高兒童 ALL 的治愈率[1]。對(duì)細(xì)胞因子受體樣因子2(CRLF2)的臨床研究發(fā)現(xiàn)，ALL 兒童骨髓單個(gè)核細(xì)胞(BMMC)中 CRLF2 高表達(dá)水平與預(yù)后不良相關(guān)[2]。因此，本實(shí)驗(yàn)組擬建立 CRLF2 的實(shí)時(shí)定量 PCR(RQ-PCR)檢測(cè)方法，用于ALL兒童 CRLF2 基因檢測(cè)，為診斷兒童ALL和個(gè)體化治療提供理論依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料健康對(duì)照組及ALL兒童的BMMC及臨床信息由本院中心實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本庫(kù)提供，兒童年齡1~15歲，中位數(shù)3.2歲，所有標(biāo)本取材均獲兒童監(jiān)護(hù)人知情許可。

1.2引物設(shè)計(jì)根據(jù)Genbank中人的CRLF2和ABL基因序列，選擇保守區(qū)用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物，經(jīng)Blast驗(yàn)證后交由上海英駿公司合成。目的基因CRLF2 上游引物：5′-GTT CAG TAC CGG AGC CCC TTC-3′，下游引物：5′-GTT TGG GAG GCG TTG GTG TC-3′，預(yù)計(jì)擴(kuò)增長(zhǎng)度為232 bp；內(nèi)參基因ABL上游引物：5′-TCA TCA CCA CGC TCC ATT AT-3′，下游引物：5′-CAC CGT CAG GCT GTA TTT CT-3′，預(yù)計(jì)片段長(zhǎng)度為178 bp 。

1.3儀器與試劑低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；-80 ℃超低溫冰箱、Nanodrop2000(美國(guó)Thermo Fisher公司)；熒光定量 PCR儀(美國(guó)ABI公司)；凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó)Bio rad公司)。Ficoll淋巴細(xì)胞分離液(北京索萊寶公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Tag酶(美國(guó)Promega公司)；Trizol、瓊脂糖粉、Platinum?SYBR?Green qPCR Super Mix-UDG試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒(美國(guó)OMEGA公司)；pEASY-T1 Simple TA克隆試劑盒(北京全式金公司)；E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞為本室自制?；驕y(cè)序由上海英駿公司完成。

1.4方法

1.4.1骨髓BMMC cDNA合成參照文獻(xiàn)[3]和試劑說(shuō)明書(shū)，提取健康對(duì)照組及ALL兒童BMMC總RNA后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，放置-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備以健康對(duì)照組BMMC cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。內(nèi)參ABL擴(kuò)增條件為：94 ℃，5 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s 35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；CRLF2擴(kuò)增條件為：94 ℃，5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s 35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。 PCR產(chǎn)物切膠回收純化后進(jìn)行 TA 克隆。將菌落PCR陽(yáng)性的單克隆菌擴(kuò)增提取質(zhì)粒，送測(cè)序鑒定。構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒測(cè)定濃度后用TE緩沖液10倍梯度稀釋至102copies/mL，分裝后放置-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作將梯度稀釋的CRLF2和ABL標(biāo)準(zhǔn)品按照優(yōu)化后的RQ-PCR條件進(jìn)行定量檢測(cè)，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，并設(shè)置無(wú)模板對(duì)照(NTC)3管。PCR反應(yīng)結(jié)束后，結(jié)合熔解曲線進(jìn)行分析，觀察產(chǎn)物特異性。記錄標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率、截距以及相關(guān)系數(shù)，觀察線性范圍。

1.4.4質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品穩(wěn)定性試驗(yàn)將分裝放置在-20 ℃保存的質(zhì)粒反復(fù)凍融3次，選用107、105、103copies/mL即高、中、低三個(gè)濃度同一批次質(zhì)粒進(jìn)行組內(nèi)試驗(yàn)，不同批次質(zhì)粒進(jìn)行組間試驗(yàn)，驗(yàn)證質(zhì)粒的穩(wěn)定性。

1.4.5臨床標(biāo)本檢測(cè)檢測(cè)10例健康對(duì)照兒童和10例ALL初診兒童BMMC cDNA CRLF2 水平，每份標(biāo)本同步測(cè)定內(nèi)參基因ABL，測(cè)定3個(gè)復(fù)孔；ABL Ct值大于35視為標(biāo)本不合格，數(shù)據(jù)棄用；每個(gè)基因設(shè)定3管NTC；選用107、105、103copies/mL作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線自動(dòng)得到標(biāo)本CRLF2、ABL的絕對(duì)定量水平，再以 CRLF2/ABL 絕對(duì)表達(dá)量比值為該標(biāo)本的CRLF2相對(duì)表達(dá)水平。

2結(jié)果

2.1PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳以健康對(duì)照組BMMC cDNA為模板，定性PCR擴(kuò)增管家基因ABL和目的基因CRLF2，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳觀察到與預(yù)計(jì)大小相符的單一條帶，見(jiàn)圖1(見(jiàn)《國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站主頁(yè)“論文附件”)。

2.2重組質(zhì)粒測(cè)序鑒定篩選重組子質(zhì)粒送往測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與Genbank 公布序列一致的重組質(zhì)粒分別命名為pEASY-T1-Simple-ABL、pEASY-T1-Simple -CRLF2。測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖2(見(jiàn)《國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站主頁(yè)“論文附件”)。

2.3RQ-PCR方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.3.1特異性分析從熔解曲線可見(jiàn)，管家基因和目的基因都僅出現(xiàn)產(chǎn)物單峰，ABL 熔解溫度為89.0 ℃，CRLF2熔解溫度為85.1 ℃，說(shuō)明引物特異性強(qiáng)，無(wú)非特異性擴(kuò)增。見(jiàn)圖3(見(jiàn)《國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站主頁(yè)“論文附件”)。

2.3.2線性范圍結(jié)果顯示，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品在103～108copies/mL濃度間具有良好相關(guān)性。ABL標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為-3.65，R=0.999 9；CRLF2標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為-3.64，R=0.999 2，見(jiàn)圖4(見(jiàn)《國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站主頁(yè)“論文附件”)。

2.3.3穩(wěn)定性分析分析結(jié)果可見(jiàn)，標(biāo)準(zhǔn)品批內(nèi)CV值均小于3.0%，批間CV值均小于4.0 %，NTC陰性，證實(shí)標(biāo)準(zhǔn)品及本方法的重復(fù)性良好，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　　ABL/CRLF2標(biāo)準(zhǔn)品批內(nèi)及批間重復(fù)性試驗(yàn)

-：無(wú)數(shù)據(jù)。

2.4臨床標(biāo)本檢測(cè)應(yīng)用本系統(tǒng)檢測(cè)臨床標(biāo)本，所有標(biāo)本均在標(biāo)準(zhǔn)品的線性范圍，ALL組CRLF2相對(duì)表達(dá)水平顯著高于健康對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖5(見(jiàn)《國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站主頁(yè)“論文附件”)。

3討論

CRLF2參與正常淋巴細(xì)胞的成熟與分化。2009年Russell等[4]首次報(bào)道CRLF2異常高表達(dá)可能是造成ALL發(fā)生的直接機(jī)制。I-Ming等[5]發(fā)現(xiàn)有17.5% ALL兒童存在由CRLF2基因異位、缺失、突變?cè)斐傻氖д{(diào)性高表達(dá)，Harvey等[6-7]多中心臨床研究報(bào)道CRLF2高表達(dá)在ALL高危組中為預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，應(yīng)予以高度重視。因此，作為一個(gè)潛在判斷ALL預(yù)后的分子標(biāo)志物，CRLF2定量檢測(cè)已引起ALL臨床應(yīng)用研究的重視。本研究組將CRLF2納入本院ALL分子診斷平臺(tái)建設(shè)體系中，希望建立優(yōu)良穩(wěn)定的CRLF2基因定量檢測(cè)方法，為臨床ALL兒童的個(gè)體化治療預(yù)后判斷提供參考。

相對(duì)探針?lè)ǘ裕琒YBR Green I染料法性?xún)r(jià)比高且操作簡(jiǎn)便，因而應(yīng)用更為廣泛，但由于SYBR Green I能與任何雙鏈DNA結(jié)合，因此需要優(yōu)化反應(yīng)體系并結(jié)合熔解曲線分析以確保反應(yīng)特異性[9]。本研究小組建立的CRLF2 RQ-PCR檢測(cè)方法經(jīng)一系列評(píng)估實(shí)驗(yàn)顯示：本方法特異性強(qiáng)，線性范圍廣，熒光信號(hào)與擴(kuò)增Ct值相關(guān)系數(shù)大于0.999，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)反復(fù)凍融3次后，批內(nèi)及批間變異系數(shù)均低于4%，證明該方法完全符合實(shí)驗(yàn)要求，可應(yīng)用于臨床CRLF2檢測(cè)。筆者將該建立的方法初步應(yīng)用于健康及ALL兒童的臨床標(biāo)本檢測(cè)，所有樣本的CRLF2 mRNA水平均在標(biāo)準(zhǔn)品線性范圍內(nèi)，因此本方法具有特異性強(qiáng)，可行性好的特點(diǎn)，完全符合檢測(cè)要求。

綜上所述，本研究成功建立了CRLF2基因RQ-PCR檢測(cè)方法，為ALL兒童個(gè)體化診療和CRLF2轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究提供了參考工具。

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·論著·

Establishment and preliminary application of real time PCR assay for quantitative detection of CRLF2*

FuJingjing,LiHong△,YiLijun,YuePing,HuangHui

(CentralLaboratory,JiangxiProvincialChildren′sHospital,Nanchang,Jiangxi330006,China)

Abstract:ObjectiveTo establish a real-time quantitative PCR method for the detection of cytokine receptor-like factor 2(CRLF2) expression.MethodsSpecific primers amplification target gene CRLF2 and housekeeping genes ABL were designed,the purified PCR products were performed the TA cloning.After bacterial colony PCR screening and sequencing,then the recombinant plasmids DNA was extracted and measured by using UV spectrophotometer and converted to copies/mL concentration.Finally it was diluted for preparing the plasmid standard substance,then the standard curve was drawn for observing the sensitivity and linear rang,meanwhile the stability of the plasmid DNA was evaluated.This method was initially applied to detect the CRLF2 level of bone marrow mononuclear cells in 10 cases of healthy children and 10 cases of newly diagnosed acute lymphoblastic leukemia(ALL).ResultsCRLF2 PCR product had a single specific melting curve;the linear detection range of the standard substance was 103 - 108 copies / ml;the plasmid standard substance by freeze-thawing for 3 times remained stable;the CRLF2 level of clinical sample was within the linear detection range of standard substance.ConclusionThe real-time quantitative PCR method for CRLF2 established by our laboratory has good specificity,linearity range and stability,which can be applied to the quantitative detection of CRLF2 gene in clinical ALL children.

Key words:real-time quantitative polymerase chain reaction;cytokine receptor-like factor 2;acute lymphoblastic leukemia;plasmid standard substance

收稿日期：(2015-05-08)

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2015.24.005A

文章編號(hào)：1673-4130(2015)24-3520-03

通訊作者△，E-mail:icemade@hotmail.com。

作者簡(jiǎn)介：付晶晶，女，主管檢驗(yàn)技師，主要從事兒童白血病分子診斷及耐藥機(jī)制研究。