李 嬌，祖立闖，王金良，2，苗立中，2，李 峰，2，沈志強(qiáng)，2（.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600）

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豬細(xì)小病毒病的診斷與防治研究進(jìn)展

李 嬌1，祖立闖1，王金良1，2，苗立中1，2，李 峰1，2，沈志強(qiáng)1，2
（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600）

摘 要：豬細(xì)小病毒是可以感染母豬和仔豬的一種病毒性傳染病，該病毒可以引起母豬的繁殖障礙，流產(chǎn)和產(chǎn)死胎及木乃伊胎，仔豬腹瀉和皮炎。該病毒在豬場(chǎng)經(jīng)常發(fā)生感染，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。通過(guò)綜述豬細(xì)小病毒的臨床診斷和分子生物學(xué)診斷及防治研究進(jìn)展，旨在為疾病的預(yù)防和控制提供參考。

關(guān)鍵詞：豬細(xì)小病毒??；診斷；防治；研究進(jìn)展

豬細(xì)小病毒(PPV)屬于細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬，為單股正鏈DNA病毒，豬細(xì)小病毒病發(fā)病率和感染率都很高，污染的飼料，飲水，食物都可以傳播病毒[1]。該病的發(fā)生季節(jié)性不明顯，一般每年的夏、春、秋三季都易感染發(fā)病[2]。該病的診斷包括臨床診斷和分子生物學(xué)診斷，該病的防治措施建議以疫苗免疫和加強(qiáng)飼養(yǎng)管理為主，現(xiàn)將豬細(xì)小病毒病的診斷與防制方法簡(jiǎn)要介紹如下。

1　?臨床初步診斷

豬細(xì)小病毒感染可以引起母豬不孕，產(chǎn)死胎及木乃伊胎，懷孕母豬表現(xiàn)為不明原因流產(chǎn)，死胎有皮下出血及水腫，胸腹腔有黃色滲出液，肝脾腎腫大。仔豬表現(xiàn)皮炎和腹瀉。

2　?常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法

常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法包括免疫熒光、病毒分離、血凝抑制實(shí)驗(yàn)等。

2.1免疫熒光

免疫熒光是很直接和特異的豬細(xì)小病毒檢測(cè)方法，將豬細(xì)小病毒的組織病料1∶3比例加入滅菌生理鹽水，用研磨器研磨成組織勻漿，反復(fù)凍融3次，12 000 r/min離心取上清液，用濾器過(guò)濾除菌，取少量病毒濾液加到PK-15細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)過(guò)程中觀察細(xì)胞病變，及時(shí)更換細(xì)胞液，培養(yǎng)6 d左右，將細(xì)胞反復(fù)凍融3次，離心取細(xì)胞上清液，取少量上清液再次接種PK-15細(xì)胞培養(yǎng)瓶，同樣方法盲傳3代，培養(yǎng)2～3 d進(jìn)行病毒直接免疫熒光抗體實(shí)驗(yàn)。通過(guò)鏡檢觀察，出現(xiàn)豬細(xì)小病毒特異性熒光的為陽(yáng)性，否則為陰性。該方法特異性強(qiáng)，敏感性高，但實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)，不適合快速診斷。

2.2病毒分離

病毒分離是疾病診斷過(guò)程中很重要的一種方法，病毒處理過(guò)程同上，通過(guò)接種細(xì)胞，觀察病變特征等進(jìn)行疾病診斷，該方法同樣實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，但在疾病的診斷過(guò)程中發(fā)揮很重要的作用。國(guó)內(nèi)劉秀芬等[3]利用ST細(xì)胞培養(yǎng)，分離到一株豬細(xì)小病毒，該病毒通過(guò)在ST-細(xì)胞上盲傳6代開(kāi)始出現(xiàn)細(xì)胞病變，呈現(xiàn)圓縮、融合、拉網(wǎng)等明顯有規(guī)律的細(xì)胞病變，盲傳到12代開(kāi)始對(duì)豚鼠紅細(xì)胞有血凝作用，該研究為豬細(xì)小病毒的分離提供參考。Wu R等[4]分離到一株新型豬細(xì)小病毒，該病毒從臨床送檢的豬肺組織中檢出，通過(guò)對(duì)病毒基因組的測(cè)序和序列分析，證明該毒株與現(xiàn)有的豬細(xì)小病毒處于不同分支，該新型豬細(xì)小病毒的分子流行病學(xué)調(diào)查有待深入研究。

2.3血凝抑制實(shí)驗(yàn)

由于豬細(xì)小病毒具有血凝性，可以凝集人O型血和豚鼠紅細(xì)胞，利用病毒的這一特性可以進(jìn)行血凝抑制實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)行疾病診斷。通過(guò)特異性的豬細(xì)小病毒陽(yáng)性血清與豬細(xì)小病毒中和而產(chǎn)生血凝抑制，該方法敏感性不高，不能作為疾病診斷的唯一方法，可以在疾病的診斷過(guò)程中提供參考。

3　分子生物學(xué)診斷方法

豬細(xì)小病毒的分子生物學(xué)診斷方法包括常規(guī)的PCR檢測(cè)方法，熒光定量PCR檢測(cè)方法，LAMP檢測(cè)方法，現(xiàn)簡(jiǎn)要介紹如下。

3.1PCR檢測(cè)方法

PCR檢測(cè)方法是豬細(xì)小病毒檢測(cè)最常用的方法，但普通的PCR檢測(cè)方法敏感性不顯著，國(guó)內(nèi)崔宇超等[5]建立了豬細(xì)小病毒的高效納米PCR檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法比普通的PCR檢測(cè)方法敏感性提高1000倍，最低核酸檢出量為4拷貝/μL，利用該檢測(cè)方法檢測(cè)其他豬病毒核酸，檢測(cè)結(jié)果均為陰性，說(shuō)明該檢測(cè)方法有很好的特異性，分別采用納米PCR和普通PCR對(duì)3個(gè)省份送檢的43份臨床樣品檢測(cè)，PPV陽(yáng)性率分別為95 %和72 %，說(shuō)明納米PCR檢測(cè)方法有更高的敏感性，更適合PPV低含量臨床樣品的檢測(cè)。

3.2熒光定量PCR檢測(cè)方法

熒光定量PCR檢測(cè)方法具有很高的敏感性，但所需的儀器設(shè)備及檢測(cè)試劑均較貴，一般用于病毒的精確定量研究。劉崇靈等[6]建立了豬細(xì)小病毒的SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，檢測(cè)不同接毒條件對(duì)病毒增殖效果的影響。結(jié)果表明，ST細(xì)胞覆蓋率接近單層時(shí)接毒，采用分步接毒法，接種病毒后感作2 h，接毒后細(xì)胞維持液中血清濃度設(shè)為2 %可以提高PPV細(xì)胞培養(yǎng)的病毒滴度。鄧蘭蘭等[7]建立了豬細(xì)小病毒與豬偽狂犬病毒(PRV)的二重SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，對(duì)豬細(xì)小病毒和豬偽狂犬病毒檢測(cè)的靈敏度分別達(dá)到248拷貝/μL和160拷貝/μL，是普通PCR檢測(cè)方法的100倍，實(shí)現(xiàn)了兩種病毒的同時(shí)檢測(cè)，能夠?qū)RV和PPV混合感染的臨床病料進(jìn)行快速診斷。Gava D等[8]建立了新型豬細(xì)小病毒(PPV4)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，選取PPV4保守的ORF3基因設(shè)計(jì)檢測(cè)引物，該熒光PCR檢測(cè)方法最低可以檢出9.5X10拷貝DNA/μL，與其他的豬病毒沒(méi)有交叉反應(yīng)，有很好特異性，用該檢測(cè)方法檢測(cè)272份樣品，陽(yáng)性率為13.2%，比普通PCR方法敏感10倍，該熒光PCR檢測(cè)方法可以作為新型豬細(xì)小病毒的臨床樣品檢測(cè)方法，用于豬群的流行病學(xué)調(diào)查。

3.3LAMP檢測(cè)方法

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)是一種恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)具有特異性高，敏感性好，操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)快速，成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，結(jié)果判定直接用肉眼觀察，比較直觀。陳星瑤等[9]建立了豬細(xì)小病毒的LAMP檢測(cè)方法，針對(duì)豬細(xì)小病毒的VP2基因設(shè)計(jì)特異性檢測(cè)引物，通過(guò)反應(yīng)條件的優(yōu)化，最終確定LAMP反應(yīng)溫度可以選擇60 ℃、62 ℃、64 ℃、66 ℃中任一溫度，LAMP反應(yīng)的擴(kuò)增時(shí)間為45 min，在60 ℃反應(yīng)條件下45 min最低可以檢出10個(gè)拷貝的模板，與其他豬病病毒沒(méi)有交叉反應(yīng)，有很好的特異性。豬細(xì)小病毒LAMP檢測(cè)方法為豬細(xì)小病毒的診斷提供了一種簡(jiǎn)單、快速、敏感、便捷的檢測(cè)方法，適用于豬細(xì)小病毒的臨床檢測(cè)，具有良好的應(yīng)用前景。

4　?防治

豬細(xì)小病毒的綜合防控以預(yù)防措施為主，包括定期消毒和疫苗免疫接種，做好養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境衛(wèi)生，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理等。

4.1疫苗免疫接種

豬細(xì)小病毒的疫苗有很多種，包括滅活疫苗，基因工程亞單位疫苗，基因工程活載體疫苗等。各種疫苗各有優(yōu)缺點(diǎn)，按照各自的免疫要求及時(shí)免疫接種，一般都能起到免疫保護(hù)作用。確保疫苗的質(zhì)量，應(yīng)使用獸醫(yī)主管部門(mén)推薦或國(guó)家定點(diǎn)專(zhuān)業(yè)生物制品廠生產(chǎn)的疫苗，疫苗的運(yùn)輸、保存和使用均應(yīng)在低溫條件進(jìn)行，嚴(yán)防日曬和高溫。注射部位應(yīng)消毒，注射要確實(shí)，嚴(yán)禁用大號(hào)、短針頭注射和打飛針，避免注射部位過(guò)淺和劑量不足，不能漏注少注。定期進(jìn)行血清學(xué)抗體監(jiān)測(cè)、排除母源抗體干擾，隨時(shí)掌握豬群的免疫抗體水平，依據(jù)抗體監(jiān)測(cè)結(jié)果制定科學(xué)合理的免疫程序并不斷調(diào)整，使豬群有整齊、保持高效價(jià)的抗體水平。

4.2加強(qiáng)飼養(yǎng)管理和環(huán)境衛(wèi)生

良好的環(huán)境衛(wèi)生是防止豬細(xì)小病毒病暴發(fā)的前提條件，及時(shí)清理豬舍中糞便、污水，定期做好圈舍消毒，且應(yīng)經(jīng)常更換或交替使用消毒藥物，避免產(chǎn)生耐藥性。飼料要合理搭配，配制全價(jià)平衡日糧，可配合應(yīng)用一些中草藥飼料添加劑也具有抗菌抗病毒的作用，禁止飼喂霉變飼料。飲水要保持新鮮、清潔。建立檔案管理制度，對(duì)每頭種豬、每一批仔豬從出生到出售均應(yīng)獨(dú)立建檔，并作好記錄，歸檔保存。

5　?結(jié)語(yǔ)

豬細(xì)小病毒病的診斷與防治是一項(xiàng)綜合性的系統(tǒng)工程，隨著我國(guó)規(guī)模化養(yǎng)殖的快速發(fā)展，動(dòng)物疫病多種病原的混合感染與繼發(fā)感染日益嚴(yán)重，給獸醫(yī)臨床診斷增加了難度，對(duì)于豬細(xì)小病毒病的診斷，筆者建議應(yīng)結(jié)合自身實(shí)驗(yàn)室的試驗(yàn)條件與優(yōu)勢(shì)選擇一種或二種實(shí)驗(yàn)室診斷方法對(duì)臨床疑似病例進(jìn)行確診。對(duì)于豬細(xì)小病毒病的防治，筆者建議應(yīng)采取加強(qiáng)飼養(yǎng)管理和環(huán)境衛(wèi)生，確保疫苗免疫效果為主的預(yù)防措施。總之，豬細(xì)小病毒病的診斷與防治中，只有采取早預(yù)防、早發(fā)現(xiàn)、早確診、早治療、早淘汰的綜合性診治方法，才能逐步實(shí)現(xiàn)豬細(xì)小病毒病凈化，提高養(yǎng)豬生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)效益。

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(收稿日期：2015-07-30)

作者簡(jiǎn)介：李嬌，女，遼寧人，碩士，助理研究員，主要從事動(dòng)物疫病診斷及疫苗研究

基金項(xiàng)目：山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（SDAIT-06-022-15）