鐘良瑞，林　霜，魏克民

(1.浙江中醫(yī)藥大學附屬省立同德醫(yī)院，浙江 杭州　310012；2.浙江省中醫(yī)藥研究院，浙江 杭州　310007)

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三葉青黃酮抗肺癌作用研究

鐘良瑞1，林霜1，魏克民2

(1.浙江中醫(yī)藥大學附屬省立同德醫(yī)院，浙江 杭州310012；2.浙江省中醫(yī)藥研究院，浙江 杭州310007)

摘要：目的研究三葉青黃酮對肺癌A549細胞增殖抑制和侵襲轉(zhuǎn)移作用及其機制。方法采用MTT法檢測三葉青黃酮對A549細胞增殖的抑制作用；集落形成試驗檢測三葉青黃酮對A549細胞抗癌活性的影響；劃痕試驗檢測三葉青黃酮對細胞遷移力的影響；Transwell實驗檢測三葉青黃酮對A549細胞侵襲力變化；Western blot法檢測MMP-2、MMP-9、TIMP-2等侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達水平。結(jié)果三葉青黃酮抑制A549細胞增殖程度與用藥濃度、時間呈正相關(guān)；隨著藥物濃度的增高，細胞集落形成的數(shù)量明顯減少,細胞向劃痕區(qū)的遷移速度不斷減慢；穿過Transwell小室的侵襲細胞亦明顯減少；MMP-2、MMP-9蛋白表達逐漸降低，TIMP-2蛋白表達升高，呈濃度依賴性。結(jié)論三葉青黃酮能夠抑制肺癌A549細胞的侵襲轉(zhuǎn)移，可能與降低MMP-2、MMP-9蛋白表達有關(guān)。

關(guān)鍵詞：三葉青；抑制；A549細胞；增殖；侵襲轉(zhuǎn)移；MMP

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，嚴重危害人類的健康。盡管相關(guān)臨床治療方面研究取得重大進展，但其預后仍不理想。腫瘤轉(zhuǎn)移是治療失敗的主要原因之一，臨床上近一半患者在確診時已是晚期，并發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移[1]。因此,抑制轉(zhuǎn)移的新藥開發(fā)具有重要意義。

三葉青為葡萄科崖爬藤屬植物三葉崖爬藤(TetrastigmahemsleyanumDielset)，又名蛇附子、三葉對、金絲吊葫蘆等。塊根或全草入藥，可清熱解毒、祛風化痰、活血止痛，用于高熱驚厥、肺炎、哮喘、咽痛、肝炎、風濕等癥[2-3]?？鼓[瘤方面的作用也越來越受關(guān)注。三葉青對腫瘤細胞的凋亡作用有較多前期研究[4-5]，但其對腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移方面的研究尚未見報道。本研究探討三葉青黃酮(radix tetrastigma hemsleyani flavone, RTHF)對肺癌A549細胞侵襲轉(zhuǎn)移的抑制作用，為三葉青進一步開發(fā)和臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1材料

1.1細胞株A549細胞株由浙江省醫(yī)學科學院提供，由浙江中醫(yī)藥大學實驗室培養(yǎng)傳代，實驗中所用為生長狀況良好的細胞。

1.2藥品與試劑三葉青購自浙江省中醫(yī)藥研究院，由浙江省中藥新藥研發(fā)重點實驗室提取制備。Hyclone胎牛血清；RPMI 1640培養(yǎng)液：杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司。Transwell小室：美國Corning公司；Matrigel膠：美國BD公司。MMP-2、MMP-9、TIMP-2：美國CST公司。

1.3儀器3111型CO2細胞培養(yǎng)箱：美國Thermo公司；3001型酶標儀：美國Thermo公司；蛋白印記檢測系統(tǒng)：美國Bio-Rad公司；IX71型倒置顯微鏡：日本OLYMPUS公司。

2方法

2.1細胞培養(yǎng)培養(yǎng)液均為含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)條件為37℃、含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)。待細胞長滿瓶底后，胰酶消化，分瓶培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

2.2MTT檢測抑制率取對數(shù)生長期的A549細胞，計數(shù)細胞密度為5×107·L-1的細胞懸液，每孔100 μL細胞懸液接種于96孔板，貼壁后更換培養(yǎng)液并加不同濃度三葉青黃酮(0、0.5、1、5、10 g·L-1)分5組，每組6復孔；分別在24、48、72 h檢測，570 nm為檢測波長，統(tǒng)計每組各孔吸光度OD值。根據(jù)公式：抑制率/%=(1-加藥組OD值/對照組OD值)×100%，計算三葉青黃酮對A549細胞的抑制率。

2.3集落形成實驗A549細胞以1 000個/孔密度接種于6孔板內(nèi)，貼壁后加不同濃度三葉青黃酮(0、1、5、10 g·L-1)，于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10 d。經(jīng)多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色10 min，蒸餾水充分清洗，在顯微鏡下對含50個細胞以上的克隆進行計數(shù)，并用相機對6孔板拍照。

2.4劃痕試驗檢測細胞遷移力將A549細胞接種于6孔板內(nèi)培養(yǎng)，待細胞基本長滿，用200 μL槍頭于細胞層中縱向劃痕，造成培養(yǎng)細胞缺損區(qū)域帶，加入不同濃度的三葉青黃酮(0、1、5、10 g·L-1)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，倒置顯微鏡下觀察劃痕處細胞的覆蓋情況。

2.5Transwell侵襲實驗檢測A549細胞的侵襲力將Matrigel膠鋪到transwell上室。A549細胞(2×104個細胞/孔)懸浮于含不同濃度三葉青黃酮(0、1、5、10 g·L-1)的無血清培養(yǎng)基中并接種在上室；下室中加含10%胎牛血清的培養(yǎng)基作為趨化，5% CO2、37℃孵育16 h，培養(yǎng)結(jié)束時，用棉簽擦去上室上面的非侵襲細胞和Matrigel膠，經(jīng)多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色。顯微鏡下計數(shù)細胞，取均值。

2.6Western blot檢測侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白冰上操作，快速刮下細胞，移至1.5 mL離心管。每瓶細胞加250～500 μL RIPA裂解液，1 200 r·min-1離心5 min，收獲蛋白，測定蛋白濃度。用SDS-PAGE電泳分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，一抗室溫孵育2～3 h，二抗室溫孵育1 h。室溫下，ECL混合液滴加在PVDF膜上，避光反應(yīng)3～5 min，放入蛋白印記檢測系統(tǒng)的暗箱內(nèi)，在暗室中，曝光、顯影，以β-actin作為內(nèi)參進行分析。

3結(jié)果

3.1三葉青黃酮對A549細胞增殖的影響不同濃度三葉青黃酮作用不同時間后，A549細胞的增殖抑制率見Tab1，各濃度對A549細胞有明顯的抑制作用，隨著藥物濃度的增加、時間延長，其抑制作用逐步增強，呈明顯的濃度、時間-效應(yīng)關(guān)系。各組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

3.2三葉青黃酮對A549細胞生長影響與空白對照組比較，隨藥物濃度增加，細胞集落數(shù)量明顯減少，與MTT結(jié)果相符(Fig 1)。

A:Control group;b:1 g·L-1;c:5 g·L-1;d:10 g·L-1

3.3三葉青黃酮對A549細胞遷移力的影響與對照組比較，24 h時各組劃痕區(qū)均出現(xiàn)不同程度的變窄；隨著藥物濃度的增高，A549細胞向劃痕區(qū)的遷移速度不斷減慢，10 g·L-1組細胞劃痕區(qū)變窄不明顯?？梢娙~青黃酮抑制A549細胞的遷移存在一定的劑量依賴性(Fig 2)。

3.4三葉青黃酮對A549細胞侵襲力的影響隨三葉青黃酮濃度增加，侵襲的細胞明顯減少，呈一定濃度依賴性。與對照組比較，三葉青黃酮1 g·L-1時侵襲A549細胞減少到65%，10 g·L-1時細胞減少到39%，差異有顯著性(Fig 3)。結(jié)果表明，三葉青黃酮可明顯抑制A549細胞侵襲轉(zhuǎn)移。

**P<0.01vscontrol goup

A：Control group；B：1 g·L-1；C：5 g·L-1；D：10 g·L-1

3.5三葉青黃酮對A549細胞MMP-2、MMP-9和TIMP-2蛋白表達水平的影響不同濃度三葉青黃酮處理A549細胞48 h后，與空白對照組相比，隨著藥物劑量增加，MMP-2、MMP-9蛋白表達逐漸降低；TIMP-2蛋白逐漸升高，差異明顯(Fig 4)。

A：Control group；B：1 g·L-1；C：5 g·L-1；D：10 g·L-1

4討論

腫瘤治療失敗的主要原因之一是轉(zhuǎn)移，控制轉(zhuǎn)移是決定患者預后的關(guān)鍵因素之一。腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生包括細胞增殖、黏附、侵襲等方面，機制復雜[6]。目前中藥的抗癌機制研究受到關(guān)注，在促進凋亡、抑制增殖、侵襲轉(zhuǎn)移等方面已取得突破。三葉青具有清熱解毒、祛風化痰、活血化瘀、抗炎鎮(zhèn)痛等作用；抗腫瘤方面亦具有良好治療效果。因此，本實驗深入研究三葉青抗肺癌的機制具有重要意義。

本實驗通過體外實驗MTT證實：三葉青黃酮能抑制人肺癌細胞株A549的增殖，且具有濃度、時間依賴性。藥物濃度為10 g·L-1、作用時間72 h時，對細胞的抑制率最高，表明三葉青黃酮能夠明顯抑制肺癌細胞的增殖。腫瘤轉(zhuǎn)移過程中，腫瘤細胞穿過細胞外基質(zhì)是腫瘤細胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié)[7]；腫瘤細胞的侵襲有賴于細胞遷移能力的強弱。本研究通過劃痕實驗，顯示三葉青黃酮能夠抑制肺癌A549細胞的遷移，且與濃度呈正相關(guān)性。在顯微鏡下觀察經(jīng)結(jié)晶紫染色后穿透Transwell小室的A549細胞數(shù)量，隨著三葉青黃酮濃度增加，細胞數(shù)量明顯減少，差異有顯著性。本研究證實三葉青黃酮可以明顯抑制A549細胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移。

腫瘤細胞中存在多種蛋白水解酶降解細胞外基質(zhì)(ECM)[8]，金屬蛋白酶家族(MMPs)在細胞外基質(zhì)降解，促進腫瘤細胞遷移和轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[9],其中MMP-2和MMP-9是腫瘤細胞分泌的兩個主要的蛋白酶[10]。有研究證實，抑制MMP-2可明顯抑制胃癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移[11]。MMP-9可特異性降解細胞外基質(zhì)中的IV型膠原，在細胞侵襲和遷移中起到重要作用。TIMPs是內(nèi)源性抑制劑，能阻斷MMPs的活性。MMPs和TIMPs之間的平衡決定MMP總體活性。TIMPs的過表達被證實可減少轉(zhuǎn)移，TIMP-1和TIMP-2分別與MMP-9和MMP-2有很高的親和力[12]。研究發(fā)現(xiàn)，TIMP-2的高表達能抑制體內(nèi)和體外內(nèi)皮細胞和腫瘤細胞的侵襲[13-14]。本實驗通過Western blot檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，隨三葉青黃酮濃度增加，MMP-2和MMP-9蛋白表達降低，TIMP-2蛋白表達增加，提示三葉青黃酮通過調(diào)節(jié)MMPs抑制A549細胞侵襲轉(zhuǎn)移。

綜上所述，三葉青黃酮對肺癌A549細胞具有抑制增殖和侵襲轉(zhuǎn)移作用。通過降低MMP-2和MMP-9蛋白，增強TIMP-2蛋白表達可能是其調(diào)節(jié)機制之一。

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Inhibitory effects of Radix Tetrastigma Hemsleyani Flavone on growth and invasion of lung carcinoma cells

ZHONG Liang-rui1，LIN Shuang1，WEI Ke-min2

(1.TongDeHospitalofZhejiangProvince,AffiliatedHospitalofZhejiangChineseMedicalUniversity,Hangzhou310012,China;2.ZhejiangAcademyofTraditionalChineseMedicine,Hangzhou310007,China)

Key words:Radix Tetrastigma Hemsleyani; inhibition; A549 cell; proliferation; metastasis; MMP

Abstract：AimTo study the effect of Radix Tetrastigma Hemsleyani Flavone(RTHF) on the proliferation and invasion in lung carcinoma A549 cells as well as the possible mechanisms underlying these processes.MethodsA549 cells were treated with different concentrations of RTHF for different time. MTT assay and colone formation assay were used to detect the ability of cell proliferation. Wound healing methods and transwell chamber assay were adopted to determine cell migration and invasion. Western blotting assay was used to detect the expression of metastasis-related proteins MMP-2, MMP-9, and TIMP-2.ResultsRTHF obviously suppressed the proliferation of A549 cells in a dose-and time-dependent manner. Microscope found an apparent decrease of cells in the denude zone of cell migration and transwell testing results show that the treatment of invasion was significantly lower than the proportion in the control group(P<0.01). The protein expressions of MMP-2 and MMP-9 were down-regulated and that of TIMP-2 was up-regulated in a dose-dependent manner.ConclusionRTHF inhibits the growth and invasion of lung carcinoma A549 cells, which might be achieved by down-regulating the expressions of MMP-2 and MMP-9 protein.

收稿日期:2015-12-20,修回日期:2016-02-12

基金項目：國家自然科學基金資助項目(No 81541084);浙江省自然科學基金資助項目(No LQ15H290006)

作者簡介：鐘良瑞(1982-)，男，博士，主治醫(yī)師，腫瘤學,E-mail: julary@163.com; 魏克民(1938-)，男，研究員，教授，博士生導師，通訊作者，E-mail: wkmcyzy@163.com

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.04.008

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1978(2016)04-0480-04

中國圖書分類號：R284.1；R329.24；R734.202.2；R979.1；R977.6

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-3-18 11:22網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160318.1122.016.html