劉　芳　羅　臻　黃靜敏　蘭全學(xué)（深圳市計(jì)量質(zhì)量檢測研究院　廣東深圳　518131）

致病性蠟樣芽胞桿菌的研究進(jìn)展

劉芳羅臻黃靜敏蘭全學(xué)
（深圳市計(jì)量質(zhì)量檢測研究院廣東深圳518131）

概述了蠟樣芽胞桿菌的生物學(xué)特性、致病性及其檢測方法，并探討各種檢測方法的優(yōu)點(diǎn)和局限性。有助于對食品中蠟樣芽孢桿菌污染進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評估，為食品安全風(fēng)險(xiǎn)管理提供依據(jù)。

蠟樣芽胞桿菌；致病性；檢測

1　前言

在我國，細(xì)菌性微生物是導(dǎo)致食源性疾病發(fā)生的主要病因，嚴(yán)重危及人們的健康，成為目前較為突出的公共衛(wèi)生問題之一，每年我國食源性致病菌導(dǎo)致數(shù)千萬人次發(fā)病，由此造成的損失巨大。我國的主要食源性致病菌包括沙門氏菌（Salmonella）、志賀氏菌（Shigella）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、溶血性鏈球菌（Streptococcus hemolyticus）、大腸埃希氏菌O157（Escherichia coli O157）、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）等。其中，蠟樣芽胞桿菌引發(fā)的食物中毒問題越來越受到人們的關(guān)注。蠟樣芽胞桿菌是芽孢桿菌屬的一種革蘭氏陽性菌，兼性需氧，廣泛分布于土壤、灰塵和污水中，也是食品中常見污染菌和條件致病菌［1］。少量攝入蠟樣芽胞桿菌不會引起食物中毒，只有其在食物中成指數(shù)生長才會產(chǎn)生腸毒素。一般認(rèn)為蠟樣芽胞桿菌引起的食物中毒屬毒素型食物中毒。

2　蠟樣芽胞桿菌的生物學(xué)特性

蠟樣芽胞桿菌菌體大小為 （1.0 μm-1.2 μm）× （3.0 μm-5.0 μm），芽孢呈橢圓形，在營養(yǎng)肉湯中32℃培養(yǎng)3 d后，芽孢形成率在90%以上，80℃-85℃水浴5 min-10 min可刺激芽孢萌發(fā)；最高生長溫度35℃-45℃，最低生長溫度10℃-20℃，10℃以下和63℃以上不繁殖，65℃-70℃菌體易死去；最適生長pH為4.3-9.3；在葡萄糖洋菜上生長的菌落細(xì)胞含有復(fù)紅不著色的小球，不產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)蛋白晶體［2］；在普通瓊脂上形成的菌落較大，灰白色、不透明，表面粗糙似毛玻璃狀或融蠟狀，邊緣常呈擴(kuò)展?fàn)?；甘露醇卵黃多粘菌素瓊脂培養(yǎng)基上菌落為粉紅色、周圍有白色的沉淀環(huán)［3］；蠟樣芽孢桿菌能夠發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸，不發(fā)酵阿拉伯糖、木糖和甘露醇，有運(yùn)動性，可還原硝酸鹽，分解酪氨酸，厭氧時可利用葡萄糖，過氧化氫酶試驗(yàn)、卵黃反應(yīng)、V-P反應(yīng)呈陽性，能產(chǎn)生卵磷脂酶和酪蛋白酶［4］。

3　蠟樣芽孢桿菌的致病性

在細(xì)菌性食物中毒事件中，由蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒比較常見。早在1973年，Bulyba等人就報(bào)道了污染蠟樣芽孢桿菌的乳制品引起食物中毒［5］。1994-2003年十年內(nèi)，國內(nèi)報(bào)道的蠟樣芽孢桿菌食物中毒共47起，其中食物中毒進(jìn)食人數(shù)2541人，中毒者1758人，發(fā)病率69.19%，但是無一人死亡［6］。據(jù)2008-2010年我國突發(fā)公共衛(wèi)生事件報(bào)告管理信息系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)，我國細(xì)菌性食物中毒中，由蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒在發(fā)生起數(shù)和發(fā)病人數(shù)方面均居前三位［7］。

蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒臨床表現(xiàn)為發(fā)病急，來勢猛，主要癥狀為惡心、嘔吐和腹瀉。蠟樣芽胞桿菌是條件致病菌，主要是通過產(chǎn)生腹瀉毒素和嘔吐毒素導(dǎo)致食物中毒，偶見菌體感染引起眼疾、心內(nèi)膜炎、腦膜炎和菌血癥等疾?。?］。食品中蠟樣芽孢桿菌數(shù)量超過105CFU/g時即可導(dǎo)致嘔吐和腹瀉，嘔吐的主要原因是某些菌株代謝產(chǎn)生了熱穩(wěn)定的嘔吐毒素，而腹瀉與蠟樣芽孢桿菌分泌的各種腸毒素有關(guān)［8］。嘔吐毒素是一種環(huán)形肽，分子量為1 153.38 u，在126℃加熱90 min和在pH 2-12的條件下仍有活性，主要中毒癥狀為惡心、嘔吐，伴有腹瀉、頭暈、發(fā)燒和四肢無力等癥狀，與金黃色葡萄球菌引發(fā)的食物中毒現(xiàn)象類似，中毒的潛伏期一般為0.5 h-6 h，一般限于富含淀粉質(zhì)的食品，特別是米飯。腹瀉毒素是一種分子量在38000 u-46000 u之間的蛋白質(zhì)，56℃下加熱5 min失活，遇到胰蛋白酶或胃蛋白酶失活，有抗原性；中毒癥狀類似于產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌（Clostridium perfringens）食物中毒現(xiàn)象：水樣腹瀉、腹部痙攣和疼痛，嘔吐很少見。常因食用肉類、海鮮、乳品和蔬菜等食物引起，潛伏期一般為6 h-15 h，一般持續(xù)24 h［9-11］。

蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒可分為嘔吐型和腹瀉型兩類［12］，主要毒力因子包括：與嘔吐毒素相關(guān)的非核糖體多肽合成酶系（NRPS）基因［13］；與腹瀉毒素相關(guān)的溶血素 BL基因 （hblA、hblB、hblC和hblD）、非溶血性腸毒素Nhe基因 （nheA、nheB和nheC）、腸毒素 FM 基因 （entFM）、腸毒素T基因（bceT）和細(xì)胞毒素K基因 （cytK）［14］。hblA、hblB、hblC、hblD基因可以編碼相應(yīng)蛋白 HblA、HblB、HblC、HblD；nheA、nheB、nheC編碼相應(yīng)蛋白NheA、NheB、NheC；bceT和cytK基因分別編碼腸毒素T和細(xì)胞毒素K。

4　蠟樣芽胞桿菌檢測方法的國內(nèi)外研究現(xiàn)狀

目前，國內(nèi)外對于蠟樣芽孢桿菌的檢測方法，主要有生化檢測方法、PCR技術(shù)、免疫學(xué)技術(shù)等。

4.1生化檢測方法

生化檢測方法原理是通過目標(biāo)菌生長過程中產(chǎn)生的酶和代謝物的生化反應(yīng)判斷是否為蠟樣芽孢桿菌。生理生化試驗(yàn)一般涉及葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、改良V-P試驗(yàn)、L-酪氨酸分解試驗(yàn)、溶菌酶試驗(yàn)、動力試驗(yàn)、溶血試驗(yàn)、蛋白毒素結(jié)晶試驗(yàn)等［15-16］。GERVASYM等［17-18］利用反向被動乳膠凝集試驗(yàn)（RPLA）檢測食品中的蠟樣芽孢桿菌；黃訓(xùn)端等［19］利用VITEK自動鑒定系統(tǒng)鑒定了草莓蠟樣芽孢桿菌，并與分子生物學(xué)的驗(yàn)證結(jié)果一致，表明VITEK的可靠性和準(zhǔn)確性。生化檢測方法的優(yōu)點(diǎn)是技術(shù)成熟、易操作，標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法在微生物實(shí)驗(yàn)室易推廣，耗材成本低，對人員技術(shù)要求不高。

然而，生化檢測方法操作步驟繁瑣，檢測周期長，商品化鑒定試劑盒的應(yīng)用雖然可以縮短檢測周期，但高額的成本不利于應(yīng)用推廣［4］。另外，生化檢測方法無法檢測毒力基因，對蠟樣芽孢桿菌致病性無法進(jìn)行評估［20］。

4.2基于PCR的檢測方法

PCR檢測技術(shù)特異性強(qiáng)，靈敏度高，近年來在食源性致病菌檢測方面得到了廣泛應(yīng)用。王振國［21］等分別通過擴(kuò)增gyrB與hblA基因?qū)崿F(xiàn)對蠟樣芽孢桿菌的快速檢測。VESAM等［22］發(fā)現(xiàn)，通過PCR篩選HblA基因檢測蠟樣芽孢桿菌方法比RPLA更快；BJARNE M H等［23］建立了利用PCR技術(shù)區(qū)分蠟樣芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌的方法。由于蠟樣芽孢桿菌毒力基因的多樣性和個體差異性，不能通過單一毒力因子的檢測判定其致病因子，普通PCR技術(shù)有一定局限性。

多重PCR（mPCR）技術(shù)能滿足同時擴(kuò)增多種DNA序列的需要，與普通PCR相比，更加快速、準(zhǔn)確和靈敏度高，能夠高效地檢測編碼多重毒素的蠟樣芽孢桿菌。Dzieciol等［24］針對蠟樣芽孢桿菌gyrB、16S rRNA和編碼嘔吐毒素的基因ces構(gòu)建了mPCR體系，成功檢測出人工污染牛奶中產(chǎn)嘔吐毒素和不產(chǎn)毒蠟樣芽孢桿菌，檢測限達(dá) 1.91×103CFU/mL；Wehrle等［25］利用溶血素基因 hbl、非溶血素基因 nhe和細(xì)胞毒素基因 cytK設(shè)計(jì)引物構(gòu)建 mPCR，對引起腹瀉的蠟樣芽孢桿菌進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示所檢測的108份食物樣品中有14份被產(chǎn)腸毒素蠟樣芽孢桿菌污染；Yang等［26］利用5種不同的產(chǎn)腸毒素基因和一種產(chǎn)嘔吐毒素基因共設(shè)計(jì)了12對引物，構(gòu)建了的 mPCR方法檢測出蠟樣孢桿菌所有已知毒素基因；蔣培余等［27］通過設(shè)計(jì)引物和探針，優(yōu)化反應(yīng)條件，建立多重實(shí)時PCR，檢測蠟樣芽孢桿菌16S rRNA保守區(qū)基因及其ces基因（編碼致嘔毒素cereulide）與菌株鑒定結(jié)果的符合率為100%，蠟樣芽孢桿菌的 ces基因檢測結(jié)果也與普通 PCR結(jié)果相符。mPCR能檢測到食品中產(chǎn)毒素和不產(chǎn)毒素的蠟樣芽孢桿菌，在實(shí)際檢測中具有較強(qiáng)應(yīng)用價(jià)值。然而由于mPCR涉及到多對引物和不同模板，所以在實(shí)驗(yàn)初期要對反應(yīng)體系的條件進(jìn)行優(yōu)化，檢測時間較長。

熒光定量PCR（qPCR）檢測技術(shù)與常規(guī)PCR相比，更加快速準(zhǔn)確，重復(fù)性好，且能定量，可用于產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌引起食物中毒的快速鑒定。artinez等［28］以磷脂酰膽堿特異性磷脂酶C基因（pcplc）為靶基因首次對食品中活的蠟樣芽孢桿菌進(jìn)行了qPCR定量檢測，在人工污染的液態(tài)蛋樣品中檢測限能達(dá)到1.1×104CFU/mL；Lim等［29］針對groEL和ces設(shè)計(jì)引物和探針，分別特異性檢測不產(chǎn)和產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌，在純培養(yǎng)物中的檢測限均為1.0×100CFU/反應(yīng)，并能準(zhǔn)確檢測豆醬樣品中的產(chǎn)毒和不產(chǎn)毒蠟樣芽孢桿菌；Hansen等［30］用hblA、hblC、hblD、nheA、nheB、nheC和bceT為目的基因設(shè)計(jì)引物，采用qPCR技術(shù)對63株產(chǎn)腸毒素蠟樣芽孢桿菌的毒素基因分布進(jìn)行了分析；王紅［31］等通過qPCR技術(shù)檢測34株疑似蠟樣芽孢桿菌溶血素基因，33株均為陽性，符合率為97.1%?？焖?、靈敏及準(zhǔn)確定量的特點(diǎn)使qPCR技術(shù)對食物中食源性致病菌進(jìn)行定量檢測的應(yīng)用更加廣泛。

4.3免疫學(xué)檢測技術(shù)

免疫學(xué)檢測方法主要是酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA），具有檢測時間短、成本低、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。Day等［32］在1994年首次利用ELISA法對蠟樣芽孢桿菌的致腹瀉型腸毒素進(jìn)行檢測；CHEN CH等［33］報(bào)道了用蛋白印記技術(shù)（Colony Blot Immunoassay CBI）快速檢測蠟樣芽抱桿菌的方法；Wehrle等［25］利用蠟樣芽孢桿菌的特異性抗體對產(chǎn)腸毒素蠟樣芽孢桿菌的Hbl-L2、NheA、NheB和NheC進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法不適用于蠟樣芽孢桿菌的檢測。利用抗體的方法雖然檢測速度較快，但易產(chǎn)生交叉反應(yīng)。另外，區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞需要針對特征性蛋白制備抗體，難度較大，對檢測人員的技術(shù)水平要求較高，并且檢測結(jié)果的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性相對較低。

5　結(jié)語

目前蠟樣芽孢桿菌污染問題已是家庭飲食及公共餐飲業(yè)存在的一個主要的問題。有報(bào)道的蠟樣芽孢桿菌引發(fā)的食物中毒，多是和人們生活息息相關(guān)的食品。乳制品、蒸煮的米飯和炒飯、調(diào)味料、糧食制品、豆制品、肉制品、烘焙食品等食品都易發(fā)生蠟樣芽孢桿菌引發(fā)的食物中毒。一般而言，該菌在食品中大于105CFU/g時，即可能引起食物中毒，這進(jìn)一步提高了對食品的安全性要求。并非所有蠟樣芽孢桿菌都具有致病性，只有部分菌株攜帶了與致病性相關(guān)的毒力基因，才會導(dǎo)致食源性疾病，因此對這些致病性菌株的毒力基因分布特征進(jìn)行研究具有十分重要的意義。

現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)中蠟樣芽孢桿菌檢測方法費(fèi)時費(fèi)力、勞動強(qiáng)度大、檢驗(yàn)成本高，因此急需建立致病性蠟樣芽孢桿菌的快速檢測體系，探索其毒力因子分布特征，有效彌補(bǔ)國內(nèi)相關(guān)檢測標(biāo)準(zhǔn)的不足，為食品安全監(jiān)管以及臨床診斷提供可靠的手段。而且，了解食品中蠟樣芽孢桿菌主要毒力基因型，有助于食品中蠟樣芽孢桿菌的風(fēng)險(xiǎn)評估，為食品安全風(fēng)險(xiǎn)管理提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)；對于建立和完善細(xì)菌性食源性疾病監(jiān)測和預(yù)警系統(tǒng)，增強(qiáng)對細(xì)菌性食源性疾病暴發(fā)的反應(yīng)和預(yù)警能力，降低細(xì)菌性食源性疾病的發(fā)生率起著重要的作用。

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Research Progress of Pathogenic Bacillus Cereus

LIU Fang，LUO Zhen，HUANG Jingmin，LAN Quanxue
（Shenzhen Academy of Metrology&Quality Inspection，Shenzhen，Guangdong，518131）

Biologicalcharacteristics，pathogenicityanddetectionmethodsofBacilluscereusare introduced.Theadvantagesandlimitationsofeachdetectionmethodsarediscussed.Thispaper contributes to risk evaluation and administration of B.cereus contamination in food.

Bacillus cereus；Pathogenicity；Detection

TS207.4

E-mail：4275777@qq.com

2015-07-17