王 勇 高 斌 賀克武

金納米粒子生物毒性的研究進(jìn)展

王 勇 高 斌 賀克武

納米復(fù)合物；金；毒性；綜述

金納米材料（gold nanoparticles，GNPs）是最穩(wěn)定的貴金屬納米材料之一，納米級(jí)別的金納米材料具有宏觀金粒子所不具備的物理性質(zhì)，如量子效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)、光學(xué)效應(yīng)等。金納米材料的形式表現(xiàn)多種多樣，如球形、星形、棒狀、殼狀等，在免疫檢測(cè)、細(xì)胞成像、光熱治療、放療增敏等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景［1-3］。然而，由于納米材料與常規(guī)物質(zhì)的理化性質(zhì)不同，其生物安全性越來越受到重視。國內(nèi)外研究顯示，將一些正常物質(zhì)由微米級(jí)制作成納米級(jí)后，即可能具有潛在的生物毒性。因此，重視金納米技術(shù)的安全問題，在組織、細(xì)胞及基因?qū)用嫦到y(tǒng)性地評(píng)估金納米粒子的應(yīng)用與風(fēng)險(xiǎn)非常關(guān)鍵。

1 金納米粒子在組織的分布

大量金納米粒子與小鼠的實(shí)驗(yàn)研究表明，金納米粒子可廣泛存在于小鼠各器官組織中（表1）［4-8］，如肝臟、腎臟、脾臟、肺、心臟、腦、睪丸、骨骼、肌肉等。這些金納米粒子經(jīng)各種途徑進(jìn)入小鼠各器官與組織后，與各器官組織、細(xì)胞和生物分子接觸，可能會(huì)產(chǎn)生多種潛在的生物效應(yīng)，對(duì)小鼠的健康產(chǎn)生影響。Sonavane等［7］研究發(fā)現(xiàn)，15～50 nm的金納米粒子可以通過小鼠血-腦屏障進(jìn)入腦組織并積累。Zhang等［9］在實(shí)驗(yàn)研究中使用13.5 nm的金納米粒子經(jīng)灌胃法喂養(yǎng)小鼠14 d［2.2 mg/（kg·d）］，在血液及骨髓細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)了金納米粒子的分布。

2 金納米材料的細(xì)胞毒性

2.1 金納米粒子尺寸對(duì)細(xì)胞毒性的影響 既往實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，金納米粒子的尺寸與毒性之間具有依賴關(guān)系：金納米粒子尺寸越小，對(duì)細(xì)胞的毒性越強(qiáng)。Pan等［10］報(bào)道相對(duì)于15 nm的金納米粒子，1.4 nm金納米粒子對(duì)結(jié)締組織成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞有更大的細(xì)胞毒性。Liu等［11］指出5 nm的金納米粒子可以阻滯肺癌A549細(xì)胞株的細(xì)胞增殖，而20 nm與40 nm的金納米粒子則沒有這種阻滯效果。Abdelhalim［12］將10 nm、20 nm、50 nm的金納米粒子經(jīng)腹腔注入小鼠體內(nèi)后飼養(yǎng)3 d或7 d，發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞出現(xiàn)代謝及結(jié)構(gòu)障礙、心肌細(xì)胞的改變與心肌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)液化、慢性炎癥細(xì)胞等作用有關(guān)。該實(shí)驗(yàn)中心肌細(xì)胞的改變與金納米粒子的尺寸與時(shí)間具有依賴關(guān)系：金納米粒子的尺寸越小、接觸時(shí)間越長(zhǎng)，心肌的改變程度越明顯。在此基礎(chǔ)上，Abdelhalim等［13］又發(fā)現(xiàn)10 nm、20 nm、50 nm金納米粒子使小鼠肝細(xì)胞在慢性炎癥細(xì)胞的作用下出現(xiàn)水腫、脂肪變性、肝血竇擴(kuò)張充血等改變，而且所用金納米粒子的尺寸和接觸時(shí)間均影響肝細(xì)胞改變的程度。同時(shí)，金納米粒子可能存在一個(gè)最佳的細(xì)胞吸收尺寸，Chithrani等［14］報(bào)道，Hela細(xì)胞對(duì)14 nm、50 nm金納米粒子的吸收能力因金納米粒子的尺寸不同而產(chǎn)生差異，金納米粒子的飽和濃度也不同，并發(fā)現(xiàn)50 nm金納米粒子能被Hela細(xì)胞最有效吸收。

Cardoso等［15］將10 nm、30 nm金納米粒子與生理鹽水均按70 μg/kg注入小鼠體內(nèi)，24 h或28 d后采用斬首法處死全部小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠急性或慢性攝入金納米粒子均對(duì)腦皮質(zhì)DNA有損傷作用，小鼠急性攝入金納米粒子（24 h）后，30 nm金納米粒子組對(duì)小鼠腦皮質(zhì)的損傷作用高于10 nm金納米粒子組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。這一研究表明金納米粒子的細(xì)胞毒性可能是金納米粒子的多種理化性質(zhì)和所作用的細(xì)胞系共同決定的，尺寸影響細(xì)胞對(duì)金納米粒子的吸收能力和飽和濃度，并不能決定其細(xì)胞毒性。

【作者單位】 安徽醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院介入科 安徽合肥 230061

2.2 金納米粒子濃度對(duì)細(xì)胞毒性的影響金納米粒子的濃度也是其影響細(xì)胞功能的一個(gè)重要因素，其可能原因是粒子濃度增多，大量粒子進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，破壞了亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能及細(xì)胞的增殖、運(yùn)動(dòng)和形態(tài)［16］。Ajdary等［17］將濃度為25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L的金納米粒子（平均為10 nm）置入小鼠體內(nèi)14 d（注射法劑量為0.3 ml/d，灌胃法劑量為0.2 ml/d），取小鼠血樣本及腎臟組織。腎臟病理分析發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，低濃度組（25 mg/L）小鼠腎實(shí)質(zhì)和腎髓質(zhì)表現(xiàn)正常，腎小體中腎小球與腎小囊顯示明顯；中濃度組（50 mg/L）中腎皮質(zhì)改變明顯，腎小囊消失，腎小球仍然可見；高濃度組（100 mg/L）中，腎皮質(zhì)與腎小體均消失，小體周圍毛細(xì)血管網(wǎng)擴(kuò)張。Pernodet等［18］將不同濃度（0.2、0.4、0.6、0.8 mg/ml）的檸檬酸包覆的金納米粒子（14 nm）與人真皮成纖維細(xì)胞相互作用，發(fā)現(xiàn)真皮成纖維細(xì)胞增殖數(shù)量與濃度成反比；電子顯微鏡下進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，隨著金納米粒子濃度增高，盡管不同濃度組細(xì)胞中肌動(dòng)蛋白數(shù)量仍基本相同，但是肌動(dòng)蛋白的直徑卻越來越小，表明金納米粒子能作用于肌動(dòng)蛋白的表達(dá)，影響細(xì)胞增殖、運(yùn)動(dòng)和黏附能力。

2.3 金納米粒子不同形狀及表面修飾對(duì)細(xì)胞毒性的影響金納米粒子的形狀可以影響其細(xì)胞毒性。Favi等［19］使用多分枝星形金納米粒子［AuNSTs，（33.69±8.45）nm］與裸露的球形金納米粒子［AuNSPs，（61.46±4.28）nm］作用于人皮膚成纖維細(xì)胞和鼠脂肪墊內(nèi)皮細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)AuNSPs濃度達(dá)到40 μg/ml時(shí)對(duì)兩種細(xì)胞均有致死作用，而AuNSTs濃度達(dá)到400 μg/ml時(shí)對(duì)兩種細(xì)胞的毒性作用仍弱于AuNSPs濃度。但是該實(shí)驗(yàn)并不能完全說明金納米粒子不同形狀對(duì)細(xì)胞毒性有差異性的影響。尺寸影響細(xì)胞對(duì)粒子的細(xì)胞吸收能力，而該實(shí)驗(yàn)所用的兩種金納米粒子直徑并不相同。

金納米粒子的表面經(jīng)不同生物分子修飾后，具有特定的功能，可以應(yīng)用于不同環(huán)境中。因?yàn)榻鸺{米粒子進(jìn)入生物體內(nèi)通常均經(jīng)過表面修飾，故表面修飾物可能會(huì)影響其生物利用率。Zeng等［20］研究二氧化硅包覆的金納米粒子（GNSs）與裸露的金納米棒（GNRs）在不同表面配體作用［檸檬酸與十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）修飾］下對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞增殖和形態(tài)的影響，在濃度為0.625 pmol/L、CTAB-GNSs 與CA-GNSs尺寸為45 nm時(shí)，CTAB-GNSs使細(xì)胞生存率減少了60.9%，細(xì)胞毒性明顯；而檸檬酸修飾的GNSs（CAGNSs）幾乎無細(xì)胞毒性。CTAB-GNSs的半抑制濃度（IC50）為0.5 pmol/L，明顯低于CA-GNSs的IC50（200 pmol/L）。Niidome等［21］在Hela細(xì)胞研究中采用MMT分析發(fā)現(xiàn)，CTAB-GNRs濃度為0.5 mmol/L有很大的細(xì)胞毒性，細(xì)胞死亡率為80%；用聚乙醇修飾劑代替CTAB后，細(xì)胞存活率為95%。上述結(jié)果表明，金納米粒子表面修飾物的不同對(duì)細(xì)胞的增殖和形態(tài)的影響具有差異性。

2.4 金納米粒子產(chǎn)生細(xì)胞毒性的機(jī)制 一般認(rèn)為粒子經(jīng)內(nèi)吞作用被細(xì)胞攝取后積聚在核內(nèi)體或溶酶體，但是目前對(duì)金納米粒子產(chǎn)生細(xì)胞毒性的機(jī)制尚不明確。由于金納米粒子形狀不同、尺寸大小、表面修飾物的種類甚至表面zeta電位及作用細(xì)胞類型不同等，均可能導(dǎo)致細(xì)胞毒性產(chǎn)生的機(jī)制有差異。金納米粒子的細(xì)胞毒性機(jī)制可能是由于其可以引起細(xì)胞中自噬小體的表達(dá)和積聚，溶酶體功能障礙，活性氧和活性氮的產(chǎn)生。Ma等［22］報(bào)道10～50 nm金納米粒子的依賴吸收可引起小鼠腎臟細(xì)胞自噬體的積累和溶酶體修復(fù)障礙。Jia等［23］認(rèn)為金納米粒子會(huì)引起氮的氧化物釋放到血清中，引起細(xì)胞毒性。Ng等［24］報(bào)道金納米粒子會(huì)使人肺成纖維細(xì)胞MRC-5出現(xiàn)自噬及氧化應(yīng)激，同時(shí)觀察到自噬小體的形成和自噬相關(guān)蛋白MAC-LC3及ATG7的上調(diào)及脂質(zhì)過氧化作用，蛋白質(zhì)免疫印跡分析檢測(cè)到丙二醛，進(jìn)一步確定細(xì)胞發(fā)生了脂質(zhì)過氧化。

3 金納米材料的基因毒性

目前金納米粒子的毒性研究以生物代謝及細(xì)胞研究為主，基因毒性研究相對(duì)較少。金納米粒子對(duì)哺乳細(xì)胞系的基因毒性主要有DNA損傷、染色體斷裂、編碼蛋白表達(dá)異常等。Chueh等［25］進(jìn)行了金納米棒（平均長(zhǎng)度10～40 nm）對(duì)人肺成纖維細(xì)胞MRC-5的基因毒性研究，發(fā)現(xiàn)金納米棒會(huì)使MRC-5細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)。脫氧核糖核酸微陣列分析顯示，這種應(yīng)激反應(yīng)在其DNA損傷反應(yīng)與修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)控、氧化還原穩(wěn)態(tài)中一直存在；ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在細(xì)胞增殖與抑制金納米棒對(duì)細(xì)胞及基因毒性中也發(fā)揮作用。聚類分析、信號(hào)通路和基因本體分析顯示，基因表達(dá)了大量編碼蛋白，以p53（3.1倍）、BRCA1（4.3倍）為著。同時(shí)，金納米棒還引起B(yǎng)ER修復(fù)基因及同源重組相關(guān)基因的表達(dá)，表明金納米粒子會(huì)引起DNA損傷和染色體斷裂，錯(cuò)配修復(fù)和跨損傷DNA合成的相關(guān)基因如MLH3，Rev1表達(dá)增加。Balansky等［26］將劑量為3 mg/kg金納米粒子（40 nm、100 nm）懸浮液在雌鼠妊娠期10 d、12 d、14 d、17 d經(jīng)胎盤注入，結(jié)果100 nm組胎鼠的肝臟及外周血嗜多染紅細(xì)胞微核率顯著增加，miRNA表達(dá)增加。對(duì)實(shí)驗(yàn)中胎鼠1280種miRNA進(jìn)行分析，100 nm組胎鼠肺中28種miRNA上調(diào)2倍以上，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；胎鼠肝臟中5種miRNA上調(diào)，其中Let-7a與miR-183在肺和肝臟中均上調(diào)。該實(shí)驗(yàn)證明了金納米粒子對(duì)胎鼠DNA具有損傷及影響相關(guān)表觀遺傳變化。

在細(xì)菌方面，Wang等［27］研究顯示，金納米粒子（16 nm）對(duì)TA102鼠傷寒沙門菌株有致突變作用。而Lopes等［28］對(duì)TA98/TA100鼠傷寒沙門菌株及費(fèi)氏弧菌研究顯示，金納米棒（橫徑10 nm，長(zhǎng)徑35 nm）對(duì)3者均無致突變效應(yīng)。由于金納米粒子不能通過細(xì)菌細(xì)胞壁，部分學(xué)者認(rèn)為金納米材料關(guān)于細(xì)菌的基因毒性研究沒有意義。

4 討論及展望

金納米材料由于其獨(dú)特的理化性質(zhì)，在醫(yī)學(xué)上展現(xiàn)了巨大的應(yīng)用潛力，故其對(duì)生物體安全性的研究勢(shì)在必行。金納米材料可在生物體內(nèi)各組織分布，并具有細(xì)胞毒性和基因毒性；影響細(xì)胞的增殖和形態(tài)，使細(xì)胞發(fā)生凋亡、自噬；引起細(xì)胞DNA損傷及染色體斷裂。上述生物毒性與金納米材料的尺寸、形態(tài)、濃度、表面修飾物等均有一定的聯(lián)系。綜合分析上述因素的作用，探索金納米材料產(chǎn)生生物毒性的機(jī)制，尋找一種理想尺寸、形態(tài)及表面修飾物的金納米材料將會(huì)是金納米材料下一步的研究重點(diǎn)。

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（本文編輯 張春輝）

O614.123

10.3969/j.issn.1005-5185.2016.06.018

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81071240）。

高 斌 E-mail: gaobin_3136@163.com

2015-11-16

2016-02-02