劉紅林（南京農業(yè)大學動物科技學院袁江蘇南京210095）

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轉基因動物制備技術

劉紅林
（南京農業(yè)大學動物科技學院袁江蘇南京210095）

摘要院所謂轉基因動物是指基因組整合有外源基因袁并且能將外源基因穩(wěn)定遺傳給后代的一類動物遙本文簡要介紹了轉基因動物制備技術的受精卵原核顯微注射法堯干細胞嵌合體法堯體細胞克隆法和病毒載體法四種主要技術的原理堯方法及優(yōu)缺點遙

關鍵詞院轉基因動物；制備技術

所謂轉基因動物是指基因組整合有外源基因，并且能將外源基因穩(wěn)定遺傳給后代的一類動物。

在物種的形成與進化過程中，基因交流一直在發(fā)生。研究認為，哺乳動物線粒體可能來源于古細菌，而基因組中的原癌基因序列可能源自于病毒DNA；另一方面，一個種群也會通過雜交方式摻入其他種群的血緣，如無氟烷基因皮特蘭豬種的建立。皮特蘭豬種是世界上瘦肉率最高的豬種，但具有引發(fā)應激綜合征的有害氟烷基因，氟烷基因是蘭尼定受體基因的一種突變類型，在皮特蘭豬種純合。商業(yè)化去除皮特蘭豬種氟烷基因的策略是：將皮特蘭豬與大白豬雜交，雜種豬為具有1個氟烷基因和1個正確蘭尼定受體基因的雜合子，繼而將雜種豬與皮特蘭豬回交，回交1代豬有一半為氟烷基因雜合子，采用分子生物學技術選出雜合子豬，再將雜合子豬與皮特蘭豬回交，選出后代豬群中的雜合子再與皮特蘭回交，這樣經過多代回交，最終的回交豬群皮特蘭豬種的血緣可以超過97%，回交豬群的雜合子豬自交，后代約有1/4不含氟烷基因，采用分子生物學技術將其選出，就可獲得無氟烷基因的皮特蘭豬新種群，從而在皮特蘭新豬群中成功用大白豬的蘭尼定受體基因替代了有害氟烷基因。與傳統(tǒng)的基因交流不同，轉基因技術是利用分子分物學技術將少數(shù)或個別基因導入宿主基因組，而且外源基因的來源更加廣泛，如將線蟲的fat-1基因導入豬基因組。

轉基因動物制備技術可以歸納為以下四種主要的類型：受精卵原核顯微注射法、干細胞嵌合體法、體細胞克隆法和病毒載體法，現(xiàn)將此四種技術方法分別介紹如下。

1　受精卵原核注射法

對于有性生殖的動物來說，生命起源于單細胞受精卵，構成動物有機體多種多樣的細胞擁有一個共同的祖先細胞，即受精卵。生命初期，精子與卵子融合形成受精卵，在受精卵細胞質中精子與卵子的遺傳物質分別形成雄原核和雌原核，十多個小時后受精卵進入有絲分裂中期，此時精子與卵子的遺傳物質才混合在一起。雌、雄原核雖然處于同一個細胞質中，但兩者有許多不同，最易觀察的是兩者體積存在差異，雄原核體積較大。受精卵原核注射法即采用顯微技術將外源基因注入雄原核。實踐證明，注入雄原核的外源基因會整合進入部分胚胎的基因組中，從而在后代中獲得一定比例的轉基因個體。受精卵原核注射法是應用最為廣泛，也是最早、最經典的方法，其優(yōu)點是：導入過程直觀、外源基因（DNA）的大小不受限制、沒有化學試劑等對細胞的毒性作用；缺點也比較明顯：需要昂貴的設備與技術難度很大的復雜操作，胚胎因受到的機械損傷較大而存活率下降，外源基因隨機整合，導入基因沉默現(xiàn)象多有發(fā)生，效率較低。

2　干細胞嵌合體法

動物胚胎附植前發(fā)育存在一個被稱為囊胚期的發(fā)育階段，小鼠受精卵大約經過3～4天的發(fā)育進入囊胚期，囊胚是中空的球狀結構，由外周滋養(yǎng)層細胞和內部的內細胞團細胞組成，滋養(yǎng)層細胞發(fā)育成胎盤，而內細胞團發(fā)育成胚體。內細胞團細胞具有分化形成動物有機體多種多樣細胞類型的能力，被稱為多能性胚胎干細胞。同一物種不同類群的動物，其囊胚內細胞團混合后能夠發(fā)育成被稱為嵌合體的個體，所謂嵌合體是指組成動物有機體的細胞有2個或2個以上的祖先細胞來源。不同物種的嵌合體也有報道，典型的例子是2002年國際期刊《家禽科學》的一篇報道，該報道稱，鴨的胚盤細胞注入雞胚盤下腔，能夠發(fā)育形成混有鴨細胞的嵌合體雞，并且鴨細胞可以參與嵌合體雞生殖腺的形成，在嵌合體雞精液中檢測到鴨精子，嵌合體雞精液能使母鴨受精，獲得后代鴨。干細胞嵌合體法的原理是：體外將外源基因轉入胚胎干細胞基因組，然后將轉有外源基因的胚胎干細胞注射到正常胚胎的囊胚腔，在后代嵌合體中檢測生殖嵌合的個體，在生殖嵌合個體與正常動物個體繁殖的后代中，將產生一定比例的轉基因個體。該方法突出的優(yōu)點是：只需將外源基因導入干細胞，外源基因整合情況的可控性高。與將外源基因導入個體相比，外源基因導入細胞的方法多樣、簡單易行，且通過對外源基因在宿主細胞基因組插入位點、拷貝數(shù)以及表達特性的檢測，可以篩選出適合的轉基因細胞類型，從而提高轉基因動物類型的可控性。但一方面由于大動物的胚胎干細胞（embryonic stem cell, ES細胞）建系困難，限制了該技術方法的應用；另一方面，利用該法獲得的第一代動物均為嵌合體，獲得真正的轉基因個體的試驗周期長、效率低。

3　體細胞克隆法

體細胞克隆的成功是生殖生物學的重大變革，意義深遠。高度分化的體細胞，如皮膚細胞，植入去核的卵母細胞后體細胞核發(fā)生去分化，成為類似受精卵的全能性細胞。體細胞移入去核卵母細胞后，經人工激活可以重演早期胚胎的發(fā)育過程，移植代孕動物可以生出具有繁殖性能的個體。如果體細胞導入了外源基因，那么克隆后代同時也就是轉基因動物。借助體細胞克隆法已先后獲得了轉基因小鼠、豬、牛、羊等動物。體細胞克隆法適用于大多數(shù)物種，且試驗周期短，無需進行嵌合體育種就可直接獲得轉基因個體；不足之處是實驗操作難度大及克隆的成功率較低。

4　病毒載體法

病毒，特別是逆轉錄病毒，具有感染細胞并將自身DNA整合進入宿主基因組的能力。病毒感染細胞的一個重要方面是將其遺傳物質釋放進入細胞，病毒DNA具有長末端重復序列的結構特征，借助這種結構特征，病毒DNA可以高效整合到宿主細胞基因組。病毒DNA的長末端重復序列具有啟動下游基因轉錄的功能，將外源基因置于長末端重復序列下游重組病毒DNA，由此生產的病毒感染受精卵或早期胚胎后，就有可能獲得轉基因嵌合體后代，再經過一代繁殖得到轉基因動物。在各種基因轉移的方法中，通過逆轉錄病毒載體將基因整合入宿主細胞基因組，是最為有效的方法之一，其中慢病毒載體以其高效的整合與表達效率受到特別注意。2002年《科學》雜志報道，重組的慢病毒顆粒注射小鼠受精卵透明帶與細胞膜間的卵周隙，能夠高效獲得轉基因小鼠，隨后1～2年，利用該種載體相繼高效獲得了轉基因大鼠、牛、豬等。慢病毒載體法特別適用于家禽的轉基因個體制備，禽類由于其繁殖生物學特點，適用于哺乳動物的多種轉基因制備技術（如原核注射法、干細胞嵌合體法、體細胞克隆法）均難以在家禽上借用。對家禽而言，只需在新生受精蛋的胚盤下腔注入重組有外源基因的慢病毒載體，就能高效獲得轉基因雞嵌合體，并且生殖嵌合的比率高。慢病毒載體法以其簡單、高效成為轉基因禽制備的首選技術。與其他轉基因技術相比，病毒載體法操作簡單，外源基因的整合效率高；但該方法對外源基因片段的大小有限制，生殖嵌合的比率較低，并且存在病毒載體可能激活基因組的原癌基因或其他有害基因的生物安全隱患。

中圖分類號院S828.2

文獻標識碼院A

文章編號院1673-4645(2016)04-0060-02

收稿日期：2016-03-30

基金項目：轉基因生物新品種培育重大專項（2014ZX08006-003）

作者簡介：劉紅林（1966-），漢族，江蘇姜堰市人，教授，博士，博士生導師，主要從事動物生物技術研究，E-mail：liuhonglin@njau.edu.cn