潘龍其，張麗，楊成德*，袁慶華，王瑜，苗麗宏

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院,草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室,中-美草地畜牧業(yè)

可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州730070；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)研北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193)

紫花苜蓿根腐病原菌——擬枝孢鐮刀菌的鑒定及其生物學(xué)特性研究

潘龍其1，張麗1，楊成德1*，袁慶華2*，王瑜2，苗麗宏2

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院,草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室,中-美草地畜牧業(yè)

可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州730070；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)研北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193)

摘要：本文對(duì)從內(nèi)蒙古赤峰巴雅爾草業(yè)基地紫花苜蓿根部分離到的菌株BYE27-2-5進(jìn)行了致病性測(cè)定、形態(tài)學(xué)和rDNA-ITS序列分析鑒定及生物學(xué)特性測(cè)定。結(jié)果表明，該菌菌絲生長、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)的最適溫度分別為25,30和28℃；pH值5.0~11.0均宜于菌絲生長，產(chǎn)孢最適pH 8.0，孢子萌發(fā)最適pH 7.0；光暗交替利于菌絲生長，光照利于產(chǎn)孢和孢子的萌發(fā)；孢子在相對(duì)濕度低于75%不萌發(fā)，高于95%萌發(fā)較快；葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基利于菌絲生長和孢子萌發(fā)，馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基利于產(chǎn)孢；碳源中葡萄糖利于菌絲生長和孢子萌發(fā)，蔗糖利于產(chǎn)孢；氮源中蛋白胨利于菌絲生長，酵母膏利于產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)；菌絲致死溫度為54℃(10 min)，分生孢子的致死溫度為48℃(10 min)；根據(jù)其形態(tài)特征和rDNA-ITS序列分析結(jié)果，鑒定其為擬枝孢鐮刀菌(Fusarium sporotrichioide)。

關(guān)鍵詞：紫花苜蓿；擬枝孢鐮刀菌；病原鑒定；生物學(xué)特性

Identification and biological characteristics ofFusariumsporotrichioideisolated fromMedicagosativaroot

PAN Long-Qi1, ZHANG Li1, YANG Cheng-De1*, YUAN Qing-Hua2*, WANG Yu2, MIAO Li-Hong2

1.CollegeofGrassland,GansuAgriculturalUniversity,KeyLaboratoryofGrasslandEcosystem,MinistryofEducation,PrataculturalEngineeringLaboratoryofGansuProvince,Sino-U.SCenterforGrazinglandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China; 2.InstituteofAnimalSciencesofCAAS,Beijing100193,China

Abstract:The strain BYE27-2-5 isolated from alfalfa (Medicago sativa) with root rot in north China was comprehensively evaluated by analyses of its biological characteristics, morphology, and ITS sequence. The optimum temperatures for mycelium growth, sporulation, and spore germination were 25℃, 30℃, and 28℃, respectively. The strain was able to grow in a pH range of 5.0-11.0 and the optimal pH for sporulation and spore germination were 8.0 and 7.0, respectively. Alternative light conditions were optimal for mycelial growth whereas complete light conditions were optimal for sporulation and spore germination. Spores germinated most rapidly at 95% relative humidity or in water-drop conditions, and failed germinate at relative humidity levels below 75%. Dextrose peptone medium was the best medium for mycelial growth and spore germination and potato dextrose agar was the best medium for sporulation. The best carbon source for mycelial growth and spore germination was glucose and that for sporulation was sucrose. The best nitrogen source for mycelium growth was peptone and that for spore germination and sporulation was yeast extract. The lethal temperature for mycelia was 54℃ (10 min) and that for spores was 48℃ (10 min). Based on these biological characteristics and the results of an ITS sequence analysis, the isolate was identified as Fusarium sporotrichioide.

Key words:alfalfa; Fusarium sporotrichioide; pathogen identification; biological characteristics

苜蓿(Medicagosativa)是世界上最早栽培、分布面積最廣的優(yōu)質(zhì)牧草，素有“牧草之王”的美譽(yù)，也是我國當(dāng)前生態(tài)建設(shè)工程中應(yīng)用最為廣泛的草種[1]。與糧食、經(jīng)濟(jì)作物相比，有較強(qiáng)的耐鹽堿性，是良好的水土保持植物[2]。苜蓿根腐病是一種主要發(fā)生在根部的世界性病害，尤其在美國、加拿大、阿根廷、澳大利亞、俄羅斯和日本等國家發(fā)生嚴(yán)重[3]，我國自1991年發(fā)現(xiàn)該病以來，先后在新疆、甘肅、青海、四川[4-5]等地陸續(xù)報(bào)道，王雪薇等[6]、陳耀等[7]發(fā)現(xiàn)新疆苜蓿根腐病使苜蓿死亡率達(dá)60.08%~73.45%。據(jù)估計(jì)，全世界每年由該病造成20% 左右的產(chǎn)量損失，嚴(yán)重的甚至高達(dá)40%。一般來說，不同地區(qū)的根腐病癥狀因病原物的不同而異?？傊?，被侵染植株生長緩慢，枝條枯萎，葉片變黃，根部維管束呈深褐色，根莖和中部變空，大量側(cè)根腐爛死亡，整株枯萎或整根腐爛則需幾周至1個(gè)月以上[8]。國內(nèi)外學(xué)者對(duì)于該病的病原進(jìn)行了大量的研究，均認(rèn)為該病病原較為復(fù)雜，但多與鐮刀菌有關(guān)。盡管Robet F N發(fā)現(xiàn)細(xì)菌也可以造成根腐病，但真菌的侵染是導(dǎo)致該病的主要原因[9]。我國先后報(bào)道的病原達(dá)28種，其中鐮刀菌13種，分別為尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、茄腐皮鐮刀菌(F.solani)、燕麥鐮刀菌(F.avenaceum)、銳頂鐮刀菌(F.acuminatum)、接骨木鐮刀菌(F.sambucinum)、三線鐮刀菌(F.tricinctum)、半裸鐮刀菌(F.semitectum)、木賊鐮刀菌(F.equiseti)、串珠鐮刀菌(F.moniliforme)、大刀鐮刀菌(F.culmorum)、鏈狀鐮刀菌(F.fusarioides)和梨孢鐮刀菌(F.poae)等。其他病原真菌12種，細(xì)菌2種，線蟲1種[10]。此外，疫霉屬(Phytophthora)、立枯絲核菌(Rhizoctonia)、根腐絲囊霉(Aphanomyces)、腐霉(Pythium)、殼多隔孢菌(Stagnosporameliloti)、殼滿孢菌(Plenodomusmeliloti)、柱枝雙孢霉(Cylindrocladiumcrotalariae)、柱胞菌(Cylindrocarponehrenbeigii)、皮傘菌(Marasmiusspp.)、核盤菌(Sclerotiniasp.)、黑粘座孢霉(Myrotheciumroridum)和多主瘤梗單胞霉(Phymatotrichumomnivorum)等也是引起苜蓿根腐病的主要真菌，也能導(dǎo)致苜蓿根腐病的發(fā)生[11]。目前，內(nèi)蒙古地區(qū)苜蓿種植面積達(dá)80萬hm2，占全國種植總面積的1/5，其也是我國苜蓿種子和苜蓿草產(chǎn)品的主產(chǎn)區(qū)之一。紫花苜蓿根腐病導(dǎo)致苜蓿固氮能力降低，利用年限和生長壽命縮短、苜蓿產(chǎn)量和品質(zhì)下降、甚至引起苜蓿草地的提早衰敗(2~3年內(nèi)大面積死亡)和苜蓿加工利用價(jià)值的喪失[12]。近年來隨著紫花苜蓿種植面積的增加和種植年限的延長，病害問題越發(fā)嚴(yán)重，已成為主要的制約因素之一。苜蓿根腐病的研究在苜蓿產(chǎn)業(yè)化開發(fā)和生態(tài)環(huán)境建設(shè)方面具有重大意義。因此，本試驗(yàn)在國內(nèi)首次對(duì)內(nèi)蒙赤峰巴雅爾草業(yè)基地紫花苜蓿根腐病菌——擬枝孢鐮刀菌進(jìn)行了系統(tǒng)研究，以期為苜蓿根腐病的診斷和防治提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1　供試病原菌

供試病原菌為本實(shí)驗(yàn)室2013年從巴雅爾草業(yè)基地(內(nèi)蒙古赤峰)紫花苜蓿(皇后)根腐病發(fā)病部位采用方中達(dá)[13]的組織分離法分離，再經(jīng)過單孢分離[14]獲得的單孢菌株。

1.2　癥狀描述

根據(jù)紫花苜蓿根腐病田間危害癥狀的特點(diǎn)進(jìn)行描述、記載并拍照。

1.3　致病性測(cè)定

采用灌根法和米粒接種法接種。在室溫條件下將1×106個(gè)/mL的孢子懸浮液澆灌于盆栽的中苜一號(hào)60 d幼苗根圍，后覆無菌土5 mm，3次重復(fù)，以無菌水為對(duì)照；米粒接種法為將1×106個(gè)/mL的孢子懸浮液制成米粒接種體均勻的分散在幼苗根圍(10粒/株)，覆無菌土5 mm，3次重復(fù)，以無菌水制成的米粒接種體為對(duì)照。3 d后連續(xù)每天觀察苜蓿的發(fā)病情況至形成典型癥狀，從發(fā)病部位再次分離病原菌。

1.4　病原菌鑒定

1.4.1形態(tài)特征觀察將單孢菌株純化后轉(zhuǎn)接于馬鈴薯蔗糖瓊脂(PSA)平板，25℃黑暗培養(yǎng)，觀察菌落顏色、形狀以及菌絲疏密程度。產(chǎn)孢后，在顯微鏡下觀察大、小分生孢子和厚垣孢子的形態(tài)、拍照并測(cè)量孢子的大小(100個(gè))。根據(jù)病原菌形態(tài)特征，結(jié)合Booth《鐮刀菌屬》[15]等相關(guān)資料進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.4.2病原菌rDNA-ITS序列分析采用鐮刀菌屬特異性引物Fu3(5′-CCGAGTTTACAACTCCCAAA-3′)和Fu4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)[16]對(duì)病原菌rDNA的ITS片段按劉志恒等[17]的方法進(jìn)行分析。

1.5　病原菌生物學(xué)特性測(cè)定

1.5.1不同條件對(duì)菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響(1)溫度對(duì)菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響，菌株25℃黑暗培養(yǎng)5 d，用無菌打孔器在其菌落邊緣打取直徑0.5 cm的菌餅，接種于PSA平板中央，3次重復(fù)，分別置于0~45℃(間隔5℃)恒溫箱黑暗培養(yǎng)，5 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。7 d后每皿取4塊直徑1.0 cm的菌餅，用1 mL無菌水洗脫孢子，血球計(jì)數(shù)板計(jì)產(chǎn)孢量，3次重復(fù)。

(2)pH值對(duì)菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響，用HCl(1 mol/L)和NaOH(1 mol/L)將PSA培養(yǎng)基pH分別調(diào)至2.0~12.0(間隔1.0)，3次重復(fù)，25℃恒溫箱黑暗培養(yǎng)；接種、菌絲生長和產(chǎn)孢量測(cè)量方法同1.5.1(1)。

(3)光照對(duì)菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響，將直徑0.5 cm的菌餅接種于PSA培養(yǎng)基平板中央，分別置于24 h/d光照、24 h/d黑暗和(12 h光照與12 h黑暗)/d光暗交替條件下25℃恒溫培養(yǎng)，3次重復(fù)，其他方法同1.5.1(1)。

(4)培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響，供試培養(yǎng)基有馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基PDA、馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基PSA、水瓊脂培養(yǎng)基WA、VBC、查貝克氏培養(yǎng)基CZ、蔗糖培養(yǎng)基PS、玉米粉培養(yǎng)基CMA、燕麥培養(yǎng)基OMA、V8碳酸鈣瓊脂培養(yǎng)基、葡萄糖蛋白胨、淀粉瓊脂、Bilai’s、苜蓿煎汁、胡蘿卜和真菌生理培養(yǎng)基。25℃恒溫箱培養(yǎng)，3次重復(fù)；其他方法同1.5.1(1)。

(5)碳、氮源對(duì)菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響，以真菌生理培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以KNO3為氮源，以葡萄糖、果糖、半乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘露醇和淀粉作為碳源，以無碳源培養(yǎng)基為對(duì)照；以葡萄糖為碳源，以KNO3、(NH4)2SO4、NH4Cl、尿素、蛋白胨、牛肉膏和酵母膏作為氮源，以無氮源培養(yǎng)基為對(duì)照。25℃恒溫箱培養(yǎng)，3次重復(fù)；其他方法同1.5.1(1)。

(6)菌絲致死溫度測(cè)定，將直徑0.5 cm的菌餅置于裝有5 mL無菌水的試管中，將試管置于40~70℃(間隔5℃)恒溫水浴鍋中處理10 min，測(cè)得致死溫度范圍，設(shè)置間隔1℃梯度，重復(fù)上述操作，確定致死溫度，3次重復(fù)。

1.5.2不同條件對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響(1)分生孢子萌發(fā)時(shí)間的測(cè)定，將分生孢子配制成濃度為10~20個(gè)孢子/視野(10×40倍)懸浮液，采用凹載片萌發(fā)法，25℃保濕培養(yǎng)，分別于4~24 h(間隔2 h)后檢查300個(gè)孢子萌發(fā)情況，確定最佳萌發(fā)時(shí)間。

(2)溫度對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響，采用凹載片萌發(fā)法，將分生孢子懸浮液置于5~45℃(間隔5℃)不同溫度保濕培養(yǎng)，5次重復(fù)，12 h(由預(yù)實(shí)驗(yàn)得)后測(cè)定孢子萌發(fā)率，每次隨機(jī)測(cè)定300個(gè)孢子。

(3)pH對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響，PSA培養(yǎng)液和孢子懸浮液等體積混合，用HCl(1 mol/L)和NaOH(1 mol/L)調(diào)節(jié)其pH至2.0~12.0(間隔1.0)，25℃保濕培養(yǎng)，其他同1.5.2(2)。

(4)光照對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響，將孢子懸浮液分別置于24 h/d光照、24 h/d黑暗和(12 h光照與12 h黑暗)/d光暗交替光照條件下25℃保濕培養(yǎng)，其他方法同1.5.2(2)。

(5)濕度對(duì)分生孢子萌發(fā)影響測(cè)定，將孢子懸浮液滴于凹載片上，風(fēng)干后置于用不同鹽類飽和溶液控制的濕度為65%，70%，75%，80%，85%，90%，95%，97%，100%以及水滴等不同濕度的密閉容器中。其他同方法1.5.2(2)。

(6)培養(yǎng)液對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響，供試培養(yǎng)液有苜蓿煎汁、胡蘿卜煎汁、PDA、PSA、VBC、CZ、PS、CMA、OMA、葡萄糖蛋白胨、淀粉瓊脂、Bilai’s、V8和真菌生理培養(yǎng)液，無菌水孢子懸浮液為對(duì)照。將分生孢子懸浮液與上述14種培養(yǎng)液等體積混合，采用凹載片萌發(fā)法，25℃保濕培養(yǎng)8 h，其他方法同1.5.2(2)。

(7)碳、氮源對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響，碳源培養(yǎng)液有葡萄糖、果糖、半乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘露醇、淀粉和無碳源對(duì)照8種；氮源培養(yǎng)液有KNO3、(NH4)2SO4、NH4Cl、尿素、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏和無氮源對(duì)照8種，培養(yǎng)液分別與分生孢子懸浮液等體積混合，采用凹載片萌發(fā)法，25℃保濕培養(yǎng)，其他方法同1.5.2(6)。

(8)分生孢子致死溫度的測(cè)定，將裝有5 mL孢子懸浮液的試管置于40~60℃(間隔5℃)恒溫水浴鍋中處理10 min，采用凹載片萌發(fā)法，25℃保濕培養(yǎng)，12 h后測(cè)定孢子萌發(fā)率，測(cè)得致死溫度范圍，設(shè)置間隔1℃梯度，重復(fù)上述操作，確定致死溫度，5次重復(fù)。

1.6　統(tǒng)計(jì)分析方法

運(yùn)用DPS 6.55對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理、分析。

2結(jié)果與分析

2.1　病害癥狀描述

紫花苜蓿根腐病在各調(diào)查區(qū)均有發(fā)生(發(fā)病率12%~42%)。輕病田，個(gè)別植株萎蔫枯死(圖1a)；重病田，全田枯死(圖1b)。該病原菌主要侵染根部和根莖部，發(fā)病初期地上部分葉片發(fā)黃，個(gè)別枝條萎蔫枯死(圖1c)；根基部逐漸擴(kuò)展成褐色腐爛，根部產(chǎn)生水漬狀壞死斑，主根導(dǎo)管呈棕褐色(圖1d)；發(fā)病后期地上部分葉片變黃枯萎，全株枯死(圖1e)；整根全部腐爛(圖1f)。

圖1　紫花苜蓿根腐病田間自然發(fā)病癥狀Fig.1　Symptom of M. sativa root rot in field　a：輕病田；b：重病田；c：發(fā)病初期地上部分；d：發(fā)病后期地上部分；e：發(fā)病初期根部；f：發(fā)病后期根部。a: Little infected field; b: Heavily infected field; c: Leaf of sick plant in early period; d: Leaf of sick plant in later period; e: Root of sick plant in early period; f: Root of sick plant in later period.

2.2　病原菌的分離與致病性測(cè)定

采用常規(guī)組織分離法，對(duì)多個(gè)發(fā)病植株根部進(jìn)行分離、單孢純化，得到的多個(gè)真菌單孢分離物，將培養(yǎng)性狀、菌絲形態(tài)、孢子形態(tài)一致的分離物，合并編號(hào)為BYE27-2-5。

將分離物接種7~15 d后，中苜一號(hào)全部發(fā)病，對(duì)照均不發(fā)病。其中米粒接種體接種比分生孢子懸浮液灌根發(fā)病快5~8 d。米粒接種體接種的中苜一號(hào)發(fā)病后，植株萎蔫枯死(圖2a)，根部出現(xiàn)腐爛(圖2c)，發(fā)病癥狀與田間相似，對(duì)照不發(fā)病(圖2b，d)。再次分離，從發(fā)病部位獲得了與原接種分離物相同的病原菌。根據(jù)柯赫氏法則，菌株BYE27-2-5為紫花苜蓿根腐病的病原菌。

圖2　接種與不接種BYE27-2-5紫花苜蓿根腐病癥狀Fig.2　Symptom of M. sativa root rot inoculated with BYE27-2-5 　a：接種發(fā)病地上部分；b：CK；c：接種發(fā)病地下部分；d：CK。a:Leaf of inoculated plant; b:CK; c:Root of inoculated plant; d:CK.

2.3　病原菌的鑒定

2.3.1形態(tài)特征觀察其在PSA培養(yǎng)基上生長較快，5 d可長滿全皿，菌落圓形，邊緣整齊，正面初為橙色，后漸變?yōu)榘咨?，氣生菌絲發(fā)達(dá)，呈絮狀(圖3a)；背面初為粉紅色，后漸變成紅褐色(圖3b)；分生孢子大、小兩型，小型分生孢子2~3 d可產(chǎn)生，無色單孢，0~1個(gè)分隔，卵形或棍棒形(圖3c)，大小1.57 μm×2.25 μm~4.75 μm×20.45 μm；大型分生孢子5~7 d產(chǎn)生，鐮刀狀(圖3d)，3~5個(gè)分隔，多為3個(gè)分隔，大小2.54 μm×5.27 μm~38.35 μm×53.55 μm；WA上培養(yǎng)10 d產(chǎn)生厚垣孢子，圓形或卵圓形串珠狀(圖3e)；分生孢子梗無隔，細(xì)長或單瓶梗，產(chǎn)孢多為芽生殖(圖3f)。

圖3　病原物菌落、分生孢子和厚垣孢子形態(tài)Fig.3　The colony, conidium, chamydospore of isolated pathogen

a：菌落正面；b：菌落背面；c：小型分生孢子；d：大型分生孢子；e：厚垣孢子；f：產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)。a: Upper surface of the colony; b: Lower surface of the colony; c: Conidium; d: Macro conidia; e: Chlamydospore; f: Fruit structure.

根據(jù)病原菌的培養(yǎng)形狀、兩型分生孢子和厚垣孢子的形態(tài)特征，結(jié)合相關(guān)資料[18-20]，初步確定BYE27-2-5為擬枝孢鐮刀菌 (Fusariumsporotrichioides)。

2.3.2病原菌rDNA-ITS序列分析利用引物Fu3/Fu4對(duì)菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在約500 bp處有一特異性片段(圖4)。將擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，所測(cè)序列經(jīng)BLAST對(duì)比分析，選取相似性較高的rDNA-ITS序列，并用ClustalX進(jìn)行多重序列比較，再通過MEGA構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，該病原菌與擬枝孢鐮刀菌(KC254054)聚在一起(圖5)，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，確定該病原菌為擬枝孢鐮刀菌。

圖4　rDNA-ITS序列的擴(kuò)增Fig.4　PCR product of rDNA-ITS

圖5　病原菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5　Phylogenetic tree of BYE27-2-5

2.4　不同條件對(duì)病原菌菌絲生長及產(chǎn)孢的影響

2.4.1溫度對(duì)菌絲生長及產(chǎn)孢的影響菌絲生長和產(chǎn)孢的溫度范圍均為5~35℃，菌絲生長最適溫度為25℃，5 d菌落直徑為7.44 cm，最適產(chǎn)孢溫度為30℃，7 d產(chǎn)孢量為5.93×105個(gè)/mL，低于5℃或高于35℃菌絲不生長也不產(chǎn)孢(圖6)。

圖6　溫度對(duì)病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢的影響Fig.6　Effects of temperature on mycelium growth and sporulation

2.4.2pH值對(duì)菌絲生長和產(chǎn)孢的影響菌絲生長的pH值范圍為3.0~12.0，菌絲生長最適pH值為5.0~11.0，pH低于3.0菌絲停止生長。產(chǎn)孢量曲線呈單峰型，pH在3.0~8.0范圍內(nèi)，隨著pH值增高產(chǎn)孢量逐漸增大，之后隨著pH值增高產(chǎn)孢量逐漸減小，最適產(chǎn)孢pH值為8，7 d產(chǎn)孢量為7.60×105個(gè)/mL；pH低于3.0不產(chǎn)孢(圖7)。

圖7　pH值對(duì)病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢的影響Fig.7　Effects of pH on mycelium growth and sporulation

不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著，下同。Different lowercase letters represented significant differences at 0.05 level. The same below.

2.4.3光照對(duì)菌絲生長和產(chǎn)孢的影響光照處理對(duì)菌株菌絲生長和產(chǎn)孢無顯著影響。黑暗和光照下，菌絲的生長和產(chǎn)孢的差異不明顯，但光暗交替更利于菌絲的生長，5 d菌落直徑為7.15 cm，但不宜產(chǎn)孢(圖8)。

圖8　光照對(duì)病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢的影響Fig.8　Effects of illumination on mycelium growth and sporulation

2.4.4培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長和產(chǎn)孢的影響病原菌菌絲在15種培養(yǎng)基上生長和產(chǎn)孢量差異顯著，在葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基菌絲生長最快，5 d菌落直徑為7.50 cm，其次為PDA和CZ，產(chǎn)孢量最大的是PSA，7 d產(chǎn)孢量為11.13×105個(gè)/mL，其次為馬鈴薯淀粉培養(yǎng)基(P<0.05)；Bilai’s上菌絲生長最慢，5 d菌落直徑為4.08 cm，PS不宜產(chǎn)孢(P<0.01)(表 1)。

表1　培養(yǎng)基對(duì)病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢的影響

注：大、小寫字母分別表示同一列在0.01與0.05水平上差異顯著，下同。

Note: Different capital and lowercase letters represented significant differences at 0.01 and 0.05 levels. The same below.

2.4.5碳源、氮源對(duì)菌絲生長和產(chǎn)孢的影響供試碳源以葡萄糖和可溶性淀粉較為適宜菌絲生長，蔗糖較適宜產(chǎn)孢(P<0.05)；半乳糖和麥芽糖不利于菌絲生長，葡萄糖不利于產(chǎn)孢(P<0.01)；供試氮源以蛋白胨較適宜菌絲生長，酵母膏和(NH4)2SO4較宜于產(chǎn)孢(P<0.05)；KNO3不利于菌絲生長，牛肉膏不利于產(chǎn)孢(P<0.01)。該結(jié)果表明，碳源和氮源的有無對(duì)菌絲的生長和產(chǎn)孢差異極顯著，各碳源間或氮源間有差異(表2)。

表2　碳源、氮源對(duì)病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢的影響

2.4.6菌絲致死溫度當(dāng)處理溫度≥54℃時(shí)，菌餅在培養(yǎng)基上不能生長，即病原菌菌絲致死溫度是54℃，10 min(圖9)。

圖9　菌絲致死溫度Fig.9　Fatal temperature of mycelium

2.5　不同條件對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響

2.5.1分生孢子萌發(fā)時(shí)間測(cè)定4 h后孢子開始萌發(fā)， 12 h后孢子萌發(fā)達(dá)到峰值并趨于穩(wěn)定，以下孢子萌發(fā)試驗(yàn)均以此為基礎(chǔ)(圖10)。

2.5.2溫度對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響孢子萌發(fā)的溫度范圍為10~35℃，最適溫度為28℃，12 h后孢子萌發(fā)率為93.80%，在5~28℃之間，孢子萌發(fā)率隨著溫度的升高而增高，在28~40℃之間，孢子萌發(fā)率隨著溫度的升高而降低(圖11)。

圖11　溫度對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響Fig.11　Effects of temperature on spore germination

2.5.3pH對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響在pH為3.0~12.0范圍內(nèi)孢子均可萌發(fā)，最適pH為7.0，12 h后孢子萌發(fā)率為92.56%，不同pH值對(duì)孢子萌發(fā)的影響差異顯著(圖12)。

圖12　pH值對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響Fig.12　Effects of value on spore germination

2.5.4光照對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響光照對(duì)孢子萌發(fā)的影響差異不明顯，24 h全光照條件下，萌發(fā)率略高于其他兩條件，孢子萌發(fā)率為93.08%，光照條件宜于孢子萌發(fā)(圖13)。

圖13　光照對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響Fig.13　Effects of illumination on spore germination

2.5.5濕度對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響分生孢子在相對(duì)濕度65%~75%的條件下均不能萌發(fā)，在相對(duì)濕度為75%~100%的條件下，濕度越大萌發(fā)率越高，相對(duì)濕度100%條件下萌發(fā)率最高，孢子萌發(fā)率為93.82%(圖14)。

圖14　濕度對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響Fig.14　Effects of humidity on spore germination

2.5.6培養(yǎng)液對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響14種不同培養(yǎng)液對(duì)分生孢子萌發(fā)都有一定的促進(jìn)作用，其中葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)液、CA、真菌生理培養(yǎng)液能有效地促進(jìn)孢子萌發(fā)，葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)液中孢子萌發(fā)率為93.99%，CK為75.76%(圖15)。

圖15　培養(yǎng)基對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響

1：PDA；2：葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)液；3：CZ；4：OMA；5：PS；6：CMA；7：PSA；8：V8；9：CA；10：真菌生理培養(yǎng)液；11：苜蓿汁液培養(yǎng)液；12：馬鈴薯淀粉培養(yǎng)液；13：Bilai’s；14：VBC；15：CK。1: PDA; 2: Dextrose peptone medium; 3: CZ; 4: OMA; 5: PS; 6: CMA; 7: PSA; 8: V8; 9: CA; 10: Fungus physiological medium; 11: Alfalfa leaf juice medium; 12: Potato starch medium; 13: Bilai’s; 14: VBC; 15: CK.

2.5.7碳、氮源對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響葡萄糖和果糖的效果最好，萌發(fā)率分別為95.35%和93.28%，淀粉的效果最差，萌發(fā)率為84.88%。除尿素外，其他氮源對(duì)孢子的萌發(fā)促進(jìn)作用差異不顯著，酵母膏和牛肉膏的效果最明顯，萌發(fā)率分別為97.10%和95.56%，尿素對(duì)病原菌分生孢子的萌發(fā)有抑制作用，萌發(fā)率僅為49.09%(圖16)。

圖16碳源/氮源對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響

Fig.16Effects of carbon source/nitrogen source

on spore germination

1：葡萄糖/蛋白胨；2：果糖/牛肉膏；3：半乳糖/酵母膏；4：甘露醇/尿素；5：麥芽糖/KNO3；6：蔗糖/NH4Cl；7：淀粉/硫酸銨；8：CK(碳源)/CK(氮源)。1:Glucose/peptone; 2:Fructose/meatext;3:Lactose/yeast extract;4:Mannitol/carbamide; 5:Maltose/KNO3; 6:Sucrose/NH4Cl; 7:Soluble starch/(NH4)2SO4; 8:CK(carbon)/CK(nitrogen).

2.5.8分生孢子致死溫度的測(cè)定當(dāng)處理溫度≥48℃時(shí)，該菌分生孢子不能萌發(fā)，即病原菌分生孢子致死溫度是48℃，10 min(圖17)。

圖17　分生孢子致死溫度Fig.17　Fatal temperature of spore

3結(jié)論與討論

至今，引起苜蓿根腐病的病原菌各說不一，究其原因,一是苜蓿根腐病的病原因不同生態(tài)條件的調(diào)查采樣而異，但大多數(shù)與鐮刀菌有關(guān)，國內(nèi)外報(bào)道的鐮刀菌病原總計(jì)13種之多[11]；二是病原的侵染具有復(fù)雜性，由鐮刀菌一個(gè)種或多個(gè)種混合侵染造成[21]。雖然對(duì)不同分離物復(fù)合接菌有共同的認(rèn)知，但系統(tǒng)的研究鮮有報(bào)道，側(cè)面說明多病原菌的復(fù)合侵染引發(fā)苜蓿根腐病的研究有待進(jìn)一步深入。

本研究結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定和rDNA-ITS序列分析，鑒定內(nèi)蒙古赤峰巴雅爾草業(yè)基地的紫花苜蓿根腐病的致病菌為擬枝孢鐮刀菌，從該菌生長的pH范圍和溫度范圍看出，該菌是一種具較強(qiáng)適應(yīng)性、耐熱性的強(qiáng)抗逆性致病菌，能夠利用多種培養(yǎng)基、碳氮源進(jìn)行生長和繁殖，加之孢子萌發(fā)快等特點(diǎn)，該致病菌對(duì)苜蓿的危害性更大[22]；從致病性測(cè)定中人工接種擬枝孢鐮刀菌的中苜一號(hào)紫花苜蓿發(fā)病率(5 d)和死亡率(10 d)分別為96.3%和97.5%,可見其具有較強(qiáng)的致病性；另外苜蓿根腐病是土傳病害，根部發(fā)病造成大量植株迅速枯死。綜上，安全高效的預(yù)防措施今后也需進(jìn)一步加強(qiáng)研究。

本文所研究的擬枝孢鐮刀菌系內(nèi)蒙古自治區(qū)苜蓿種植區(qū)首次報(bào)道該種可以侵染苜蓿，并在國內(nèi)首次詳細(xì)研究該病原菌的生物學(xué)特性。本研究明確了擬枝孢鐮刀菌引起的苜蓿根病的癥狀及其生物學(xué)特性，為生產(chǎn)中診斷和防治苜蓿根腐病提供了理論依據(jù)，但有關(guān)品種抗病性鑒定及大田防治方法等還需進(jìn)一步研究。

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通訊作者*Corresponding author. E-mail:yangcd@gsau.edu.cn, yuanqinghua@iascaas.net.cn

作者簡(jiǎn)介：潘龍其(1988-)，男，甘肅天水人，在讀碩士。E-mail:gsaupanlongqi@126.com

基金項(xiàng)目：公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)項(xiàng)目(201303057)和國家科技支撐項(xiàng)目“優(yōu)質(zhì)多抗牧草新品種選育與良種繁育關(guān)鍵技術(shù)研究與示范”(2011BAN17B01)資助。

收稿日期：2014-11-13；改回日期：2015-01-14

DOI：10.11686/cyxb2014466