孫玉章，倪雪霞，李金明，吳發(fā)興，王永玲（中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

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動(dòng)物RNA病毒反向遺傳學(xué)操作技術(shù)及應(yīng)用進(jìn)展

孫玉章，倪雪霞，李金明，吳發(fā)興，王永玲
（中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

摘 要：本文簡(jiǎn)述了反向遺傳操作技術(shù)的基本原理以及近年來(lái)動(dòng)物RNA病毒基因復(fù)制與表達(dá)調(diào)控機(jī)理、病毒與宿主間的相互作用，以及構(gòu)建新型病毒載體和研發(fā)新型疫苗等方面的研究進(jìn)展。

關(guān)鍵詞：動(dòng)物RNA病毒；反向遺傳學(xué)；病毒拯救；新型疫苗；應(yīng)用進(jìn)展

多數(shù)動(dòng)物RNA病毒引起難以控制、危害嚴(yán)重的疫病，是病毒學(xué)領(lǐng)域重要的研究對(duì)象之一。但RNA病毒（除逆轉(zhuǎn)錄RNA病毒外）的復(fù)制周期并不經(jīng)歷DNA中間階段，重組DNA技術(shù)不能直接運(yùn)用于動(dòng)物RNA病毒基因組的修飾與分析，而且RNA分子在體外較DNA分子更難以操作。近幾十年發(fā)展起來(lái)的反向遺傳學(xué)技術(shù)使這一問(wèn)題得到了近乎完美地解決，極大地促進(jìn)了對(duì)動(dòng)物RNA病毒分子生物學(xué)的研究，并衍生出了“反向疫苗學(xué)”等新興學(xué)科。

反向遺傳學(xué)技術(shù)是以生物基因?yàn)橹饕芯繉?duì)象，基于對(duì)基因核苷酸序列的人為操作，探索基因調(diào)控的分子機(jī)制以及生命發(fā)生發(fā)展的本質(zhì)現(xiàn)象和規(guī)律等。廣義的反向遺傳學(xué)技術(shù)是指與反向遺傳學(xué)操作相關(guān)的各種技術(shù)的統(tǒng)稱，包括定點(diǎn)突變、RNA干擾、基因沉默和基因體外轉(zhuǎn)錄等，是重組DNA技術(shù)應(yīng)用范圍的擴(kuò)展與延伸。狹義的反向遺傳學(xué)技術(shù)僅指基因體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)中的感染性cDNA克隆技術(shù)，即早期文獻(xiàn)中通稱的“病毒拯救”技術(shù)。本文僅對(duì)這一技術(shù)在動(dòng)物RNA病毒中的原理及應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行簡(jiǎn)述。

1　正鏈RNA病毒的反向遺傳操作技術(shù)

根據(jù)病毒的轉(zhuǎn)錄復(fù)制方式，正鏈RNA病毒可以分為兩類：第一類包括小RNA病毒科、黃病毒科等，病毒基因組僅轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生一種mRNA，然后翻譯為一個(gè)多聚體蛋白，由病毒本身或宿主細(xì)胞內(nèi)的酶切割為多個(gè)功能性蛋白；第二類包括披膜病毒科、杯狀病毒科、冠狀病毒科和動(dòng)脈炎病毒科等，其共有特征是通過(guò)轉(zhuǎn)錄為多個(gè)亞基因組RNAs來(lái)進(jìn)行基因表達(dá)。

正鏈RNA病毒基因組本身可以作為mRNA來(lái)利用宿主細(xì)胞的翻譯系統(tǒng)表達(dá)病毒蛋白，所以只要將其基因組RNA或其類似物導(dǎo)入合適的細(xì)胞系即可組裝出具有感染性的子代正鏈RNA病毒。因此正鏈RNA病毒的反向遺傳學(xué)操作相對(duì)容易獲得成功，其關(guān)鍵環(huán)節(jié)就是感染性分子克隆的精確構(gòu)建。感染性分子克隆包括感染性cDNA克隆和感染性體外轉(zhuǎn)錄本。

構(gòu)建感染性cDNA克隆是通過(guò)反轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增RNA病毒基因組的全長(zhǎng)或分段的cDNA片段，然后利用特定的限制性酶切位點(diǎn)將其克隆入合適的載體，使之受控于強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子并轉(zhuǎn)染適當(dāng)細(xì)胞系，病毒的全長(zhǎng)cDNA克隆轉(zhuǎn)錄為mRNA并啟動(dòng)感染循環(huán)，最終獲得有感染性的子代病毒顆粒。1981年，Racaniello等通過(guò)這種方法最先得到了具有感染性的脊髓灰質(zhì)炎病毒（PV）。感染性體外轉(zhuǎn)錄也是先通過(guò)RT-PCR獲得病毒基因組全長(zhǎng)cDNA克隆，在體外進(jìn)行轉(zhuǎn)錄獲得具有感染性的基因組RNA之后，用此RNA轉(zhuǎn)染適當(dāng)細(xì)胞系以獲得感染性的病毒顆粒。2003年，Baranowski等用這種方法得到了有侵染性的口蹄疫病毒（FMDV）。

在構(gòu)建RNA病毒的感染性分子克隆時(shí)，成功與否的另一個(gè)關(guān)鍵因素是病毒基因組的大小。一般而言，病毒基因組在15 kb以內(nèi)的比較容易拯救成功。但長(zhǎng)達(dá)28.5 kb的豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）已經(jīng)可以被成功克隆，這一技術(shù)的突破預(yù)示著所有RNA病毒理論上都能夠進(jìn)行反向遺傳操作。

2　負(fù)鏈RNA病毒的反向遺傳操作技術(shù)

負(fù)鏈RNA病毒根據(jù)其基因組結(jié)構(gòu)可分為兩大類：不分節(jié)段的博爾納病毒科、彈狀病毒科、副黏病毒科和絲狀病毒科；分節(jié)段的正黏病毒科、布尼亞病毒科和砂粒病毒科等。負(fù)鏈RNA病毒和正鏈RNA病毒最重要的區(qū)別就是其基因組RNA在宿主細(xì)胞體內(nèi)不能啟動(dòng)感染循環(huán)，即使其完全互補(bǔ)的正鏈基因組RNA（cRNA）也不能作為mRNA依賴宿主細(xì)胞的翻譯系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，因此也沒(méi)有感染性。只有病毒的基因組RNA與核衣殼蛋白、磷酸化蛋白以及依賴RNA的RNA聚合酶蛋白共同形成功能性的核糖核蛋白復(fù)合體（ribonucleoprotein complex， RNP）之后才具有感染性，即RNP的形成對(duì)負(fù)鏈RNA病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制是絕對(duì)必要的。負(fù)鏈RNA病毒的RNA聚合酶具有復(fù)制酶和轉(zhuǎn)錄酶的雙重功能，能夠識(shí)別其基因組內(nèi)部的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)和重啟信號(hào)。

負(fù)鏈RNA病毒反向遺傳操作體系主要包括基因組全長(zhǎng)感染性cDNA克隆的構(gòu)建及改造、輔助質(zhì)粒的構(gòu)建及功能性檢定、共轉(zhuǎn)染拯救病毒和新生子代病毒有關(guān)特性的鑒定與應(yīng)用等內(nèi)容。由于除了需要構(gòu)建精確的全長(zhǎng)cDNA克隆外，還必須使之在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄為基因組RNA時(shí)與核衣殼蛋白、磷酸化蛋白和RNA聚合酶蛋白共同結(jié)合形成RNP，只有這樣才有可能獲得具有感染性的子代病毒顆粒，因此負(fù)鏈RNA病毒反向遺傳操作體系的建立與正鏈RNA病毒相比更為復(fù)雜困難，負(fù)鏈RNA病毒拯救成功的實(shí)例也較正鏈RNA病毒少的多。負(fù)鏈RNA病毒反向遺傳操作體系的建立首先應(yīng)該歸功于Conzelmann團(tuán)隊(duì)于1994年建立的完全依賴質(zhì)粒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的狂犬病病毒RABV拯救體系，從此打開(kāi)了負(fù)鏈RNA病毒拯救的大門。2000年流感病毒IV的8質(zhì)粒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的建立標(biāo)志著以病毒拯救技術(shù)為代表的反向遺傳學(xué)操作技術(shù)進(jìn)入了一個(gè)高峰期。

3　雙鏈RNA病毒的反向遺傳操作技術(shù)

雙鏈RNA病毒包含一些對(duì)人或動(dòng)物造成重大危害的病毒，如雙RNA病毒科的傳染性法氏囊病病毒（IBDV）和呼腸孤病毒科中的藍(lán)舌病毒（BTV）、輪狀病毒（RV）、非洲馬瘟病毒（AHSV）等。其病毒基因組結(jié)構(gòu)為互補(bǔ)雙鏈RNA，在宿主細(xì)胞質(zhì)中以非對(duì)稱全保留的方式轉(zhuǎn)錄并復(fù)制產(chǎn)生子代病毒雙鏈RNA，最終與病毒蛋白組裝并出膜，完成一個(gè)完整的生命周期。

由于雙鏈RNA病毒結(jié)構(gòu)上的特殊性，其反向遺傳學(xué)操作具有相當(dāng)?shù)碾y度，其中呼腸孤病毒更是公認(rèn)的最難建立反向遺傳學(xué)操作體系的RNA病毒之一。借助于輔助病毒感染，Roner等于1990年最早建立了正呼腸孤病毒的反向遺傳操作體系；但是直到2004年，通過(guò)這一體系的不斷完善并應(yīng)用于對(duì)基因組包裝信號(hào)區(qū)域的初步定位，才標(biāo)志著呼腸孤病毒反向遺傳操作體系的正式成熟。盡管如此，目前雙鏈RNA病毒的反向遺傳操作體系的建立策略并不統(tǒng)一：IBDV的拯救基本上是采用感染性cDNA克隆體內(nèi)轉(zhuǎn)染的方法，而B(niǎo)TV和AHSV則主要是采用構(gòu)建感染性體外轉(zhuǎn)錄本的方法。

無(wú)論是采取感染性cDNA克隆體內(nèi)轉(zhuǎn)染的方法還是構(gòu)建感染性體外轉(zhuǎn)錄本，動(dòng)物RNA病毒反向遺傳操作技術(shù)的核心都是在合適的宿主細(xì)胞內(nèi)形成病毒基因組轉(zhuǎn)錄本RNA。早期病毒拯救體系的低效很大程度上是由于無(wú)法獲得具有精確末端的病毒基因組轉(zhuǎn)錄本RNA。現(xiàn)在的通行策略是在病毒基因組感染性cDNA分子克隆的兩端分別引入具備自剪切功能的核酶序列，一般是在病毒感染性cDNA分子克隆的5’末端引入具有3’末端剪切功能的錘頭狀核酶，在感染性cDNA分子克隆的3’末端引入具有5’末端剪切功能的丁肝核酶。另外通過(guò)密碼子優(yōu)化和調(diào)控序列的優(yōu)化都能在一定程度上提高病毒拯救的效率。病毒拯救體系的效率與轉(zhuǎn)染質(zhì)粒濃度和細(xì)胞密度均有一定關(guān)系，合適的質(zhì)粒濃度比和細(xì)胞密度都需要經(jīng)過(guò)大量的重復(fù)實(shí)驗(yàn)確定最優(yōu)比。同時(shí)輔助轉(zhuǎn)染表達(dá)病毒其他蛋白的質(zhì)?；蛘邩?gòu)建穩(wěn)定表達(dá)輔助蛋白的細(xì)胞系都能夠在一定程度上提高拯救病毒的效率。

4　動(dòng)物RNA病毒反向遺傳操作技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展

4.1研究病毒基因組復(fù)制與表達(dá)調(diào)控機(jī)理

1989年，Egelman等首先在對(duì)仙臺(tái)病毒（SeV）的研究中發(fā)現(xiàn)其病毒基因組核苷酸總數(shù)為6的倍數(shù)，隨后其他研究者在麻疹病毒（MV）及新城疫病毒（NDV）中也發(fā)現(xiàn)了這一規(guī)律，稱為“6堿基原則”。2000年，Peeters等[1]通過(guò)構(gòu)建NDV的微型基因組完美的證明了只有遵循“6堿基原則”的病毒基因組才能夠有效地轉(zhuǎn)錄、復(fù)制和包裝。

1999年，Peeters等[2]將NDV F基因的112位、115位和117位3個(gè)位點(diǎn)的非堿性氨基酸全部突變?yōu)閴A性氨基酸，得到了一株具有明顯強(qiáng)毒株特征的NDV毒株，證明了F基因裂解位點(diǎn)區(qū)的氨基酸序列是決定毒力的關(guān)鍵因素。而后Huang等[3]將NDV強(qiáng)毒株和弱毒珠的HN基因互換，獲救毒株的毒力均發(fā)生了變化，印證了F基因的裂解位點(diǎn)不是決定NDV毒力的唯一因素的假說(shuō)。2006年，Takayama-Ito等[4]將高度致弱的RABV毒株G蛋白的第333位替換為精氨酸后毒性復(fù)強(qiáng)。2011年，Rieder等[5]發(fā)現(xiàn)RABV的P蛋白基因中鏈區(qū)176～181位氨基酸序列的缺失導(dǎo)致病毒喪失了拮抗干擾素的能力。Hoffmann等通過(guò)構(gòu)建微型基因組證實(shí)，同源或異源病毒的順式作用序列對(duì)于病毒顆粒的殼體化和轉(zhuǎn)錄具有同樣的作用，但病毒顆粒的包裝出膜則嚴(yán)格依賴于同源病毒的順式作用序列。動(dòng)物RNA病毒基因組的末端序列富含轉(zhuǎn)錄調(diào)控信號(hào)，對(duì)于維持動(dòng)物RNA病毒的結(jié)構(gòu)和功能的完整性非常重要，因此無(wú)論正鏈還是負(fù)鏈RNA病毒基因組的復(fù)制和包裝，都必須具有精確的末端。Brown等[6]證實(shí)精確的3’端非編碼區(qū)對(duì)于拯救PV非常必要，非病毒末端的RNA轉(zhuǎn)染常導(dǎo)致產(chǎn)生缺失性突變體表型。國(guó)內(nèi)學(xué)者曾將以豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）北美株為骨架構(gòu)建的全長(zhǎng)cDNA克隆5’端非編碼區(qū)序列替換為PRRSV歐洲株的相應(yīng)序列，嵌合病毒失去了感染性。盡管目前著述眾多，然而末端調(diào)控序列對(duì)病毒拯救的確切影響尚無(wú)定論。

4.2構(gòu)建重組病毒載體和新型疫苗的研制

1996年，Bukreyev等用呼吸道合胞體病毒（RSV）表達(dá)了外源報(bào)告基因，對(duì)用獲救病毒做載體進(jìn)行了初步探索。Nakaya等[7]在NDV P和M基因之間插入了流感病毒的血凝素基因，構(gòu)建的重組病毒經(jīng)過(guò)小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明，其能夠抵抗致死劑量流感病毒的攻擊。Huang等[8]用重組NDV表達(dá)IBDV的VP2蛋白對(duì)NDV強(qiáng)毒株和IBDV強(qiáng)毒株的攻擊均能起到相當(dāng)良好的保護(hù)率。

基于對(duì)病毒基因組感染性cDNA克隆的改造，獲救病毒作為載體表達(dá)外源基因技術(shù)可以應(yīng)用于研制分子標(biāo)記疫苗和嵌合體疫苗。2001年，Peeters等[9]將NDV HN基因用含禽副黏病毒4型HN基因的嵌合體基因取代，救獲的嵌合體病毒不僅可以刺激機(jī)體產(chǎn)生對(duì)NDV強(qiáng)毒株的免疫保護(hù)，而且根據(jù)其對(duì)HN所產(chǎn)生的抗體及血清學(xué)分析即可區(qū)別疫苗免疫與野生毒感染。

對(duì)于沒(méi)有自然弱毒株的病毒，反向遺傳學(xué)操作技術(shù)在研究新型疫苗方面展現(xiàn)出巨大的優(yōu)勢(shì)。1997年前后，鵝源新城疫的暴發(fā)流行給我國(guó)的家禽養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，其病原即為基因VII型NDV。胡順林[10]、孫玉章[11]等先后構(gòu)建了鵝源NDV野毒株的全長(zhǎng)cDNA感染性克隆，在利用反向遺傳學(xué)操作技術(shù)獲得用于水禽新城疫防制的人工疫苗候選毒株方面進(jìn)行了有益地嘗試。作為一種高效的疫苗技術(shù)儲(chǔ)備，目前國(guó)內(nèi)已經(jīng)對(duì)多種動(dòng)物流感病毒和部分外來(lái)動(dòng)物疫病病原建立了反向遺傳操作技術(shù)平臺(tái)。

4.3研究病毒與宿主間的相互作用關(guān)系

應(yīng)用反向遺傳學(xué)技術(shù)研究病毒的受體具有很大的理論和技術(shù)優(yōu)勢(shì)，其中FMDV和RABV的研究已經(jīng)建立了相對(duì)成熟的研究模型，期包含兩種基本模式：一是通過(guò)反向遺傳學(xué)技術(shù)對(duì)病毒基因組的受體結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行人為突變，從而研究病毒與宿主受體間的相互作用；二是通過(guò)構(gòu)建表達(dá)宿主細(xì)胞受體的重組病毒，用于研究宿主細(xì)胞與病毒蛋白的相互作用。

Conzelamnn團(tuán)隊(duì)[12-15]應(yīng)用反向遺傳技術(shù)對(duì)RABV進(jìn)行基因重組和遺傳修飾，從而闡明了RABV在宿主神經(jīng)元內(nèi)的增殖和跨突觸傳播機(jī)理。有學(xué)者曾提出通過(guò)反向遺傳技術(shù)構(gòu)建禽-豬-人源戊肝病毒嵌合體來(lái)研究戊肝病毒的蛋白功能、組織嗜性以及跨種傳播機(jī)制等非常有意義。

通過(guò)對(duì)所構(gòu)建的病毒全長(zhǎng)cDNA感染性克隆進(jìn)行相應(yīng)功能基因的突變、缺失、插入和顛換等操作，然后利用救獲的子代病毒感染宿主細(xì)胞并檢測(cè)胞內(nèi)外免疫信號(hào)通路的變化，可以精確定位并探索病毒基因組及蛋白功能，從而可以更深入地研究病毒與宿主之間的相互修飾、相互影響的分子機(jī)制。

5　結(jié)語(yǔ)

作為目前國(guó)內(nèi)外眾多分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室必備的基礎(chǔ)技術(shù)平臺(tái)之一，反向遺傳學(xué)操作技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域，其應(yīng)用范圍不僅包括研究動(dòng)物病毒的基因復(fù)制與表達(dá)調(diào)控機(jī)理、病毒與宿主間的相互作用，還包括抗病毒策略與基因治療研究、構(gòu)建新型靶向病毒載體和進(jìn)行新型基因工程疫苗的研發(fā)，以及作為小反芻獸疫、施馬倫貝格病和非洲豬瘟等重大外來(lái)動(dòng)物疫病的基礎(chǔ)性防控技術(shù)儲(chǔ)備等。

近十幾年來(lái)，越來(lái)越多的國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室先后建立了多種動(dòng)物RNA病毒的反向遺傳操作體系，技術(shù)層面更加趨于簡(jiǎn)便高效。總體上來(lái)看，國(guó)內(nèi)的研究多集中于新型病毒載體或基因工程疫苗研究，與國(guó)外研究者更多集中于免疫信號(hào)通路等致病機(jī)理的研究熱點(diǎn)相比還有相當(dāng)差距。隨著分子生物學(xué)日新月異的發(fā)展，相信以后還會(huì)不斷有新發(fā)現(xiàn)或新改造的生物酶類或生物載體等作為強(qiáng)有力的分子工具，應(yīng)用到反向遺傳操作技術(shù)中來(lái)，從而不斷擴(kuò)大反向遺傳操作技術(shù)的應(yīng)用廣度和深度。

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（責(zé)任編輯：朱迪國(guó)）

Development and Application of the Reverse Genetics Technology for Animal RNA Viruses

Sun Yuzhang，Ni Xuexia，Li Jinming，Wu Faxing，Wang Yongling
（China Animal Health & Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032）

Abstract：In this review，the principle of reverse genetics technology was briefl y described for animal RNA viruses. Further，the development and the recent advances of this technology were introduced in viral gene replication and regulation mechanism，viral pathogenesis mechanism，virus-hostcell interactions and novel vaccine vectors over the past decades.

Key words：animal RNA viruses；reverse genetics technology；virus rescue；novel vaccines；development and application

中圖分類號(hào)：S851.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1005-944X（2016）05-0068-04

DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2016.05.022