袁萬哲，張 姍，陳 萍，張 超，經(jīng) 美，崔 元，孫繼國，劉聚祥（. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河北保定 0700；2. 河北省獸醫(yī)生物技術(shù)工程技術(shù)研究中心，河北保定 0700；.石家莊市獸用生物制品供應(yīng)站，河北石家莊 050000）

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禽腺病毒4型PCR檢測方法的建立與應(yīng)用

袁萬哲1，2，張 姍1，陳 萍1，2，張 超3，經(jīng) 美1，2，崔 元1，2，孫繼國1，2，劉聚祥1，2
（1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河北保定 071001；
2. 河北省獸醫(yī)生物技術(shù)工程技術(shù)研究中心，河北保定 071001；
3.石家莊市獸用生物制品供應(yīng)站，河北石家莊 050000）

摘 要：根據(jù)禽腺病毒4型（FAdV-4）Hexon基因核苷酸序列，設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增FAdV-4的PCR引物，建立了FAdV-4 PCR檢測方法。特異性和敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法可擴(kuò)增出954 bp的特異性核酸片段，而對(duì)禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒與禽腺病毒11型的檢測結(jié)果均為陰性，對(duì)FAdV-4的最低核酸檢出量為12.9 pg。該方法可用于禽腺病毒4型的臨床檢測與流行病學(xué)調(diào)查。

關(guān)鍵詞：禽腺病毒4型；PCR；檢測

2015年6月以來，我國多數(shù)省份的雞群發(fā)生了以心包積液、肝臟腫大為特征的疾病。該病主要發(fā)生于20～30日齡的肉雞，發(fā)病后4～8天為死亡高峰，病程為8～15天，死亡率達(dá)20%～30%。同時(shí)20～70日齡以及200～300日齡的蛋雞也有發(fā)生，但死亡率低于肉雞。通過病原分離鑒定和動(dòng)物回歸試驗(yàn)，本項(xiàng)目組最終確定該病的病原為禽腺病毒4型（fowl adenovirus 4，F(xiàn)AdV-4）[1-2]。目前，該病仍有發(fā)生與流行，給我國養(yǎng)雞業(yè)造成了一定的經(jīng)濟(jì)損失。

正確、快速診斷是科學(xué)防控禽腺病毒4型的前提與基礎(chǔ)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）由于特異性好、靈敏性高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，在動(dòng)物疫病檢測領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。目前國內(nèi)尚無檢測禽腺病毒4型的PCR檢測試劑盒及檢測方法。本項(xiàng)目組建立了禽腺病毒4型PCR檢測方法，并對(duì)2015年以來我國FAdV-4的流行情況進(jìn)行了監(jiān)測。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1毒株。新城疫病毒與H9亞型禽流感病毒（avian infl uenza virus，AIV）血凝抑制試驗(yàn)抗原購自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)有限公司；傳染性支氣管炎病毒（infectious bronchitis virus，IBV）與禽腺病毒11型（fowl adenovirus 11，F(xiàn)AdV-11）由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2試劑。病毒核酸提取試劑盒、dNTPs、2×Taq PCR Mix、M-MLV酶和DNA Marker DL2000均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank登錄的FAdV-4（GenBank ：GU188428.1）Hexon基因核苷酸序列，設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增FAdV-4的PCR引物。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，具體見表1。

表1　禽腺病毒4型PCR檢測引物

1.3病毒核酸提取

根據(jù)病毒核酸提取試劑盒說明書操作，簡述如下：加入20 μL Proteinase K于1.5 mL離心管中；在離心管中加入200 μL樣品，加入200 μL BB5，渦旋混合15 s，56 ℃孵育15 min；加入250 uL無水乙醇，渦旋混合15 s，室溫放置5 min；將溶液和沉淀一起加入離心柱中，12 000 ×g離心1 min，棄掉流出液。加入500 μL WB5，12 000 ×g離心1 min，棄掉流出液，重復(fù)一次。室溫12 000 ×g離心1 min，徹底去除殘留的乙醇，在室溫靜置數(shù)分鐘徹底晾干離心柱；將離心柱轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，并向離心柱中央加20 μL RNase-free Water，室溫靜置1 min。室溫12 000 ×g離心1 min，洗脫DNA/RNA，-20 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.4PCR

取反轉(zhuǎn)錄得到的產(chǎn)物cDNA或提取的DNA，進(jìn)行PCR鑒定。在25 μL體系里，按照比例加入cDNA/DNA 2 μL、2×TaqPCR Mix 12.5 μL、引物（10 uM）各0.5 μL和dd H2O 9.5 μL。94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性10 s，56 ℃退火30 s，72℃延伸57 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照。PCR結(jié)束后，取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.4.1特異性檢測。提取FAdV-4、AIV、NDV、IBV與FAdV-11核酸，按照如上方法進(jìn)行PCR，檢測該方法的特異性。其中AIV、NDV、IBV核酸先利用反轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。在20 μL體系里，依次加入RNA 11 μL、5×RT Buffer 4 μL、FAdV-4-decR（10 uM）2 μL、dNTP Mixture（2.5 mM）2 μL、RNasin（30 U/μL）、0.5 μL和M-MLV酶（2.5 U/μL）0.5 μL，42 ℃反轉(zhuǎn)錄 1 h，得到的產(chǎn)物為cDNA。

1.4.2敏感性檢測。對(duì)提取的病毒核酸用超微量分光光度計(jì)測定濃度后，對(duì)經(jīng)10倍系列稀釋的病毒核酸用以上反應(yīng)體系和程序進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，取等量 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.5臨床檢測

應(yīng)用建立的PCR方法，對(duì)山東、河北、河南、安徽、山西等地送檢的30份臨床樣本進(jìn)行檢測。

2　結(jié)果

2.1PCR產(chǎn)物鑒定

按照優(yōu)化的PCR反應(yīng)體系與條件，進(jìn)行FAdV-4擴(kuò)增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。FAdV-4陽性樣本擴(kuò)增產(chǎn)物條帶大小為954 bp（圖1）。回收PCR產(chǎn)物，經(jīng)連接轉(zhuǎn)化后測序證實(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物均為FAdV-4特異性核酸片段。

2.2PCR特異性檢測

特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，含有FAdV-4的核酸樣品能擴(kuò)增出與預(yù)期大小相符的954 bp條帶，而禽流感病毒、禽腺病毒11型、傳染性支氣管炎病毒與新城疫病毒均未擴(kuò)增出任何條帶，說明該方法具有較好的特異性（圖2）。

2.3PCR敏感性檢測

用超微量分光光度計(jì)測得FAdV-4核酸濃度為129.3 ng/μL。應(yīng)用優(yōu)化后的PCR方法對(duì)10倍稀釋的FAdV-4核酸模板進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，該P(yáng)CR最低能檢測到12.9 pg/μL核酸模板（圖3）。

圖1　禽腺病毒4型PCR檢測

圖2　PCR特異性檢測

圖3　PCR敏感性檢測

2.4臨床檢測

應(yīng)用30份臨床送檢樣本分別用建立的PCR方法進(jìn)行檢測，21份臨床樣本為FAdV-4陽性，其中山東、河北、山西、河南等地均有檢出。

3　討論

2015年6月以來，我國山東、河南、河北、遼寧、安徽、吉林等地區(qū)的雞群發(fā)生了以心包積液、肝臟腫大為特征的疾病。根據(jù)病變，該病被稱為“雞心包積液-肝炎綜合征”。該病主要發(fā)生于20～30日齡的肉雞，同時(shí)20～70日齡以及200～300日齡的蛋雞也有發(fā)生，但死亡率低于肉雞。臨床病例最早可見7日齡的雛雞發(fā)病。雞死亡前均正常采食，無明顯臨床表現(xiàn)而倒地死亡。目前，該病的發(fā)病區(qū)域還在不斷擴(kuò)大，給我國養(yǎng)雞業(yè)造成了一定的經(jīng)濟(jì)損失?，F(xiàn)已證實(shí)，該病的病原為禽腺病毒4型。該病最早于1987年在巴基斯坦卡拉奇市附近的安卡拉地區(qū)發(fā)生，故也稱為安卡拉病[3]。我國之前尚未見該病大面積發(fā)生與流行的報(bào)道。

禽腺病毒4型臨床表現(xiàn)與雞包涵體肝炎等容易混淆，而且感染后期易繼發(fā)禽流感、大腸桿菌等，通過臨床觀察與剖檢手段很難確診，需要采用實(shí)驗(yàn)室手段進(jìn)行診斷。傳統(tǒng)的病毒分離普遍具有操作繁瑣、時(shí)間長以及敏感性差等缺點(diǎn)。PCR由于特異性好、靈敏性高等優(yōu)點(diǎn)，在動(dòng)物疫病檢測領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。目前國內(nèi)尚無檢測禽腺病毒4型的PCR檢測試劑盒及檢測方法。

本研究首次應(yīng)用PCR 技術(shù)針對(duì)禽腺病毒4型Hexon基因進(jìn)行檢測，建立了一種快速、敏感、特異的FAdV-4檢測方法。該方法最低能檢測12.9 pg/μL FAdV-4 核酸模板，可用于禽腺病毒4型的臨床監(jiān)測與流行病學(xué)調(diào)查。對(duì)2015年至2016年的30份臨床送檢樣本分別用PCR進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)21份臨床樣本為FAdV-4陽性，檢出率比較高的是肝臟與脾臟樣品，肺臟與腎臟的樣品中偶有檢出，因此建議臨床發(fā)病后可采集肝臟與脾臟檢測。在臨床送檢樣本中，最早發(fā)病的為7日齡海蘭灰蛋雞，臨床表現(xiàn)為典型的心包積液與肝炎，肝臟與脾臟中均有FAdV-4被檢出。該雞是水平感染的還是垂直感染的，有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] 袁萬哲，李玉保，王建昌，等. 雞心包積液-肝炎綜合征的初步研究[J]. 中國獸醫(yī)科學(xué)，2016，46（2）：157-160.

[2] 袁萬哲. 科學(xué)防控雞心包積液—肝炎綜合征[J]. 中國動(dòng)物保健，2016，18（2）：35-35.

[3] 扈榮良. 現(xiàn)代動(dòng)物病毒學(xué)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2014，681-683.

（責(zé)任編輯：朱迪國）

Development and Application of PCR Assay for Detection on Fowl Adenovirus 4

Yuan Wanzhe1，2，Zhan Shan1，Chen Ping1，2，Zhang Chao3，Jing Mei1，2，Cui Yuan1，2，Sun Jiguo1，2，Liu Juxiang1，2
（1. College of Animal Medicine，Agriculture University of Hebei，Baoding，Hebei 071001；
2. Hebei Engineering and Technology Research Center of Veterinary Biotechnology，Baoding，Hebei 071001；3. Shijiazhuang Animal biological Products Supply Station，Shijiazhuang，Hebi 050000）

Abstract：According to Hexon gene sequence of fowl adenovirus 4（FAdV-4）published in GenBank，one pair of specifi c primers was designed for amplifying the specifi c fragments. PCR assay was developed for detection of FAdV-4. The sensitivity and specifi city detections suggested that the PCR assay was so sensitive that it could detect the 12.9 pg level. Specifi c PCR products of 954bp could be amplifi ed by the PCR assay. But the detection results for avian infl uenza virus，newcastle disease virus，infectious bronchitis virus and fowl adenovirus 11 by the PCR assays were all negative. The PCR assay developed in this study can be applied widely in clinical diagnosis and fi eld surveillance of FAdV-4 infection.

Key words：fowl adenovirus 4（FAdV-4）；PCR；detection

中圖分類號(hào)：S852.65

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1005-944X（2016）05-0072-03

DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2016.05.023

基金項(xiàng)目：河北省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系蛋雞產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)專項(xiàng)資金；正定縣科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目