戴燕燕　陳茂華

[摘要] 目的 分析GDNF基因啟動子在人體膠質瘤Ⅰ區(qū)區(qū)間的H3組蛋白乙?；╝cetylization）修飾情況以及人體膠質瘤的GDNF基因啟動子表達方式。 方法 選取正常腦組織20例，實施反轉錄（RT-PCR）的檢測方法來檢測GDNF基因啟動子的相關表達方式，在實時定量熒光PCR（Real-time PCR）的基礎上建立好染色質免疫沉淀（CHIP）。 選取人體膠質瘤20例，實施反轉錄的檢測方法來檢測GDNF基因啟動子的相關表達方式，在此基礎上建立好CHIP方法分析GDNF基因啟動子在Ⅰ區(qū)區(qū)間的H3組蛋白乙酰化的相關修飾情況。 結果 實時定量熒光PCR方法在檢查人體膠質瘤GDNF基因啟動子方式的表達方面，隨著RT-PCR的檢測水平級別升高而升高，轉錄水平中的正常組以及高低級別組之間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。 結論 GDNF基因啟動子在人體膠質瘤Ⅰ區(qū)區(qū)間的H3組蛋白乙?；揎椙闆r很有可能會影響到GDNF基因的相關表達方式。

[關鍵詞] 人體膠質瘤；GDNF；基因啟動子；蛋白乙?；?；修飾情況

[中圖分類號] R739.4 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2015）35-0001-04

[Abstract] Objective To analyze the H3 protein histone acetylation modification conditions in I region of human gliomas GDNF gene promoter and to explore the expression of human glioma GDNF gene promoter. Methods A total of 20 cases of patients with normal brain tissue were chosen， and the detection method of reverse transcription （RT-PCR） was used to detect the associated expression method of GDNF gene promoter. On the basis of real-time quantitative fluorescent PCR （Real-time PCR）， Chromatin immunoprecipitation （CHIP） was established. 20 cases of patients with human glioma were chosen， and reverse transcription method was implemented to detect the relevant expression of GDNF gene promoter. On this basis， CHIP method was established to analyze the H3 protein histone acetylation modification conditions in I region of human gliomas GDNF gene promoter. Results By real-time quantitative fluorescent PCR method in checking human glioma GDNF gene expression， with the elevated detected levels of RT-PCR， the expression amount increased. There were statistically significant differences in comparing the normal-level transcription group， the low-level transcription group and the high-level transcription group （P<0.05）. Conclusion H3 protein histone acetylation modification conditions in I region of human gliomas GDNF gene promoter is likely to affect the related expression of GDNF-related genes.

[Key words] Human glioma； GDNF； Gene promoter； Histone acetylation； Modification conditions

人體膠質瘤是人體顱腦內比較常見的腫瘤，膠質瘤的死亡率較高，僅次于肺癌。根據相關資料顯示，患膠質瘤以后在3年的時間內患者的死亡率達95.8%[1-3]。另外，膠質瘤的發(fā)生與發(fā)展是一個非常復雜的過程，為了找出更理想的治療路徑，本文主要結合表觀遺傳學來分析其具體的治療方法。膠質瘤的相關病因在目前尚不清楚，但是隨著細胞學、分子生物研究學以及遺傳學等學科的發(fā)展，目前的相關研究資料表明，膠質瘤的發(fā)生是一個繁瑣而又復雜的過程，其中主要包括一些進行性的改變，從而導致細胞失控性增長。筆者將結合相關實際情況，分析GDNF基因啟動子在人體膠質瘤（Human glioma）Ⅰ區(qū)區(qū)間的H3組蛋白乙?；╝cetylization）修飾情況以及人體膠質瘤的GDNF基因啟動子表達方式，現總結報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

美國PE公司的擴增儀（型號為Optima 8000），德國EKSHGN公司的核酸蛋白檢測儀（型號為ClearFirst-5000Process型），北京儀器廠的轉移電泳儀（型號為EPS-200）。

1.2 主要試劑

提取染色質，聚合酶鏈反應試劑（深圳生物科技有限公司），PCR試劑盒，凝膠電泳試劑（上海生物科技有限公司），細胞培養(yǎng)，傳代試劑（北京生物科技有限公司）。

1.3 組織來源

采取蘇州大學醫(yī)學倫理委員會審批的40例標本，選取正常腦組織20例（正常對照組，其中低水平10例，高水平10例），20例人體膠質瘤組織，低水平10例，高水平10例，按照相關實驗結果進行科學分析。

1.4 試驗方法

采用定時定量熒光水平檢測方法檢測人體膠質瘤GDNF基因啟動子，提取反轉錄以及RNA，按照相關實驗的說明書進行如下操作：先將0.5 μg/μL primer加入Real-time PCR試管中混勻，放入60℃孵育箱，保持10 min，10 min之后迅速降溫處理，之后再加入20 U/μL的FHVHJKHIHGVIOGHUIHYGU，在上述的一系列工作之后立即使用 PCR檢測。

制備標準線，針對GDNF基因啟動子，合成PCR引物，以293細胞為主要模板，在此基礎上使用GDNF基因啟動子以及HGVKSJHO基因引物進行擴增。收回擴增產物，在接連回收之后構建好TA載體，轉化DH細胞組織。選取菌落鑒定克隆基因形態(tài)，培養(yǎng)質粒次序并送去檢測順序，用計算機拷貝基因數。另外，將質粒數按照10倍稀釋的拷貝數來進行稀釋，稀釋鏈為1×101 COPIES/μL，1×103 COPIES/μL，1×107 COPIES/μL，1×105 COPIES/μL，1×106 COPIES/μL。將稀釋之后的樣品作為定時定量熒光水平檢測方法，再得到CT數值，制作好標準曲線。

1.5 染色質免疫共沉淀檢測方法（CHIP-PCR）

根據染色質免疫共沉淀試劑盒的說明書來進行簡單介紹，使用交聯(lián)方法，采用1%左右的甲醛溶液細胞固定液，在常溫下孵育5 min，在最終濃度為125 mM時，停止交聯(lián)反應。去除含蛋白酶的抑制劑，分解細胞組織。用預冷的洗滌劑洗滌2次或者2次以上，每次均為10 mL左右。

采用超聲破碎DNA，將EP管注入到超聲破碎池中，保持10 min左右，保留上清。染色質免疫共沉淀檢測方法（CHIP-PCR）：將樣品分為2份，每一份樣品取20 μL存放于零下1℃的冷藏室內，做好相關標記后往實驗室的管中加入GWPOHGHN HIOISH 500 μL中。另外，轉移上清液放入到新的EP管中，每次均為250 μL，將記錄好的IP對應細胞組織中，與此同時去掉元磁珠。采用JHGHOLGH SEPARATIONG RACK放置于零下1℃的冷藏室內。除掉上清中的染色質，如果有相關需要保存好持續(xù)分析。

PCR驗證染色質免疫共沉淀檢測方法（CHIP-PCR），按照相關試劑盒說明書來驗證PCR，將DNA樣品配置到定時定量熒光水平檢測方法（Real-time PCR）的相關方法中。簡而言之，就是把樣品加入之后進行測量PCR的方法。需滿足以下3個方面的熱循環(huán)條件：其一，10 min 95℃預變性；其二，60 s 95℃變性；其三，30 s 72℃延伸性。

1.6 觀察指標

觀察蛋白乙?；l(fā)生在N一端堿性氨基酸集中區(qū)的特定賴氨酸殘基，轉移到賴氨酸的sNH3+中和掉1個正電荷。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS13.0 統(tǒng)計學軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多個樣本均數的比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 人體膠質瘤組織中GDNF基因啟動子轉錄水平與正常腦組織比較

GEHIGH結果顯示，正常腦組織以及人體膠質瘤低高級別組中的表達量隨著級別的升高而顯著提高；實時定量熒光PCR方法在檢查人體膠質瘤GDNF基因啟動子方式的表達方面，隨著RT-PCR的檢測水平級別升高而升高，轉錄水平中的正常對照組以及高低級別組之間差異比較大，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。在膠質細胞源性神經營養(yǎng)因子（GDNF mRNA）的表達方面，正常組以及高低級別組之間差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1、圖1、2。

2.2 GDNF基因啟動子H3組蛋白乙?；闆r

CHIP實驗不僅能夠檢測蛋白以及相關的蛋白修飾，還能檢測到與DNA相互結合的蛋白。舉例來說，蛋白乙酰化以及蛋白磷酸化的上述特質都以特異性抗體來進行相關實驗，通過交聯(lián)方式來使DNA蛋白以及蛋白-蛋白之間的作用固定在活性狀態(tài)中。在超聲治療的基礎上把基因破摔成片段，片段大約在100～1200 BP大小，以此加入到抗體的沉淀中去，在此時，沉淀物的抗體有著特異的作用，將蛋白與蛋白-DNA之間的相互作用進行合理的研究與聯(lián)系，最終將以DNA的模板進行Real-time PCR分析方法，最終判斷為人體膠質瘤GDNF基因啟動因子在人體膠質瘤（Human glioma）Ⅰ區(qū)區(qū)間的H3組蛋白乙?；╝cetylization）修飾情況，具體分析H3組賴氨酸殘基（Lysine residues）9位乙酰化的具體情況，見圖3。

3討論

膠質細胞源性神經營養(yǎng)因子（GDNF mRNA）是一種轉化生長因子的大家族，在發(fā)生人體膠質瘤的過程中有著重要的地位和作用。本文的相關實驗結果表明，GDNF基因啟動子在人體膠質瘤的組織表達中有著明顯升高的趨勢，這與張陽等[3]學者在慢病毒介導新型Tet-On系統(tǒng)調控大鼠GDNF和TH雙基因表達對帕金森病大鼠的實驗研究一文中的相關研究報道結果是保持高度一致的[4-6]。因此，對GDNF基因啟動因子的相關研究是能夠有效發(fā)現人體膠質瘤的重要指標之一。因此，本文的主要研究目的是綜合分析并明確確定GDNF基因啟動子在人體膠質瘤（human glioma）Ⅰ區(qū)區(qū)間的H3組蛋白乙酰化（acetylization）修飾情況，具體分析H3組賴氨酸殘基（lysine residues）9位乙?；木唧w情況，從中研究出人體膠質瘤（human glioma）的GDNF基因啟動子表達方式以及相關影響。

在本次的相關實驗中，對CHIP（染色質免疫共沉淀）方法對正常腦組織組以及高、低級別膠質瘤內的GDNF基因啟動子Ⅰ區(qū)區(qū)間的H3組蛋白乙?；╝cetylization）修飾情況進行適度的檢測。表觀遺傳學（epigenetics）的相關研究是在核苷酸沒有發(fā)生任何改變的基礎上進行一系列的研究分析，表觀遺傳學在發(fā)生可遺憾的變化時能夠系統(tǒng)地分析出遺傳學的相關分支，其主要分支包括以下幾個方面的內容：其一，基因甲基化；其二，蛋白質乙?；?；其三，蛋白質磷酸化；其四，蛋白質糖基化；其五，蛋白質泛素化。在真核細胞的相關研究中有82.5%～92.5%的蛋白質存在著乙?；那闆r（這其中包括組蛋白以及非組蛋白）。采用比較高分辨率的研究質譜可以有效檢測到蛋白上的對乙酰化點。在檢查乙?；c之外，還可以檢測到DNA復制以及損傷的情況（主要以蛋白質為主）。另外，與轉錄因子相關的調節(jié)部分以及轉錄部分其代謝的酶以及蛋白等都存在乙酰化酶。從上述情況來看，乙?；诘鞍踪|以及細胞組織的基本生理過程中有著非常重要的作用，與歐雅莉等[7]學者在靜脈移植轉染GDNF基因的人臍血CD34+細胞改善局灶性腦缺血大鼠的神經功能一文中的相關研究結果是保持高度一致的。

本文的相關研究結果顯示實時定量熒光PCR方法在檢查人體膠質瘤GDNF基因啟動子方式的表達方面，隨著RT-PCR的檢測水平級別升高而升高，轉錄水平中的正常組以及高低水平組之間差異較大，具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。在膠質細胞源性神經營養(yǎng)因子（GDNF mRNA）的表達方面，正常組以及高低水平組之間差異較大，具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。由此我們可以得知GDNF的作用與營養(yǎng)細胞的相關組織細胞有著密切的關系，能夠有效提高GDNF的表達方式[8-10]。

人體膠質瘤的發(fā)生機制目前尚不完全清楚，然而隨著遺傳學以及生物學科等相關研究在不斷的進步，使人體膠質瘤的發(fā)生機制能夠更加清晰。目前的相關研究表明，人體膠質瘤中也包括了細胞失控性增殖，膠質細胞源性神經營養(yǎng)因子（GDNF mRNA）被認為是人體正常細胞組織中的重要介質。經過陳睿等學者在IRES序列連接的人GDNF基因和EGFP基因逆轉錄病毒真核表達載體的構建及鑒定一文中的相關研究結果顯示，GDNF具有促使細胞分化的相關作用，以其形式體被有機合成[11-13]。對于人類而言，很多營養(yǎng)神經因子參與了膠質瘤的相關生物學作用。在GDNF的相關形成因子中，GDNF的基因位于第五號染色體Ⅰ區(qū)（p12～p13），能夠提高1個啟動因子和4個外顯子。啟動子Ⅱ中活性高于Ⅰ區(qū)，從而促進轉錄的作用；另外，在人體膠質瘤的相關細胞組織中，GDNF的表達方式上升得比較明顯，GDNF的作用與營養(yǎng)細胞的相關組織細胞有著密切的關系[14-20]。

綜上所述，GDNF基因啟動子在人體膠質瘤（human glioma）Ⅰ區(qū)區(qū)間的H3組蛋白乙酰化（acetylization）修飾情況很有可能會影響到GDNF基因的相關表達方式。

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（收稿日期：2015-10-10）