周長(zhǎng)朋，王東武，鄭文鳳，許　潔，徐利娜

(迪沙藥業(yè)集團(tuán)國(guó)家認(rèn)定企業(yè)技術(shù)中心質(zhì)量研究院，山東　威?！?64205)

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離子色譜/直接電導(dǎo)法測(cè)定利格列汀藥物中三氟乙酸殘留

周長(zhǎng)朋*，王東武，鄭文鳳，許潔，徐利娜

(迪沙藥業(yè)集團(tuán)國(guó)家認(rèn)定企業(yè)技術(shù)中心質(zhì)量研究院，山東威海264205)

利格列汀(Linagliptin)，又名利拉列汀，化學(xué)名8-[(3R)-3-氨基-1-哌啶基]-7-(2-丁炔-1-基)-3,7-二氫-3-甲基-1-[(4-甲基-2-喹唑啉基)甲基]-1H-嘌呤-2,6-二酮，由8-溴-3,7-二氫-3-甲基-1H-嘌呤-2,6-二酮經(jīng)3次取代反應(yīng)和水解反應(yīng)制成[1-2]，其合成路線見圖1。利格列汀屬于二肽基肽酶-Ⅳ抑制劑，能夠有效提高腸促胰素水平，刺激胰島素釋放，改善患者的血糖水平，但很少引起低血糖，不會(huì)導(dǎo)致體重增加[3]。利格列汀不僅可單藥用于經(jīng)生活方式干預(yù)不能控制血糖、不能服用或不耐受二甲雙胍的2型糖尿病患者，也可與其他降糖藥或基礎(chǔ)胰島素聯(lián)合使用，可明顯改善2型糖尿病患者的糖化血紅蛋白、空腹和餐后2 h的血糖，且其主要由膽汁經(jīng)腸道排出體外，對(duì)于肝腎功能不全者無(wú)需調(diào)整劑量，是治療2型糖尿病患者的新途徑[4-5]。

圖1　利格列汀的合成路線圖Fig.1　Graphical synthetic routes of linagliptin

三氟乙酸(TFA)作為一種酸性有機(jī)溶劑，屬于四類溶劑，臨床使用存在毒性。利格列汀在合成過(guò)程中以三氟乙酸作為催化劑，必須嚴(yán)格控制其殘留量。目前，國(guó)內(nèi)檢測(cè)三氟乙酸的方法主要有液相色譜法[6-7]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8-9]和離子色譜法[10-15]。液相色譜法的靈敏度較低，且對(duì)色譜柱損害極大；氣相色譜法需衍生后氣化，樣品處理方法復(fù)雜；而離子色譜在檢測(cè)陰離子時(shí)具有靈敏度高、重復(fù)性好、方便快捷等優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)于環(huán)境監(jiān)測(cè)、生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)、電子化工等領(lǐng)域[16-18]。離子色譜在藥物領(lǐng)域內(nèi)已得到廣泛應(yīng)用，主要用于檢測(cè)合成反應(yīng)中殘留的無(wú)機(jī)酸[10-11,15]、各類陰離子[19]和陽(yáng)離子殘留[20],但國(guó)內(nèi)卻未見采用離子色譜法測(cè)定利格列汀藥物中三氟乙酸殘留的報(bào)道。本文建立了離子色譜/直接電導(dǎo)法測(cè)定利格列汀藥物中三氟乙酸殘留的方法，并且采用液-液萃取法配制供試品溶液。該方法簡(jiǎn)單、快速，回收率好、靈敏度高，能夠?qū)Φ蜐舛鹊娜宜徇M(jìn)行定性與定量分析，填補(bǔ)了利格列汀藥物中三氟乙酸殘留檢測(cè)研究的空白，有利于實(shí)現(xiàn)利格列汀合成反應(yīng)過(guò)程中三氟乙酸殘留的有效監(jiān)測(cè)。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

ICS-2000離子色譜儀(美國(guó)TheromFisher公司)：配有ASRS-ULTRA 4 mm陰離子抑制器和電導(dǎo)檢測(cè)器； CR22GⅡ落地式高速冷凍離心機(jī)(日本Hitachi公司)；超聲波清洗機(jī)(昆山超聲儀器有限公司)；DV215CD精密分析天平(日本OHAUS公司)；Milli-Q超純水儀(美國(guó)Millipore公司)；0.45 μm水系濾膜(上海津騰公司)。

三氟乙酸(純度≥99%，阿拉丁公司)；甲醇、乙腈(色譜級(jí)，德國(guó)Merck公司)；二氯甲烷(優(yōu)級(jí)純，天津大茂化學(xué)試劑廠)；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水(電阻率為18.2 MΩ·cm)；利格列汀藥品(自制)。

1.2溶液的制備

對(duì)照品溶液：準(zhǔn)確稱取三氟乙酸10.0 mg于10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，混勻后配成1.0 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4 ℃密封保存。取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用水配成4.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液，即為三氟乙酸對(duì)照品溶液。

供試品溶液：準(zhǔn)確稱取利格列汀藥品100 mg于15 mL具塞玻璃離心管中，加少量二氯甲烷溶解后再加水混合后超聲，4 000 r/min離心5 min，取上層水相置于10 mL玻璃容量瓶?jī)?nèi)，加水定容至刻度。

系統(tǒng)適用性溶液：取三氟乙酸、利格列汀適量，按供試品溶液配制方法配成含三氟乙酸4 μg/mL、利格列汀10 mg/mL的溶液，此溶液作為系統(tǒng)適用性溶液。以上溶液均需過(guò)0.45 μm水系濾膜后進(jìn)行色譜分析。

1.3色譜條件

色譜柱：Ionpac AS11-HC(4 mm×25 cm)陰離子交換色譜柱及相應(yīng)的Ionpac AG11-HC(4 mm×5 cm)保護(hù)柱；流動(dòng)相：20 mmol/L氫氧化鉀溶液(EGⅢ在線生成)；流速：1.2 mL/min；檢測(cè)器:ASRS 500-4 mm陰離子抑制器，抑制電流60 mA；電導(dǎo)檢測(cè)器；柱溫30 ℃；電導(dǎo)池溫度35 ℃；進(jìn)樣體積25 μL。

2結(jié)果與討論

2.1溶劑的選擇

利格列汀易溶于甲醇、乙腈、二氯甲烷等有機(jī)溶劑，幾乎不溶于水。實(shí)驗(yàn)嘗試在水中分別加入10%甲醇和10%乙腈進(jìn)行配制，利格列汀均能完全溶解，但在進(jìn)入色譜儀后發(fā)現(xiàn)大量有機(jī)物分別在4.0 min和5.5 min出峰，且峰形較寬，影響三氟乙酸的峰形及信噪比。本文借鑒食品中藥物殘留檢測(cè)的液液萃取方法[21]，將利格列汀溶于二氯甲烷后再用水萃取三氟乙酸，利格列汀及其他有機(jī)物仍留在二氯甲烷層，進(jìn)色譜儀后背景較為干凈，無(wú)任何有機(jī)物峰，且三氟乙酸峰形良好。10%甲醇、10%乙腈及二氯甲烷-水萃取配制供試品溶液的色譜圖見圖2。

圖2　10%甲醇(A)、10%乙腈(B)及二氯甲烷-水(C)配制三氟乙酸系統(tǒng)適用性溶液的色譜圖Fig.2　Chromatograms of trifluoroacetic acid(TFA) in 20% methanol(A),20%acetonitrile(B) and dichloromethane-water(C)

表1　不同流速和不同淋洗液濃度的篩選結(jié)果

2.2色譜條件的選擇

采用的Ionpac AS11-HC陰離子交換柱為高容量陰離子柱，匹配NaOH或KOH淋洗液可用于無(wú)機(jī)陰離子和有機(jī)酸的陰離子分析，適合大體積進(jìn)樣測(cè)定痕量陰離子。文獻(xiàn)[10]采用1.3 mL/min、30 mmol/L的KOH作為淋洗液，雖然三氟乙酸出峰較快、峰形較好，但與硫酸根的分離度差。而文獻(xiàn)[15]采用0.8 mL/min、15 mmol/L的KOH作為淋洗液，三氟乙酸與氯離子可獲得較好的分離度，但與碳酸根峰重疊，且硝酸根與硫酸根在20 min內(nèi)均不能出峰。本文嘗試分別以0.8，1.0，1.2 mL/min的流速和15，20，30 mmol/L KOH淋洗液濃度匹配篩選后發(fā)現(xiàn)，以1.2 mL/min流速、20 mmol/L KOH淋洗液作為色譜條件時(shí)，三氟乙酸與碳酸根和硫酸根離子的分離度最好(見表1)。

2.3系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

分別取空白溶液和系統(tǒng)適用性溶液，按照“1.3”方法注入離子色譜儀，記錄色譜圖。從圖3可觀察到，三氟乙酸的保留時(shí)間約為7.7 min，與碳酸根離子及其他峰均能實(shí)現(xiàn)有效分離。

2.4檢出限、定量下限與精密度

取三氟乙酸31.80 mg，加水稀釋成0.031 8 μg/mL的溶液，按照“1.3”方法注入離子色譜儀，記錄色譜圖，以信噪比S/N=3計(jì)算得到三氟乙酸的檢出限為0.031 8 μg/mL，以S/N=10計(jì)算得到三氟乙酸的定量下限為0.106 μg/mL。取三氟乙酸對(duì)照品溶液，進(jìn)行離子色譜分析，重復(fù)進(jìn)樣6次，三氟乙酸保留時(shí)間和峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.2%和4.4%。

圖4　利格列汀空白溶液(a)及添加4.0 μg/mL三氟乙酸后(b)的色譜圖Fig.4　Chromatograms of linagliptin blank(a) and linagliptin blank spiked with 4.0 μg/mL TFA(b)

2.5線性范圍與回收率

在雜質(zhì)限度150%范圍內(nèi)，分別配制定量下限(0.106 μg/mL)、20%限度(0.848 μg/mL)、50%限度(2.12 μg/mL)、100%限度(4.24 μg/mL)、150%限度(6.36 μg/mL)6個(gè)濃度的系列溶液，按照本方法進(jìn)行離子色譜分析，以峰面積(Y)對(duì)質(zhì)量濃度(X，μg/mL)作曲線，得線性回歸方程為Y=0.072 5X-0.016 1，相關(guān)系數(shù)r=0.999 4。

采用不含三氟乙酸的利格列汀藥品為空白基質(zhì)，添加80%限度、100%限度、120%限度濃度的三氟乙酸對(duì)照品進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，平均回收率為91.5%～97.8%，RSD為0.27%～0.65%(表2)。利格列汀空白溶液及添加三氟乙酸后的色譜圖見圖4。

表2　利格列汀中三氟乙酸的加標(biāo)回收率

2.6實(shí)際應(yīng)用

采用所建方法對(duì)合成的利格列汀藥物小試3批、中試3批及工藝驗(yàn)證3批共27份樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果檢出1批樣品中含有三氟乙酸殘留(圖5)，其他樣品均未檢出。

3結(jié)論

本文建立了離子色譜/直接電導(dǎo)法測(cè)定利格列汀藥物中三氟乙酸殘留的分析方法，并采用液-液萃取方法配制供試品溶液，該方法快捷、有效、靈敏，回收率、精密度及定量下限均能滿足要求，是檢測(cè)利格列汀藥物中三氟乙酸殘留的有效方法。將所建方法用于檢測(cè)利格列汀藥物小試3批、中試3批及工藝驗(yàn)證3批共27份樣品，檢出1批樣品含有三氟乙酸殘留。方法有效地指導(dǎo)了利格列汀合成反應(yīng)的進(jìn)行，對(duì)項(xiàng)目研發(fā)過(guò)程起到了良好的監(jiān)督作用。

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實(shí)驗(yàn)技術(shù)

摘要：建立了離子色譜/直接電導(dǎo)法測(cè)定利格列汀藥物中三氟乙酸殘留的方法。利格列汀藥物經(jīng)二氯甲烷溶解后加水進(jìn)行萃取，水相過(guò)濾膜后直接進(jìn)樣。采用EGⅢ在線發(fā)生20 mmol/L氫氧化鉀溶液為淋洗液，以Ionpac AS11-HC(4 mm×25 cm)色譜柱及Ionpac AG11-HC(4 mm×5 cm)保護(hù)柱進(jìn)行分離，流速為1.2 mL/min，ASRS 500-4 mm陰離子抑制器和電導(dǎo)檢測(cè)器抑制并直接檢測(cè)，抑制電流60 mA，柱溫30 ℃，進(jìn)樣體積25 μL。結(jié)果表明，三氟乙酸與碳酸根離子及其他成分的分離度良好，三氟乙酸在0.848～6.46 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.999 4)，檢出限(LOD)為0.031 8 μg/mL，定量下限(LOQ)為0.106 μg/mL。該方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、重現(xiàn)性好，可用于利格列汀藥物中三氟乙酸殘留的檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：離子色譜-直接電導(dǎo)法；三氟乙酸；利格列汀

Determination of Trifluoroacetic Acid(TFA) Residues in Linagliptin Drugs by Ion Chromatography with Direct ConductanceZHOU Chang-peng*,WANG Dong-wu,ZHENG Wen-feng,XU Jie,XU Li-na

(Quality Research Institute of National Enterprise Technology Center of Disha Pharmaceutical Group，Weihai264205，China)

Abstract：An ion chromatographic method was developed for the determination of trifluoroacetic acid(TFA) residues in linagliptin drugs.After dissolved with dichlomethane and extracted with water，the samples were loaded onto the instument.The determination was performed on an Ionpac AS11-HC(4 mm×25 cm) column with an IonpacAG11-HC(4 mm×5 cm) guard column.The eluent was 20 mmol/L potassium hydroxide solution produced on-line with EGⅢ KOH at a flow rate of 1.2 mL/min.TFA was detected by suppressed conductivity with an ASRS 500-4 mm suppressor at a current of 60 mA.The column temperature was set at 30 ℃ and the injection volume was 25 μL.There was a good resolution between trifluoroacetic acid and other components.The calibration curve showed a good linearity(r=0.999 4) in the range of 0.848-6.46 μg/mL.The limit of detection(LOD) was 0.031 8 μg/mL and the limit of quantitation(LOQ) was 0.106 μg/mL.The method has the advantages of simple operation,high sensitivity and good reproducibility,and could be used for the detection of trifluoroacetic acid(TFA) residues in linagliptin drugs.

Key words：ion chromatography with direct conductance;trifluoroacetic acid(TFA)；linagliptin

中圖分類號(hào)：O657.75;TQ460.72

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1004-4957(2015)12-1425-05

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2015.12.017

通訊作者：*周長(zhǎng)朋，工程師，研究方向：理化檢測(cè)及藥物分析，Tel：0631-3857373，E-mail：20019568@qq.com

收稿日期：2015-06-11；修回日期：2015-06-29