孫 雨,王曉英,董 浩,曲 萍,胡冬梅,趙柏林,石 慧,宋曉暉
(中國動物疫病預(yù)防控制中心,北京102600)
專論與綜述
牛羊包蟲病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)的研究進(jìn)展
孫 雨,王曉英,董 浩,曲 萍,胡冬梅,趙柏林,石 慧,宋曉暉
(中國動物疫病預(yù)防控制中心,北京102600)
包蟲病是由寄生于犬、狼、狐貍等動物小腸的棘球絳蟲中絳期(棘球蚴)感染中間宿主而引起的一種嚴(yán)重的人與動物共患寄生蟲病。其確診除需要常規(guī)的臨床診斷外,還依賴于血清學(xué)、分子生物學(xué)以及影像學(xué)等實(shí)驗(yàn)室診斷方法。文章從包蟲病的流行病學(xué)特點(diǎn)、細(xì)粒棘球絳蟲的結(jié)構(gòu)及生活史、包蟲病的實(shí)驗(yàn)室檢測和診斷技術(shù)進(jìn)行綜述,并對實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)確診包蟲病的前景進(jìn)行了展望,以期為包蟲病的臨床快速診斷和深入研究提供一定的參考。
包蟲??;流行病學(xué);實(shí)驗(yàn)室診斷
包蟲?。╤ydatidosis)是由棘球絳蟲的幼蟲寄生于人及牛羊豬等多種哺乳動物的肝、肺等內(nèi)臟器官,成蟲寄生于犬、狼、狐等食肉動物腸道所致的人畜共患寄生蟲?。?]。包蟲病呈全球性分布,尤其以放牧或半農(nóng)半牧為主要畜牧業(yè)生產(chǎn)方式的國家為主。該寄生蟲的蚴體生長力強(qiáng),體積大,不僅壓迫周圍組織使之萎縮和功能障礙,還易造成繼發(fā)感染,如果蚴體包囊破裂,可以引起過敏反應(yīng),甚至導(dǎo)致死亡,嚴(yán)重威脅公共安全和畜牧業(yè)生產(chǎn),影響社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展[2]。我國政府高度重視包蟲病的防控工作,農(nóng)業(yè)部將其列為二類動物疫病,衛(wèi)生部將其列入丙類傳染病。包蟲病防治工作目前存在防控手段單一、流行區(qū)域流行形勢復(fù)雜、缺乏防控技術(shù)規(guī)范等問題,已經(jīng)
成為一個世界性的難題。2010年,農(nóng)業(yè)部、衛(wèi)生部等14個部委聯(lián)合印發(fā)了《防治包蟲病行動計劃(2010—2015年)》,極大地推動了我國包蟲病防控工作進(jìn)展。但由于包蟲病流行區(qū)經(jīng)濟(jì)和社會發(fā)展水平相對滯后,地理環(huán)境復(fù)雜,自然條件惡劣,宗教習(xí)俗多樣,農(nóng)牧民群眾科學(xué)文化知識普及率較低,防治機(jī)構(gòu)和隊伍不健全,動物宿主種類多、數(shù)量大、分布廣、管理難度大等因素,我國包蟲病防控工作仍然面臨諸多困難和巨大挑戰(zhàn)。本文從包蟲病流行特點(diǎn)、細(xì)粒棘球絳蟲的結(jié)構(gòu)及生活史、包蟲病的檢測和診斷技術(shù)的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述,以期為包蟲病的臨床快速診斷和深入研究提供一定的參考。
1.1病原分類
包蟲又名棘球絳蟲(Echinococcu spp.),在分類上屬于帶科(Taeniidae)、棘球?qū)伲‥chinococcus)。棘球?qū)侔?個種,即細(xì)粒棘球絳蟲(E.granulosus)、多房棘球絳蟲(E.multilocularis)、石渠棘球絳蟲(E.shiquius)、少節(jié)棘球絳蟲(E.oligarthtus)和福氏棘球絳蟲(E.vogeli),我國以前3個種較為多見[3-9]。其中對人畜危害最嚴(yán)重的為細(xì)粒棘球絳蟲,可分為多個基因型,包括羊種(G1、G2)、牛種(G3、G5)、馬種(G4)、駱駝種(G6)、豬種(G7)及G8,以及在波蘭的豬上發(fā)現(xiàn)的第9基因型(G9)和在歐亞的馴鹿上發(fā)現(xiàn)的第10基因型(G10)。在我國主要流行細(xì)粒棘球絳蟲G1基因型[10-13]。
1.2病原的基本形態(tài)特征
棘球絳蟲的成蟲長度2~7 mm,由頭節(jié)和3~4個節(jié)片組成。頭節(jié)上有4個吸盤,頂突上有36~40個小鉤。成蟲的孕節(jié)內(nèi)含有一套雌雄同體的生殖器官,生殖孔位于節(jié)片側(cè)緣的后半部。孕節(jié)的長度遠(yuǎn)大于寬度,約占蟲體長度的一半,并有多對子宮側(cè)枝,內(nèi)部充滿蟲卵。包蟲的蚴體為包囊狀構(gòu)造,內(nèi)含液體。棘球蚴的形狀常常因寄生部位的不同而有變化,一般近似球形,直徑5~10 mm。棘球蚴的囊壁分為兩層:外層為乳白色的角質(zhì)層,內(nèi)層為胚層,又稱生發(fā)層,前者由后者分泌而成。胚層向囊腔芽生出成群的細(xì)胞,這些細(xì)胞空腔化后形成一個小囊,并長出一個小蒂與胚層相連。這些小囊能夠生成數(shù)量不等的原頭蚴,因此這些小囊又被稱為育囊或者生發(fā)囊[1]。
2.1傳染來源與傳播途徑
人、綿羊、山羊和牛等中間宿主的感染多因直接接觸犬和狐貍,經(jīng)口感染蟲卵,或因吞食被蟲卵污染的水、草、食物和蔬菜等而感染;工人在處理和加工狐貍與狼的皮毛時也容易感染該病。犬科動物主要是食入了帶有棘球蚴的動物內(nèi)臟組織器官而感染該病。人感染包蟲病主要是通過消化道傳入,也有報道稱蟲卵能與塵埃混合隨風(fēng)通過呼吸道傳入人體內(nèi)[14-16]。該病還可以通過破損的皮膚以及胎盤感染給人。我國甘肅曾報道過陰道包蟲病的病例,在衛(wèi)生習(xí)慣不良的情況下,蟲卵帶入陰道被分泌物消化,在經(jīng)細(xì)微損傷直接植入陰道粘膜下,逐漸形成了陰道包蟲?。?]。
2.2易感宿主
人、綿羊、山羊、牛和豬等家畜均是較敏感的中間宿主,其中人和綿羊較為易感。該病寄生于動物內(nèi)臟器官和全身臟器中,尤其寄生于肝和肺臟,犬和犬科動物是該病的終末宿主,寄生于小腸[17]。
2.3棘球絳蟲的生活史
棘球絳蟲寄生于犬、狼、狐貍的小腸,蟲卵和孕節(jié)隨終末宿主的糞便排出體外,中間宿主隨污染的牧草和飲水吞食蟲卵后而感染。蟲卵內(nèi)的六鉤蚴進(jìn)入中間宿主體內(nèi)后在消化道孵出,鉆入腸壁,隨血流或淋巴散布到體內(nèi)各處,以肝和肺內(nèi)最為常見。在中間宿主機(jī)體內(nèi),蟲卵經(jīng)過6~12個月的生長可成為具有感染性的棘球蚴。犬、狐貍等終末宿主吞食了含有棘球蚴的臟器后即得到感染,經(jīng)過40~50 d發(fā)育為細(xì)粒棘球絳蟲,成蟲在犬、狐貍等動物體內(nèi)的壽命為5~6個月[18-20]。
2.4流行與分布
包蟲病呈全球性分布,尤其以畜牧業(yè)(如羊、牛等)為主的國家較為嚴(yán)重。中國、蒙古、土耳其、土庫曼斯坦、敘利亞、黎巴嫩、阿根廷、巴西、智利、澳大利亞、新西蘭以及非洲一些國家均是包蟲病的重要流行國家[21]。其中對畜牧業(yè)危害最為嚴(yán)重的細(xì)粒棘球絳蟲有著不同的基因型,包括羊種(G1、G2)、牛種(G3、G5)、馬種(G4)、駱駝種(G6)、豬種(G7)及G8,第9基因型(G9)在波蘭的豬上發(fā)現(xiàn),第10基因型(G10)在歐亞的馴鹿上發(fā)現(xiàn)[22]。羊種G1蟲株目前是最易感染人的,也是世界上分布最廣的,其在羊上的高感染率表明其也是感染人的基因變異型,與人間在摩洛哥、突尼斯、肯尼亞、哈薩克斯坦、阿根廷及中國西部的高流行性一致[23]。我國是人畜棘球蚴病高發(fā)國家之一,主要由細(xì)粒棘球絳蟲引起。目前在我國有10種有蹄家畜均有不同程度的感染:綿羊、山羊、牦牛、黃羊、水牛、駱駝、馬、驢、騾以及豬,其中綿羊受感染的程度最為嚴(yán)重,受威脅最大。自1905年我國青島首次報道人體棘球蚴病以來,現(xiàn)已在23個省、自治區(qū)和直轄市發(fā)現(xiàn)原發(fā)的人和動物棘球蚴病,其中新疆、青海、甘肅、四川、寧夏、內(nèi)蒙古和西藏呈嚴(yán)重的地方性流行,為我國棘球蚴病高發(fā)區(qū)。我國包蟲病的流行區(qū)人群平均患病率1.08%,囊型包蟲病病灶出現(xiàn)突然破裂,可致過敏性休克而死亡,而未經(jīng)治療的泡型包蟲病患者10年病死率高達(dá)94%,被稱為“蟲癌”[24]。
3.1酶聯(lián)免疫吸附法
酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)是近幾年關(guān)注較多的一種檢測包蟲病的方法,并有可能取代皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn),用于樣品的大規(guī)模初篩檢測[25]。對中間宿主開展免疫診斷時,可用囊液、抗原B(AgB)、粗提原頭節(jié)蛋白為包被抗原進(jìn)行ELISA檢測。尤其是抗原AgB具有非常好的免疫原性,能夠識別出80%包蟲病患病動物,同時它在調(diào)節(jié)宿主免疫應(yīng)答反應(yīng)中也具有很重要的作用。目前使用的檢測包蟲病的ELISA方法大多為間接ELISA方法,其優(yōu)點(diǎn)是快速、簡便、可用于大規(guī)模定性檢測。但由于AgB抗原具有明顯的變異和多態(tài)性。同時差異分子生物學(xué)結(jié)果顯示,AgB在寄生蟲生活史的不同階段的表達(dá)存在差異,所以AgB作為抗原包被用于ELISA檢測動物血清,其敏感性較差,還需檢測方法輔助進(jìn)行確證[26]。
3.2皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)
皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)是一種速發(fā)型變態(tài)反應(yīng),用于檢測包蟲病時操作簡單,并且可在短時間內(nèi)觀察結(jié)果,一般認(rèn)為其陽性檢出率可達(dá)90%以上,但特異性較低,不同寄生蟲病之間有明顯的交叉反應(yīng)。因此,皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)不能作為確診的依據(jù),也不宜用于療效考核,只能在流行區(qū)對可疑患病動物起過篩作用[27]。
3.3免疫PCR法
免疫PCR法(immuno-PCR)是利用抗原抗體反應(yīng)的特異性和PCR擴(kuò)增反應(yīng)的極高靈敏性而建立的一種微量抗原檢測技術(shù)。免疫PCR是在ELISA的基礎(chǔ)上建立起來的新方法,用PCR擴(kuò)增代替ELISA的酶催化底物顯色[20]。PCR具有很強(qiáng)的放大能力,其可以定量地檢測DNA和RNA,具有非常高的敏感性和特異性,因此,將與抗原結(jié)合的特異抗體通過連接分子與DNA結(jié)合,再經(jīng)PCR擴(kuò)增,由此定量檢測抗原使敏感性高于ELISA和RIA。這種方法比酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和酶免疫法(ELA)等傳統(tǒng)方法更靈敏。Immuno-PCR識別一抗和二抗的靈敏度高達(dá)108。Immuno-PCR由待測抗原、生物素化抗體、親和素 (連接分子)、生物素化DNA、PCR擴(kuò)增5部分構(gòu)成。目前主要用于檢測腫瘤、細(xì)胞因子、神經(jīng)內(nèi)分泌活性多肽、微生物抗原、各種活性酶、衣原體和各種寄生蟲等微量抗原。該方法用于包蟲病診斷的優(yōu)點(diǎn)是可以提高其診斷的特異性和敏感性。缺點(diǎn)是該方法尚處于研究階段,配套試劑尚缺乏,在檢測寄生蟲領(lǐng)域也屬于摸索階段,試驗(yàn)的條件、優(yōu)化方法和程序需要進(jìn)一步完善。
3.4環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法
環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4種特異引物,利用一種鏈置換型DNA聚合酶(Bst DNApolymerase)在恒溫65℃左右保溫幾十分鐘快速進(jìn)行核酸擴(kuò)增的方法。該技術(shù)已開始廣泛應(yīng)用于各種病毒、細(xì)菌、寄生蟲等引起的疾病檢測,以及進(jìn)出口快速診斷中,并得到了世界上許多國家的認(rèn)同[28]。LAMP方法在檢測包蟲病方面的優(yōu)勢除了高特異性、高靈敏度外,操作十分簡單,對儀器設(shè)備要求低,一臺水浴鍋或恒溫箱就能實(shí)現(xiàn)反應(yīng),結(jié)果的檢測也很簡單,不需要像PCR那樣進(jìn)行凝膠電泳,反應(yīng)的結(jié)果通過肉眼觀察白色渾濁或綠色熒光的生成來判斷,簡便快捷,適合基層快速診斷。其缺點(diǎn)是該方法靈敏度非常高,一旦開蓋容易形成氣溶膠污染,加上目前國內(nèi)大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室不能嚴(yán)格分區(qū),假陽性問題比較嚴(yán)重,建議在進(jìn)行試劑盒的研發(fā)過程中采用實(shí)時渾濁儀,不要把反應(yīng)后的PCR管打開。同時該方法對引物設(shè)計要求也比較高。
3.5抑制差減雜交法
抑制差減雜交(suppression subtractive hybridization,SSH)技術(shù)是基于抑制PCR和差減雜交技術(shù)建立的簡單有效的方法,通過一次差減雜交可使低豐度的序列(mRNA)得以高于1 000倍的富集,有效地選擇性擴(kuò)增目標(biāo)序列,同時抑制非目標(biāo)序列的擴(kuò)增,因此在分離基因特別是分離低豐度差異表達(dá)基因方面具有更廣闊的應(yīng)用前景[20]。在轉(zhuǎn)錄水平上研究基因表達(dá)的技術(shù),具有穩(wěn)定、高效、可靠的特點(diǎn),可對生物的生長、發(fā)育、衰老、死亡等生命過程及生物或非生物逆境脅迫對生物所造成的影響等進(jìn)行全面、系統(tǒng)的分析。該方法便于應(yīng)用在尋找與寄生蟲不同發(fā)育階段相關(guān)的差異表達(dá)基因和與寄生蟲抗藥性相關(guān)的差異表達(dá)基因,以及其他相關(guān)基因的研究,如與不同蟲株、不同宿主或性別差異相關(guān)的基因[29]。在細(xì)粒棘球絳蟲發(fā)育過程中,可通過此技術(shù)得到不同發(fā)育期差異表達(dá)的基因,并將這些基因用于診斷和防治包蟲病。該方法是一種高效鑒定和分離克隆差異表達(dá)基因的新技術(shù),其優(yōu)點(diǎn)是高效、便捷和假陽性率低,在檢測包蟲病方面有一定的應(yīng)用前景。但是,目前在寄生蟲學(xué)研究中的應(yīng)用不是很多,因?yàn)镾SH方法一般只用于兩個樣品的差異比較分析,對于多個樣品則無能為力,這在很大程度上限制了它的應(yīng)用。
3.6實(shí)時熒光定量PCR法
實(shí)時熒光定量PCR(quantitative real-time,QPCR)技術(shù)是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中,以熒光化學(xué)物質(zhì)測每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。該方法在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號累計監(jiān)測整個PCR過程,最后通過特定數(shù)學(xué)原理對未知模板進(jìn)行定量分析[20,30]。由于在PCR擴(kuò)增的指數(shù)時期,模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系,所以成為定量的依據(jù)。目前實(shí)時熒光定量PCR法主要包括熒光嵌合法和熒光探針法兩種。該方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食源微生物、食品過敏源、轉(zhuǎn)基因、乳品企業(yè)微生物等檢測領(lǐng)域。國內(nèi)外寄生蟲領(lǐng)域的學(xué)者也開始使用該方法檢測包蟲病。該方法的優(yōu)點(diǎn)是實(shí)時定量檢測寄生蟲體基因核酸,具有比化學(xué)發(fā)光、時間分辨、蛋白芯片等免疫學(xué)方法更獨(dú)到的優(yōu)勢;其缺點(diǎn)是對實(shí)驗(yàn)儀器與實(shí)驗(yàn)室條件要求較高,成本較貴,在獸醫(yī)基層包蟲病防治過程中推廣較難。
在世界范圍內(nèi),包蟲病仍是引起家畜發(fā)病和死亡的重要原因之一。目前,分子生物學(xué)和免疫學(xué)檢測技術(shù)的發(fā)展,尤其是ELISA方法以及PCR方法的不斷改進(jìn),為包蟲病診斷新技術(shù)的建立提供了機(jī)遇,也促使包蟲病患畜的早期診斷與發(fā)現(xiàn)有了重大突破。但是現(xiàn)有的包蟲病診斷技術(shù)中,病原的分離培養(yǎng)十分繁瑣和困難,血清學(xué)診斷存在較多的假陽性現(xiàn)象,抑制差減雜交操作過程繁瑣、時間長、要求高。近年來發(fā)展起來的環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)、免疫PCR技術(shù)以及實(shí)時熒光定量PCR等檢測技術(shù)具有簡單、快速、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),若能將這些技術(shù)應(yīng)用到包蟲病的診斷上,將會對該病的診斷和控制發(fā)揮重要的作用。鑒于包蟲病的生活史和流行范圍以及宿主眾多,徹底消除該病的傳播還很困難,應(yīng)使用適合的方法及時準(zhǔn)確地進(jìn)行檢測,從而為包蟲病的預(yù)防和控制提供依據(jù)。所以加強(qiáng)檢測與監(jiān)測、定期驅(qū)蟲、控制傳染源、阻斷流行環(huán)節(jié),對控制與減少地方性包蟲病的流行具有非常重要的作用。
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Research Progress in the Epidemiological Characteristics and Diagnosis Technology of Hydatidosis
Sun Yu,WangXiaoying,SongXiaohui,et al
(China Animal Disease Control Center,Beijing102600,China)
Hydatidosis is a serious zoonosis,which is parasitic on animals such as dogs,wolf and fox in the small intestine. Diagnosis methods ofhydatidosis include clinical symptoms,while a final diagnosis is depended on laboratorydiagnostic methods,such as serological diagnosis,imaging diagnosis,and molecular biological diagnosis.In order to provide some reference for the clinical rapid diagnosis and deep research of hydatidosis,the epidemiological features of hydatidosis,structure and life history of echinococcus,the laboratory tests and diagnostic technology of hydatidosis were reviewed in this paper.In addition,the prospects for the diagnosis ofhydatidosis in laboratorywere discussed at the end ofthe article.
hydatidosis;epidemiology;laboratorydiagnosis
S852.7
A
2095-3887(2016)01-0049-04
10.3969/j.issn.2095-3887.2016.01.014
2015-10-12
農(nóng)業(yè)部動物疫病監(jiān)測與防治項(xiàng)目
孫雨,男,獸醫(yī)師,博士,主要從事人畜共患病預(yù)防控制研究。
宋曉暉,女,高級獸醫(yī)師,博士,主要從事草食動物疫病預(yù)防控制研究。