姜自生 （山東省臨沂市蘭山區(qū)畜牧獸醫(yī)局半城畜牧獸醫(yī)站 276036）

鴨疫里氏桿菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

姜自生 （山東省臨沂市蘭山區(qū)畜牧獸醫(yī)局半城畜牧獸醫(yī)站 276036）

1 試驗(yàn)材料與儀器

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 病料來源

病料來源于臨沂市太平鎮(zhèn)某養(yǎng)鴨場飼養(yǎng)的18日齡病死肉鴨。2015年8月7日。臨沂市太平鎮(zhèn)某鴨場飼養(yǎng)的18日肉鴨陸續(xù)出現(xiàn)發(fā)病死亡。病鴨咳嗽。搖頭或點(diǎn)頭?；杷?。眼鼻流漿性分泌物。腳軟。不愿走動。排白色或黃綠色稀糞。剖檢見纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎。心包積液。心外膜增厚。頸、胸、腹氣囊混濁增厚。內(nèi)有多量呈絮狀或塊狀的纖維素性滲出物。肝腫大、質(zhì)脆、呈土黃色或棕紅色。脾腫大。小腸粘膜出血。發(fā)病率達(dá)45%左右。病死率達(dá)10%。病初曾用氟苯尼考治療效果不佳。死亡數(shù)逐日上升。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑

普通營養(yǎng)瓊脂 （由北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)）、肉湯培養(yǎng)液 （由北京中海生物科技有限公司生產(chǎn)）、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基 （青島高科園海博生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)）、腸桿菌生化常規(guī)微量鑒定管 （由浙江省軍區(qū)后勤部衛(wèi)生防疫檢疫檢驗(yàn)所生產(chǎn)）、豬血清 （由中國獸藥檢查所生產(chǎn)）枸櫞酸鈉、蒸餾水等。

1.1.3 藥敏試驗(yàn)紙片

由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院獸醫(yī)藥理教研室提供 （批號 150613）。

1.1.4 試驗(yàn)動物

試驗(yàn)用小白鼠 （18±3g）。由山東醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校實(shí)驗(yàn)動物中心提供。12日齡肉鴨購于山東六合公司臨沂商品肉鴨孵化場。

1.2 試驗(yàn)儀器

DY04-13-44-00壓力蒸汽滅菌器桶。SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱。SW-WJ-LCU潔凈工作臺。恒溫培養(yǎng)箱。SA3000PL光學(xué)顯微鏡。電子天平。電熱爐 （中國龍口市先科儀器公司）。常用玻璃器皿等。

2 試驗(yàn)方法

2.1 培養(yǎng)基的制備

2.1.1 麥康凱培養(yǎng)基的制備

用電子天平稱取13.5g麥康凱瓊脂。溶于盛有250ml蒸餾水的錐形瓶中。在電熱爐上加熱攪拌至完全溶解。取10個洗凈烘干的培養(yǎng)皿。進(jìn)行分裝。每個培養(yǎng)皿倒入20ml麥康凱瓊脂溶液。采用高壓蒸汽滅菌法。在103.4kPa的蒸汽壓下121℃加熱20分鐘對初步配置的麥康凱培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌。冷卻備用。

2.1.2 半固體培養(yǎng)基的制備

用電子天平稱取3.8g營養(yǎng)肉湯瓊脂。溶于盛有100ml蒸餾水的錐形瓶中。再向錐形瓶中加入0.5g的瓊脂粉。在電熱爐上加熱攪拌至完全溶解。取10個洗凈烘干的試管。進(jìn)行分裝。每個試管倒入5ml溶液。高壓蒸汽滅菌。冷卻備用。

2.1.3 血液培養(yǎng)基的制備

用電子天平稱取9.5g營養(yǎng)瓊脂。溶于盛有200ml蒸餾水的錐形瓶中。在電熱爐上加熱攪拌至完全溶解。高壓滅菌后待涼至45℃～50℃。然后加入20ml脫纖無菌血。混勻進(jìn)行分裝。避免污染。冷卻待用。

2.1.4 肉湯培養(yǎng)基的制備

用電子天平稱取1.5g肉湯瓊脂。溶于盛有50ml蒸餾水的錐形瓶中。加熱攪拌至完全溶解。分裝時每個試管倒入5ml溶解的肉湯瓊脂。高壓蒸汽滅菌后備用。

2.1.5 普通瓊脂培養(yǎng)基的制備

用電子天平稱取13.5g普通瓊脂粉。溶于盛有200ml蒸餾水的錐形瓶中。在電熱爐上邊加熱邊攪拌至完全溶解。取洗凈烘干的培養(yǎng)皿。進(jìn)行分裝。每個培養(yǎng)皿倒入20ml普通瓊脂溶液。采用高壓蒸汽滅菌法。在103.4kPa的蒸汽壓下121℃加熱20分鐘對初步配置的普通瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌。冷卻備用。

2.2 分離培養(yǎng)

無菌操作取病料標(biāo)本。在超凈工作臺中用滅菌的接種環(huán)將病料分別依次接種于麥糠凱培養(yǎng)基、血液瓊脂培養(yǎng)基、巧克力培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基和肉湯培養(yǎng)液。置蠟燭缸內(nèi)37℃恒溫箱中厭氧培養(yǎng)48～72h。觀察并記錄其生長變化情況[1]。

2.3 培養(yǎng)物涂片染色鏡檢

取上述培養(yǎng)物涂片。干燥。革蘭氏染色及瑞士染色鏡檢觀察。

2.4 運(yùn)動性觀察

在潔凈工作臺用滅菌的接種針挑取血液培養(yǎng)基可疑菌落。垂直穿入半固體培養(yǎng)基中心接近試管底部。然后迅速沿原路退出。滅菌接種針。將試管置蠟燭缸內(nèi)37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。觀察結(jié)果。

2.5 生化試驗(yàn)

取經(jīng)分離純化的菌株進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn) （包括葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇）、靛基質(zhì)試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)等。置蠟燭缸內(nèi)37℃厭氧培養(yǎng)72h以上。觀察其生長情況。

2.6 動物致病性試驗(yàn)

取6只小白鼠隨機(jī)分成試驗(yàn)組。對照組和健康組。試驗(yàn)組小白鼠每只腹腔注射濃度為4×1010CFU/ml的細(xì)菌普通血清肉湯培養(yǎng)液0.5ml；對照組的每只小白鼠腹腔注射0.5ml的無菌血清肉湯培養(yǎng)液。觀察小白鼠發(fā)病死亡情況。將死亡小白鼠心血、肝組織接種于麥糠凱培養(yǎng)基和巧克力培養(yǎng)基。37℃恒溫箱中培養(yǎng)24～48h后。涂片、革蘭氏染色鏡檢。觀察是否為接種菌株[2]。

2.7 動物回歸試驗(yàn)

取健康18日齡肉鴨6只。隨機(jī)分為試驗(yàn)組和對照組。每組3只。試驗(yàn)組每只腹腔注射接種含菌肉湯0.5ml。對照組腹腔注射同劑量的無菌普通血清肉湯進(jìn)行對照。觀察肉鴨的發(fā)病死亡情況。將死亡肉鴨心血、肝組織接種于麥糠凱培養(yǎng)基和巧克力培養(yǎng)基。37℃恒溫箱中培養(yǎng)24～48h后。涂片、革蘭氏染色鏡檢。觀察是否為接種菌株[3]。

2.8 藥敏試驗(yàn)

采用紙片平板擴(kuò)散法 （K-B法）觀察分離菌對20種不同抗菌藥物在體外的敏感性。將分離的細(xì)菌接種到普通血清肉湯培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)24h后。稀釋至菌含量為107個/ml（與標(biāo)準(zhǔn)比濁管比較）。于普通瓊脂平板上用稀釋的菌液均勻涂布。然后取各種藥敏紙片貼附在含菌瓊脂平板上。置于37℃培養(yǎng)24h后測抑菌圈直徑。根據(jù)抑菌圈大小確定菌株對藥物的敏感性[6]。

判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌直徑＜10mm為耐藥；抑菌直徑10～15mm為中度敏感；抑菌直徑＞15mm為高敏。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

3.1 流行病學(xué)、臨床病理學(xué)診斷結(jié)果

根據(jù)上述流行病學(xué)、臨床癥狀和病理剖檢變化。該發(fā)病鴨符合鴨傳染性漿膜炎的流行特點(diǎn)、臨床癥狀和病理變化特征。可初步診斷為鴨傳染性漿膜炎[4]。

3.2 分離培養(yǎng)物的形態(tài)特征

該分離菌在普通瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上不生長；在血液培養(yǎng)基上長出凸起、閃光、呈奶油狀小菌落。不溶血；在巧克力瓊脂平板上形成圓形、突起、表面光滑、邊緣整齊的半透明、微閃光。直徑約1～1.5mm的菌落。符合鴨疫里氏桿菌的生長特性。

3.3 分離培養(yǎng)物涂片染色鏡檢結(jié)果

分離物經(jīng)涂片革蘭氏染色鏡檢見G-、無芽胞小桿菌。菌體大小為0.2～0.3×1～4μm。單個或成雙短小桿菌；經(jīng)瑞氏染色鏡檢。細(xì)菌兩極著色明顯。符合鴨疫里氏桿菌的形態(tài)特征。

3.4 運(yùn)動性觀察結(jié)果

培養(yǎng)物穿刺血清半固體培養(yǎng)基37℃厭氧培養(yǎng)48～72h。培養(yǎng)物沿穿刺線生長。證明該細(xì)菌無鞭毛。不能運(yùn)動。符合鴨疫里氏桿菌的病原特性。

3.5 生化試驗(yàn)結(jié)果

分離菌株的生化試驗(yàn)符合鴨疫里氏桿菌的生化特性。該菌不發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、木糖、山梨醇；不產(chǎn)生H2S。不還原硝酸鹽；V-P試驗(yàn)和M.R試驗(yàn)均為陰性。靛基質(zhì)試驗(yàn)、尿酶試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)陽性。

3.6 動物致病性試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)小白鼠攻毒72h后。小白鼠稍有精神不振。但未發(fā)生將死亡。剖殺小白鼠取心血、肝組織接種于巧克力培養(yǎng)基。37℃恒溫箱中厭氧培養(yǎng)24～48h后?？苫厥盏酱司?。這與鴨疫里氏桿菌的致病特性一致。該菌能致死豚鼠。但不致死家兔和小白鼠。

3.7 動物回歸試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)鴨攻毒24h即出現(xiàn)呼吸增粗、眼腫、眼半閉癥狀。37h死去1只。未死的2只鴨子消瘦?？s頭。毛松。不吃料。不飲水。拉綠色稀糞。眼圈濕。站立不穩(wěn)。東倒西歪。有時頭扭向兩側(cè)。至46h這只鴨子亦死亡。對照組3只鴨子全部健活。將死亡鴨子剖檢。皆見注射部位發(fā)炎。有大量淡黃色較濃稠的滲出物。37h前死亡的1只鴨子見氣囊壁輕度渾濁。纖維素性心包炎較明顯。3只肝臟皆腫大。色黑紅。46h死亡的鴨子見肝臟極度腫大。心包膜、肝被膜、氣囊壁表面皆有大量纖維素性滲出物覆蓋。腹腔有少量淡黃色腹水。用死鴨心、肝、腦進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng) （條件同上）和鑒別試驗(yàn)。結(jié)果同上。證明試驗(yàn)攻毒菌與自然發(fā)病病原菌相同。觀察肉鴨的發(fā)病死亡情況。將死亡肉鴨心血、肝組織接種于麥糠凱培養(yǎng)基和巧克力培養(yǎng)基。37℃恒溫箱中厭氧培養(yǎng)24～48h后。涂片、革蘭氏染色鏡檢。觀察與3.2相同。說明分離均為致病菌 [5]。

3.8 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

采用紙片平板擴(kuò)散法 （K-B法）觀察分離菌對不同抗菌藥物在體外對分離菌的敏感性。結(jié)果分離菌對頭孢曲松、頭孢噻呋、痢菌凈高敏；對左氧氟沙星、丁胺卡那霉素、氨芐青霉素、環(huán)丙沙星中度敏；對氟苯尼考、慶大霉素、安普霉素、恩諾沙星、新霉素、阿莫西林等產(chǎn)生了廣泛的耐藥。

4 討論

（1）鴨傳染性漿膜炎容易與大腸桿菌病和巴氏桿菌病混淆。有時還會與鴨沙門氏菌病及鴨衣原體病混淆。不能輕易地作出診斷。同時還要注意幾種病原混合感染的可能性。注意多種病菌混合感染。單從臨床癥狀或病理變化難以確診。必須結(jié)合實(shí)驗(yàn)室診斷方可確診。避免誤診影響疫情控制。

（2）本試驗(yàn)檢測了該場鴨疫里氏桿菌對20種藥物的敏感性。試驗(yàn)表明頭孢曲松、頭孢噻呋、痢菌凈高敏；對氟苯尼考、慶大霉素、安普霉素、恩諾沙星、新霉素、阿莫西林等產(chǎn)生了廣泛的耐藥。當(dāng)然藥物的治療效果還因不同鴨場而有所差異。如果長期使用同一種藥會產(chǎn)生耐藥性。建議各鴨場在防治傳染性漿膜炎時。注意交替使用藥物。

（3）該鴨場根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果選用了頭孢噻呋。10g/100kg水混飲。連用3天。病情基本治愈。直到現(xiàn)在未見復(fù)發(fā)。說明實(shí)際應(yīng)用和試驗(yàn)結(jié)果基本一致。

（4）鴨疫里氏桿菌極易產(chǎn)生耐藥性。由于抗菌藥物的長期濫用。有些常用抗菌藥物敏感性降低。甚至產(chǎn)生耐藥。因此最好結(jié)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果。選擇敏感的藥物治療。并注意輪換交替用藥。減少耐藥性的產(chǎn)生。提高臨床用藥的有效性。

（5）無論是采用藥物還是使用菌苗來預(yù)防鴨傳染性漿膜炎。都不是防治此病的根本方法。要想減少或杜絕鴨傳染性漿膜炎的發(fā)病率。必須采取加強(qiáng)飼養(yǎng)管理、搞好環(huán)境衛(wèi)生、嚴(yán)格消毒等綜合防治措施才行[6]。防治該病應(yīng)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理。搞好環(huán)境衛(wèi)生。對水域進(jìn)行經(jīng)常性消毒。本病受到應(yīng)激因子如寒冷刺激的影響很大。其他傳染病如大腸桿菌病等均可引起本病的暴發(fā)或加劇病鴨死亡。所以要加強(qiáng)鴨場的綜合防治和免疫預(yù)防工作。

（6）疫苗的預(yù)防接種是防治鴨傳染性漿膜炎較為有效的措施。近年來。國內(nèi)外學(xué)者致力于RA疫苗的研究。目前國內(nèi)常用的疫苗有油乳劑滅活苗、鋁膠滅活苗和弱毒活菌苗三種。此外。RA亞單位抗原疫苗正在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室攻毒保護(hù)試驗(yàn)、免疫期測定及田間試驗(yàn)。效果良好。高福等在研制RA福爾馬林滅活苗的基礎(chǔ)上。制得了礦物油佐劑滅活苗。最低保護(hù)率為75%[7]。

（7）鴨疫里氏桿菌感染后對免疫器官脾臟和法氏囊及對血液中免疫球蛋白的影響嚴(yán)重。尤其是降低其體液免疫應(yīng)答。因此要加認(rèn)識注意防治[8]。

綜上所述。實(shí)驗(yàn)室診斷、藥物防治和疫苗預(yù)防是有效地防治鴨傳染性漿膜炎三大環(huán)節(jié)。藥物防治是當(dāng)前切實(shí)有效的方法。在確定不同地區(qū)流行菌株的血清型及其分布基礎(chǔ)上的疫苗預(yù)防則是簡便、低廉和有效的措施。深入進(jìn)行RA表面抗原的研究。研制基因工程苗。是解決因RA血清型不同等原因造成疫苗效果不佳問題的必由之路。

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[2]趙坤,王三虎,劉詩柱,等.豫北地區(qū)豬源致病性大腸桿菌分離與鑒定[J].河南科技學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2007,35(3):25-27.

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[4]聞勇.副豬嗜血桿菌的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)[J].中國畜禽種業(yè),2013(7):15.

[5]孫申菊.雪山雞多殺性巴氏桿菌的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)[J].畜禽業(yè),2015(4):15.

[6]楊永剛,劉海霞,孫齊田,等.鴨傳染性漿膜炎蜂膠滅活苗的研制及免疫效果試驗(yàn)[J].中國家禽,2006,28(9)23-24.

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