張 俊， 潘 易， 林寶達， 周春何， 董海潔

(1.麗水市環(huán)境監(jiān)測中心站, 浙江麗水 323000;2.麗水市固體廢物管理中心，浙江麗水 323000)

?

多孔菌漆酶在AOT/異辛烷反膠團中的特性表征

張 俊1， 潘 易2， 林寶達1， 周春何1， 董海潔1

(1.麗水市環(huán)境監(jiān)測中心站, 浙江麗水 323000;2.麗水市固體廢物管理中心，浙江麗水 323000)

多孔菌漆酶對降解含氯有機物的作用是非常明顯的，但因其在水相中穩(wěn)定性不高，因而限制了它的廣泛使用。為了增強酶的穩(wěn)定性，克服在溶解狀態(tài)易受抑制的缺點，通常采用吸附法[1-3]、交聯(lián)法[4-6]、共價鍵結合法[7-9]和包埋法固定化酶[10-12]。與傳統(tǒng)固定化方法相比，反膠團包埋酶技術有其獨特的優(yōu)點。反膠團的結構特征使酶在有機溶劑中溶入很小的水環(huán)境中，由于表面活性劑的存在而使酶不與有機溶劑直接接觸，可更好地保護酶的催化活性部位，因而活性和穩(wěn)定性得到保留。筆者研究了多孔菌漆酶在二-(2-乙基己基)琥珀酸雙酯磺酸鈉(AOT)∕異辛烷反膠團中的穩(wěn)定性，并與相應的游離漆酶進行比較。

1材料與方法

1.1試驗材料多孔菌菌種，中科院化學研究所提供；鄰聯(lián)甲苯胺，分析純，上海化學試劑總廠；AOT氣溶膠，浙江嘉善巨楓化工廠；756 MC型紫外可見分光光度計，上海精密科學化器有限公司。

1.2試驗方法

1.2.1游離漆酶活性的測定。取0.1 mol/L 、pH 4.6的醋酸緩沖液3.4 ml，加入3.36 mmol/L鄰聯(lián)甲苯胺0.5 ml，再加入游離漆酶液0.1 ml，25 ℃保溫30 min。在756 MC型紫外可見分光光度計下測定600 nm處的光密度(OD值)，以空白不含酶溶液為對照。酶活力以酶與底物反應30 min后光密度的改變值表示。以每分鐘光密度增加0.01為1個酶活力單位。

1.2.2反膠團的制備。在含0.1 mol/L AOT的異辛烷溶液中加入一定量的0.02 mol/L、pH 4.6的漆酶醋酸鹽緩沖液(其中加入游離漆酶液)，立即振蕩溶液至澄清，使之形成均一、透明、穩(wěn)定的反膠團體系，即得所需含水值為R的含酶反膠團。欲改變R值，只需調(diào)節(jié)注入的緩沖液量即可。R值的定義為有機相中水的摩爾濃度與AOT摩爾濃度之比，即R=[H2O]/[AOT]。

1.2.3反膠團酶活力的測定。取5 ml漆酶反膠團(其中含游離漆酶0.1 ml)，加入0.1 mol/L、pH 4.6的醋酸鹽緩沖液3.4 ml，再加入3.36 mmol/L鄰聯(lián)甲苯胺0.5 ml，放入25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)25 min后，在25 ℃下4 000 r/min的離心機上離心5 min。取下清液，放在756 MC型紫外可見分光光度計測600 nm處的光密度(OD值)，以與空白不含酶的為對照。酶活力以漆酶反膠團與底物反應30 min后光密度的改變值表示。以每分鐘光密度增加0.01為1個酶活力單位。

1.3數(shù)據(jù)分析方法試驗數(shù)據(jù)用SAS 8.01版統(tǒng)計軟件進行處理和分析。采用DMRT法進行多重比較，P值均為0.05。

2結果與分析

2.1反膠團中不同含水值及Tween-80濃度對漆酶反膠團活力的影響反膠團的含水值是反膠團結構的重要參數(shù)之一。它會影響漆酶反膠團活力。Tween-80作為一種助表面活性劑，在反膠團中的濃度也會影響漆酶反膠團活力。表1表明，反膠團中不同含水值和Tween-80濃度對漆酶反膠團活力都有顯著影響。當反膠團中Tween-80濃度為0.012 5 mol/L時，漆酶反膠團活力提高最顯著，當含水值為30時漆酶反膠團活力達到51.97，是未加Tween-80時活力的1.43倍，是游離漆酶活力的1.40倍。這一結果與前人研究報道的關于漆酶在反膠團體系下體現(xiàn)出“超活力”的結論[13]一致。

表1　不同含水值和Tween-80濃度對漆酶反膠團活力的影響　U

注：采用DMRT法進行多重比較，同列數(shù)據(jù)中含有相同字母者表示差異不顯著；括號里的字母是同行多重比較結果，含有相同字母者表示差異不顯著。

2.2制備反膠團時加入不同pH緩沖液對漆酶反膠團活力的影響由圖1可知，加入的緩沖液pH在4.2～5.0之間對漆酶反膠團活力影響不顯著，且活力都維持在較高水平。加入緩沖液的最適pH為4.6，此時漆酶反膠團活力為51.97，加入緩沖液的最適pH與“1.2.2”漆酶反膠團的制備方法中加入的緩沖液pH相同。

2.3溫度對漆酶反膠團活力的影響由圖2可知，漆酶反膠團在22～38 ℃之間時活力受溫度影響不顯著，且活力都維持在較高水平。當漆酶反膠團最適作用溫度為30～36 ℃時，活力達到53.70 U。與游離漆酶相比，漆酶反膠團在20～40 ℃的活力變化更小，最適作用溫度有所提高。這反映漆酶反膠團的熱穩(wěn)定性較游離漆酶得到提高。郭從容等[14]對青霉素酰胺酶經(jīng)反膠團包埋后最適作用溫度提高5 ℃的報道與該試驗結果接近。

2.4pH對漆酶反膠團活力的影響由圖3可知，漆酶反膠團在pH 3.5～5.3之間時活力變化不顯著，且都維持在較高水平。在此pH范圍之外，活力都會有所下降，在漆酶反膠團最適作用pH 4.4～4.7時，活力達到51.97 U。

2.5漆酶反膠團的熱穩(wěn)定性由圖4可知，漆酶反膠團在30、40、50 ℃保存4 d后活力變化顯著；30、40、50 ℃保存30 d活力分別保留84.4%、81.3%、62.0%。而游離漆酶在30、40、50 ℃保存30 d活力，分別只保留69.4%、10.5%、6.2%。與游離漆酶液相比，漆酶反膠團熱穩(wěn)定性得到顯著提高。

2.6漆酶反膠團的酸堿穩(wěn)定性由圖5可知，漆酶反膠團在pH 4.0～5.0下保存較穩(wěn)定，pH 4.5時保存最穩(wěn)定，保存30 d活力僅損失10.4%；pH 5.0時保存30 d,活力保留66.3%；但，在pH小于3.0或大于5.5時保存不穩(wěn)定，在pH 3.0保存30 d，活力僅保留42.5%；pH 6.0時保存30 d，活力僅保留21.0%。與游離漆酶相比，pH 4.5時保存30 d，活力僅保留45.0%；pH 5.0時保存30 d，活力保留20.4%；pH 5.5時保存30 d，活力僅保留13.1%，漆酶反膠團的酸堿穩(wěn)定性也得到顯著提高。

3結論與討論

(1)經(jīng)反膠團包埋后，漆酶的穩(wěn)定性較游離漆酶有較大提高，熱失活和酸堿失活顯著減少。這可能是因為酶在反膠團內(nèi)的微環(huán)境比在水溶液中更接近其天然的胞內(nèi)環(huán)境，有利于維持具有催化功能的酶的空間構象，減少其他構象的存在[15]，從而保持較高的酶活性。另一方面，酶的穩(wěn)定性一般與水化程度有關，不完全水化的酶的穩(wěn)定性往往較高[16]，因此反膠團體系中有機溶劑的存在也有利于改善酶的穩(wěn)定性。

(2)反膠團體系中不同含水值、Tween-80濃度以及制備反膠團時加入不同pH的緩沖液對漆酶反膠團活力都有一定影響。當反膠團體系中含水值為30、Tween-80濃度為0.012 5 mol/L、制備反膠團的緩沖液pH為4.6時，制得的反膠團酶活力最高。該酶在AOT/異辛烷反膠團體系中的最適作用溫度為30～36 ℃，最適作用pH為4.4～4.7。該條件下反膠團體系較穩(wěn)定。

參考文獻

[1] 朱祥瑞，徐俊良．家蠶絲素固定化α-淀粉酶的制備及其理化特性[J]．浙江大學學報：農(nóng)業(yè)生命科學版，2002，28(1)：64-69.

[2] 楊昌英，潘家榮，鐘珩，等．醋酸纖維素固定化脂肪酶催化豬油合成單甘酯[J]．湖北化工，2002(6)：20-21.

[3] 高貴，韓四平，王智，等．硅藻土固定化脂肪酶[J]．吉林大學學報：理學版，2002，40(3)：324-326.

[4] 錢軍民，李旭祥，鎖愛莉．氨基化硅膠固定化葡萄糖氧化酶和研究[J]．生物化學與生物物理進展，2002，29(30)：394-397.

[5] 曾嘉，鄭連英，余世清．殼聚糖微球固定化葡萄糖氧化酶的研究[J]．食品工業(yè)科技，2002，23(1)：29-31.

[6] QUINN Z，ZHOU K，CHEN X D.Immobilization of β-galactosidase on graphite surface by glutaraldehyde[J]. J Food Eng,2001,48(1):69-74.

[7] 烏云高娃，盧冠忠，郭楊龍，等．聚甲基丙烯酸縮水甘油酯固定化青霉素?；感再|的研究[J]．華東理工大學學報，2002，28(6)：633-636.

[8] DESSOUKI A M，ISSA G I，ATIA K S.Pullulanase immobilization on natural and syntetic polymers[J].J Chem Technol Biotechnol,2001,76(7):700-706.

[9] WANG S L，CHIO S H.Reversible immobilization of chitinase via coupling to reversibly soluble polymer[J].Enzyme Microb Technol,1998,22(7):634-640.

[10] ARVIND M.A simple laboratory experiment for teaching enzyme immobilization with urease and its application in blood urea estimation[J].Biochemical Education,1999,27:114-117.

[11] 錢軍民，李旭祥．HES/SiO2凝膠復合物包埋固定化葡萄糖氧化酶的研究[J]．應用化學，2002，19(2)：153-157.

[12] 顏慧，馮炘，李軍紅．撲草凈降解酶的固定化及其對受污染土壤的生物強化研究[J]．南開大學學報：自然科學版，2003，36(2)：109-115.

[13] PSHEZHESKY A V，KLYACHKO N L，PEPANIYAN G S,et al.Modeling of membrane environment of enzymes:Superactivity of laccase entrapped into surfactant reversed micelles in organic solvents[J].Boikhimiya,1988,53(2):1013-1016.

[14] 郭從容，何志敏，鄒超．青霉素酰胺酶在AOT/異辛烷反膠團中的穩(wěn)定性研究[J]．中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，1999，30(12)：531-533.

[15] BROWN E D，YADA R Y，MARAGONIA A G.The dependence of the lipolytic activity of rhizopus arrhizus lipase on surfactant concentration in AOT/isooctane reverse micelles and its relationship to enzymes structure[J].Biochim Biophys Acta,1993,1161(1):66.

[16] YAMADA Y，KUBOI R，KOMASAWA I.Increased activity ofChromobacteriumviscosumlipase in aerosol OT reverse micelles in the presence of nonionic surfactants[J].Biotechnol Prog,1993,9：468-472.

摘要[目的]對多孔菌漆酶包埋于AOT/異辛烷反膠團中的特性進行研究。[方法]在漆酶反膠團中加入醋酸鹽緩沖液和鄰聯(lián)甲苯胺，放入25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)25 min后離心，取下清液，測光密度值。[結果]在漆酶反膠團體系中加入適量吐溫-80后，漆酶反膠團酶活力有所提高。經(jīng)反膠團包埋后，酶的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性較水相酶有較大提高，在40 ℃下保溫30 d酶活力保留81.3%，在pH 4.5下保存30 d酶活力保留89.6%。[結論]在該反膠團體系中, 酶的穩(wěn)定性有較大的提高。

關鍵詞多孔菌漆酶；AOT；異辛烷；反膠團；特性表征

Characterization of Polyporous Laccase in AOT/Isooctane Reversed Micelles

ZHANG Jun1，PAN Yi2，LIN Bao-da1et al(1.Lishui Environmental Monitoring Center, Lishui, Zhejiang 323000; 2. Lishui Solid Waste Management Center, Lishui, Zhejiang 323000)

Abstract[Objective] The characteristics of polyporous laccase entrapped in AOT/isooctane reversed micelles were studied. [Method] Acetate buffer and o-tolidine into AOT/isooctane reversed micelles was added, then was put in an incubator chamber at 25 degrees for 25 minutes. Bottom clear liquid was collected to measure optical density value after centrifugating. [Result] Its activity was enhanced after joining optimal quantity of Tween-80 and its stability to variation of temperature and pH was improved to a great extent. 81.3% of its activity still remained after storage at 40 ℃ for 30 days,and 89.6% of its activity remained after storage at pH 4.5 for 30 days. [Conclusion] The stability of polyporous laccase was enhanced greatly in the reversed micelles.

Key wordsPolyporous laccase; AOT; Isooctane; Reversed micelles; Characterization

收稿日期2015-04-30

作者簡介張俊(1980- )，男，浙江杭州人，工程師，碩士，從事環(huán)境樣品檢測方面的研究。

中圖分類號S -03

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2015)18-005-03