任強(qiáng)　楊曉紅　鄒義冬等

摘要：在光學(xué)顯微鏡下觀察桑屬（Morus.）8個(gè)種葉表皮形態(tài)特征。結(jié)果表明：桑屬植物上表皮細(xì)胞排列規(guī)則，形狀為多邊形，垂周壁平直；下表皮細(xì)胞較窄長，排列不規(guī)則，垂周壁微波狀起伏。桑葉上、下表皮有非腺毛、腺毛、鐘乳體等附屬物的分布。桑葉柵欄組織細(xì)胞的排列相對(duì)緊密且規(guī)則，而海綿組織細(xì)胞排列松散且不規(guī)則，葉肉細(xì)胞中還有大量晶體，鐘乳體形狀多樣，上下表皮中都有分布。氣孔器僅分布在葉下表皮，屬于無規(guī)則型，氣孔圓形或橢圓形。氣孔面積、氣孔形態(tài)及表皮毛等特征存在一定的種間差異，可以作為桑屬植物分類的重要依據(jù)。桑屬植物葉表皮特征作為該屬種間鑒定的指標(biāo)是可行的，但是依據(jù)某個(gè)單一的形態(tài)特征形狀，并不能將各個(gè)種之間完全區(qū)分開，應(yīng)該綜合多種形態(tài)性狀進(jìn)行分析。

關(guān)鍵詞：桑屬植物；葉表皮；形態(tài)特征；垂周壁；氣孔器；分類

中圖分類號(hào)： S888.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）11-0328-06

收稿日期：2014-11-19

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：21107014）；江西省自然科學(xué)基金（編號(hào)：2009GZH0008）。

作者簡介：任強(qiáng)（1982—），男，山東濟(jì)南人，碩士，講師，主要從事植物生物學(xué)和生物技術(shù)研究。E-mail：88545866@qq.com。近幾十年來，許多研究發(fā)現(xiàn)葉表皮細(xì)胞形狀和氣孔器特征在一定程度上能夠反映分類群間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，可以用于科以下屬間或?qū)僖韵路N間關(guān)系的探討[1-3]。葉表皮及葉結(jié)構(gòu)特征作為一個(gè)重要的分類和系統(tǒng)演化的性狀已用于多個(gè)類群的研究并取得良好的效果[4-10]，均說明葉表皮和氣孔器特征是植物系統(tǒng)分類和親緣關(guān)系鑒定的重要指標(biāo)。

關(guān)博夫曾觀察比較了桑葉氣孔的形態(tài)，發(fā)現(xiàn)氣孔的大小、多少與桑樹染色體的倍性密切相關(guān)[11]。余茂德等曾對(duì)桑葉氣孔的形態(tài)進(jìn)行觀察，結(jié)果表明，桑葉氣孔的大小、多少與染色體倍數(shù)呈規(guī)律性變化[12]。劉云等運(yùn)用光學(xué)顯微鏡和掃描鏡對(duì)11種蠶用桑品種的葉表皮形態(tài)和結(jié)構(gòu)進(jìn)行過觀察研究，認(rèn)為葉表皮細(xì)胞和氣孔器特征在該屬植物分類中具有一定的作用[13]。作為桑屬形態(tài)分類重要輔助手段的葉表皮的微形態(tài)特征，至今尚無人進(jìn)行過系統(tǒng)研究。本研究利用光學(xué)顯微鏡觀察桑屬8個(gè)種代表植物葉表皮形態(tài)特征，旨在為桑屬植物的系統(tǒng)研究提供微形態(tài)學(xué)資料，對(duì)該屬分類學(xué)上的部分問題作初步探討。

1材料和方法

1.1試驗(yàn)材料

取材時(shí)間為09：00—10：00，材料選取桑屬8個(gè)品種，分別標(biāo)記為1號(hào)白桑（Morus alba Linn.）、2號(hào)廣東桑（M.atropurpurea Roxb.）、3號(hào)雞桑（M.australis Poir.）、4號(hào)華桑（M.cathayana Hemsl.）、5號(hào)山桑（M.bombycis Koidz.）、6號(hào)蒙桑（M.mongolica Schneid.）、7號(hào)長穗桑（M.wittiorum Hand Mazz.）和8號(hào)川桑（M.notabillis Schneid.），果期的第3張至第5張成熟葉片作為研究對(duì)象。

1.2玻片標(biāo)本的制作

1.2.1桑葉表皮離析整體制片剪取若干葉片中部近主脈處0.5 cm×0.5 cm的小塊，用蒸餾水漂洗干凈，放入Jeffery 離析液（鉻酸 ∶硝酸=1 ∶1）中[14]于70 ℃溫箱離析1～1.5 h，直至材料周緣泛白，葉肉與葉表皮開始分離，蒸餾水漂洗后，用毛筆清除上下表皮間的葉肉，用1%番紅染色，經(jīng)乙醇系列脫水后，固綠對(duì)染，乙醇繼續(xù)脫水，二甲苯透明，整體封片，加拿大樹膠封片。

1.2.2桑葉石蠟切片法顯微制片取FAA固定好的材料，用蒸餾水漂洗3次，洗去固定液，1%番紅過夜整染，蒸餾水漂洗后。經(jīng)乙醇系列脫水，先從低濃度的乙醇開始，然后遞增濃度，直至無水乙醇，各級(jí)乙醇1～2 h。將脫水后的材料經(jīng)1/2二甲苯到二甲苯，各級(jí)時(shí)間為1～2 h。浸蠟2～4 h，石蠟包埋，旋轉(zhuǎn)式切片機(jī)切片，切片厚度8 μm。脫蠟后用固綠對(duì)染，乙醇系列脫水，二甲苯透明，加拿大樹膠封片。

1.3觀察、測量和統(tǒng)計(jì)

在數(shù)碼顯微影像系統(tǒng)（DMBA400，中國Motic公司生產(chǎn)）中觀察、照相、測量。對(duì)上下表皮細(xì)胞進(jìn)行觀察，對(duì)細(xì)胞的形狀、垂周壁特征、鐘乳體細(xì)胞、表皮毛等進(jìn)行觀察、統(tǒng)計(jì)和照相。在相同倍數(shù)下（目鏡10×，物鏡40×），對(duì)每個(gè)種隨機(jī)測量10個(gè)視野，每視野測20個(gè)氣孔器，觀察統(tǒng)計(jì)氣孔器及鐘乳體細(xì)胞數(shù)量，取得平均值。氣孔器面積=氣孔器長軸長×短軸長；氣孔密度=觀察面積內(nèi)氣孔器個(gè)數(shù)/觀察面積。本研究所用術(shù)語參考文獻(xiàn)[10，15-17]。利用SPSS 11.5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[19]。

2結(jié)果與分析

2.1桑屬葉表皮共有特征

在光學(xué)顯微鏡下，對(duì)桑葉表皮離析、桑葉橫切面進(jìn)行觀察，結(jié)果（圖1）顯示，桑葉上表皮細(xì)胞排列規(guī)則、形狀為多邊形（polygonal）、垂周壁平直（straight）、無細(xì)胞間隙（圖1-A）；下表皮細(xì)胞較窄長，排列不規(guī)則（圖1-B），垂周壁微波狀起伏；桑葉橫切面顯示，在細(xì)胞表面之間還沉積著1層厚的角質(zhì)層（圖1-C、圖1-D）。

葉離析材料觀察結(jié)果表明，在桑葉的表皮中還分布大量的表皮附屬物，下表皮有或無毛，毛分非腺毛（圖1-E、圖1-F）和腺毛（圖1-G）2種，非腺毛為單細(xì)胞，稀疏、長短、粗細(xì)不一，表皮毛的形態(tài)特征有一定的種間差異。腺毛頭狀，由多細(xì)胞組成，由窄柄頂端膨大的分泌細(xì)胞組成的囊狀毛，柄由1個(gè)（有時(shí)幾個(gè)）細(xì)胞和1個(gè)基細(xì)胞組成（圖1-G）。

表皮細(xì)胞中還存在一類特殊的細(xì)胞，有研究者稱之為巨大細(xì)胞[19]，細(xì)胞形狀似球形，胞內(nèi)可見1個(gè)清晰的晶狀體結(jié)構(gòu)，稱為鐘乳體（圖1-H至圖1-M），為碳酸鈣性質(zhì)的晶體[13]。鐘乳體形狀多樣，如圓柱形（圖1-I）、扇形（圖1-J）等。鐘乳體細(xì)胞在上下表皮中都有，但上表皮分布相對(duì)較多（圖1-I至圖1-K），表皮毛細(xì)胞中也有鐘乳體的存在（圖1-L，1-M）。

氣孔器主要是由2個(gè)保衛(wèi)細(xì)胞和它們之間的開口共同組成（圖1-N、圖1-O）。氣孔器形態(tài)特征在桑屬內(nèi)比較穩(wěn)定，只分布在下表皮，無規(guī)則型，氣孔的形狀多為橢圓形或圓形。但氣孔面積存在種間差異。

葉肉表皮細(xì)胞內(nèi)側(cè)為由薄壁細(xì)胞組成的葉肉。桑葉的葉肉由柵欄組織和海綿組織組成，柵欄組織細(xì)胞的排列相對(duì)緊密且規(guī)則，而海綿組織細(xì)胞排列松散且不規(guī)則（圖1-L、圖1-M、圖1-P、圖1-R），葉肉細(xì)胞中還分布大量的晶體（圖1-R）。

主脈的最外層表皮細(xì)胞排列非常緊密，表面覆蓋1層厚的角質(zhì)層，葉脈表皮細(xì)胞內(nèi)側(cè)為機(jī)械組織，具支持作用。機(jī)械組織以內(nèi)為薄壁細(xì)胞。其內(nèi)為維管束，由木質(zhì)部和韌皮部組成，木質(zhì)部較發(fā)達(dá)，在橫切面上呈近圓形，導(dǎo)管呈輻射環(huán)狀排列；韌皮部位于木質(zhì)部外側(cè)（圖1-Q），因此桑葉維管束的排列方式為外韌維管束。

2.2桑屬各個(gè)種葉表皮特征

從圖2可以看出，桑屬植物氣孔器形狀分為圓形（圖2-A、圖2-B、圖2-G）和橢圓形（圖2-C至圖2-F、圖2-H）2種類型，除白桑、廣東桑、長穗桑外，其余種都是橢圓形。如表1所示，氣孔面積在桑屬內(nèi)存在顯著差異，氣孔面積最大的種為華桑，達(dá)（143.82±8.85） μm2；氣孔面積最小的為山桑，達(dá) （76.22±4.42） μm2 。種間氣孔密度也有一定差異，氣孔密度最大種為長穗桑，達(dá)（1 614±21） 個(gè)/mm2；氣孔密度最小的種為蒙桑，達(dá) （1 098±12） 個(gè)/mm2 。

利用光學(xué)顯微鏡對(duì)葉片上表皮鐘乳體細(xì)胞頂面進(jìn)行觀察，統(tǒng)計(jì)其鐘乳體細(xì)胞數(shù)量。不同種的鐘乳體細(xì)胞形態(tài)各異，大多數(shù)鐘乳體細(xì)胞頂面為球形（圖2-I至圖2-L、圖2-N至圖2-P），如白桑、廣東桑、雞桑、華桑、蒙桑、長穗桑、川桑；少數(shù)呈梯形狀（圖2-M），如山桑。有些研究者曾根據(jù)鐘乳體細(xì)胞的形狀來對(duì)不同品種的桑樹進(jìn)行分類[13，19]。表1顯示，在上表皮細(xì)胞中鐘乳體細(xì)胞最多的是長穗桑，為 （10.50±0.79） 個(gè)/mm2 ；分布最少的是蒙桑，為 （7.50±009） 個(gè)/mm2。

采用光學(xué)顯微鏡對(duì)葉表皮上的表皮毛進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)表皮上的非腺毛形態(tài)各異（圖2-Q至圖2-X），在種間存在顯著性差異（表2）。長穗桑無表皮毛分布，在葉表皮上偶見有直或彎曲的瘤狀小突起（圖2-Q）。蒙桑無表皮毛分布（圖2-R）。川桑表皮毛疏生，基部顯著膨大，先端銳尖，整個(gè)毛形呈三角形（圖2-S），表皮毛長度為21.9～75.6 μm，基部寬度為19.6～33.9 μm。白桑表皮毛疏生，基部近扁圓球形顯著膨大，尾尖漸細(xì)，整個(gè)毛形呈長漏斗狀（圖2-T），表皮毛長度為23.6～49.2 μm，基部寬度為12.5～28.8 μm。山桑表皮毛與白桑相似，分布較少，基部突然顯著膨大，先端尾尖，毛呈短漏斗形或長圓錐狀（圖2-U），表皮毛長度為 16.2～32.5 μm ，基部寬度為12.7～23.8 μm。廣東桑表皮毛基部膨大，先端漸尖，有彎刀狀和漏斗狀2種類型（圖2-V），表皮毛長度為25.5～62.2 μm，基部寬度為 17.5～25.2 μm 。雞桑毛中下部橢圓形膨大近等粗，漸尖，先端漸尖，直或彎曲（圖2-W），表皮毛長度為 24.2～169.8 μm ，基部寬度為19.9～36.9 μm。華桑表皮毛密生，柔軟，基部不膨大、較長、有彎曲（圖2-X），表皮毛長度為207.5～352.1 μm，基部寬度為10.6～30.2 μm。

3討論

3.1桑屬植物葉表皮及葉肉性狀具有相似性

在光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，所研究的8個(gè)桑種上表皮細(xì)胞排列規(guī)則、形狀為多邊形、垂周壁平直；下表皮細(xì)胞較窄長，排列不規(guī)則，垂周壁微波狀起伏。桑葉上、下表皮都有表皮毛、腺毛等附屬物分布。在上下表皮中都有鐘乳體細(xì)胞，但上表皮分布相對(duì)較多，表皮毛細(xì)胞中也有鐘乳體的存在。氣孔器分布特征在桑屬內(nèi)比較穩(wěn)定，均為下表皮具有氣孔器，氣孔類型屬于無規(guī)則型。柵欄組織細(xì)胞的排列相對(duì)緊密且規(guī)則，而海綿組織細(xì)胞排列松散且不規(guī)則，葉肉細(xì)胞中還有大量的晶體分布。這些種間比較多的相似的特征說明桑屬植物是1個(gè)自然的分類群，把這些植物歸入到1個(gè)屬中有一定的科學(xué)性和合理性。

3.2 桑屬植物氣孔器特征的分類學(xué)意義

通過光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，桑屬植物葉表皮特征有很多相似性，但在氣孔器形態(tài)、氣孔面積、氣孔密度等特征上存在一定的差異。因此，依據(jù)不同特征可以獲得不同的分類群，根據(jù)氣孔面積可以把各桑種分為3類：華桑、廣東桑、長穗桑氣孔面積（均大于100 μm2）歸為一類；雞桑、白桑、蒙桑氣孔面積（介于80～100 μm2）歸為一類；川桑、山桑（均小于 80 μm2）為一類。根據(jù)氣孔器形態(tài)可以把各桑種分為圓形、橢圓形2類：白桑、廣東桑、長穗桑歸為一類；雞桑、華桑、蒙桑、川桑、山桑為一類。按照傳統(tǒng)的分類，白桑、廣東桑、長穗桑、華桑屬于無花柱類，應(yīng)歸為一類，這與傳統(tǒng)分類出現(xiàn)一定的差異。研究結(jié)果中氣孔面積最大的種為華桑，最小的為川桑，氣孔密度最大的種是長穗桑，最小的種是蒙桑，說明桑屬植物種間氣孔器的特征差異是明顯的，可以作為該屬植物種間鑒定的重要指標(biāo)。

3.3桑屬植物表皮毛特征的分類學(xué)意義

利用光學(xué)顯微鏡對(duì)表皮毛進(jìn)行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，表皮毛形態(tài)各異，種間差異明顯。根據(jù)表皮毛的形態(tài)特征規(guī)律，將桑種分為3類：（1）長穗桑、蒙桑相似，無表皮毛分布；（2）川桑、白桑、山桑、廣東桑表皮毛疏生、較短，基部膨大，先端尾尖，整個(gè)毛呈漏斗狀、彎刀狀或三角形等；（3）雞桑、華桑表皮毛密生、較長，柔軟，基部膨大不顯著，先端有彎曲。從葉表皮毛的顯微特征推測：桑屬植物演化水平由低到高依次為長穗桑、蒙桑→川桑、白桑、山桑、廣東?！u桑、華桑。

3.4桑屬植物葉表皮研究的爭論

迄今為止，關(guān)于葉表皮及氣孔器特征在其他屬植物分類中已廣泛應(yīng)用，但在桑屬植物內(nèi)研究較少。關(guān)博夫等曾對(duì)桑葉氣孔的形態(tài)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)氣孔大小、數(shù)量等特征在桑樹品種間有差異[11-12]，本研究與其結(jié)果基本相似。勝又藤夫曾把桑巨大細(xì)胞的形態(tài)及突起的長度作為分類的依據(jù)，將桑樹分為4個(gè)類型。由于本試驗(yàn)的取材有限，沒有發(fā)現(xiàn)桑屬植物鐘乳體細(xì)胞形態(tài)的顯著差異，還有待于進(jìn)一步的研究。劉云等運(yùn)用光學(xué)顯微鏡和掃描鏡對(duì)11種蠶用桑品種的葉表皮形態(tài)和結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)品種間在表皮、葉肉和葉脈上的構(gòu)造基本相似，主要的差別在于氣孔密度、上表皮細(xì)胞中的鐘乳體細(xì)胞數(shù)量[13]。

背密被白色柔毛；廣東桑葉背面無毛，葉脈疏生白色柔毛；雞桑葉面密生短刺毛，背面疏被粗毛；華桑葉面粗糙有毛，葉背密生柔毛。本研究觀察結(jié)果與傳統(tǒng)的形態(tài)描述基本一致。本研究結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了這些結(jié)論的正確性，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)表皮毛特征對(duì)于桑屬植物種間鑒定具有非常顯著的意義。

徐淑紅等認(rèn)為，毛狀體的種類具有一定的穩(wěn)定性，不會(huì)隨著植物分布區(qū)域的不同而發(fā)生變化，但可以隨生境的不同在其數(shù)目上有所改變，應(yīng)用毛狀體的類型和其他相關(guān)性狀可以對(duì)植物進(jìn)行鑒定[22]，本研究結(jié)果再次驗(yàn)證了毛狀體特征可以對(duì)植物進(jìn)行分類鑒定。

4結(jié)論

桑屬植物葉表皮及葉肉性狀具有一定相似性。氣孔器形狀、氣孔面積、氣孔密度、鐘乳體細(xì)胞形狀、鐘乳體細(xì)胞數(shù)量、表皮毛形態(tài)等特征存在種間差異，根據(jù)氣孔面積把桑屬分為3類，依據(jù)氣孔器形態(tài)可以把桑屬分為2類，依據(jù)表皮毛特征可以分為三大類，桑屬植物葉表皮特征作為該屬種間鑒定的指標(biāo)是可行的，但是依據(jù)某個(gè)單一的形態(tài)特征形狀，并不能將各個(gè)種之間完全區(qū)分開，因此應(yīng)該綜合多種形態(tài)性狀進(jìn)行分析。

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