管　峰，高　威，陳吉?jiǎng)?，毛芝娟，楊季?

(1. 浙江萬(wàn)里學(xué)院 生物與環(huán)境學(xué)院 浙江 寧波 315100；2. 寧波市微生物與環(huán)境工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 浙江 寧波 315100)

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寧波-舟山港口航道3種致病性細(xì)菌毒力特征與耐藥性

管峰1,2，高威1，陳吉?jiǎng)?,2，毛芝娟1,2，楊季芳*1,2

(1. 浙江萬(wàn)里學(xué)院 生物與環(huán)境學(xué)院 浙江 寧波 315100；2. 寧波市微生物與環(huán)境工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 浙江 寧波 315100)

摘要:本文調(diào)查分析了寧波-舟山港口航道副溶血弧菌 Vibrio parahemolyticus、溶藻弧菌Vibrio alginolyticus和嗜水氣單胞菌 Aeromonas hydrophila的毒力特征和耐藥性特點(diǎn)。用PCR方法檢測(cè)分離菌株的毒力基因分布模式發(fā)現(xiàn)，副溶血弧菌毒力基因型以gyrB+，toxR+，tlh+和tdh+為代表，溶藻弧菌毒力基因型以aspA+，tlh+，collagenase+和toxS+為代表，嗜水氣單胞菌毒力基因型以aerA+，alt+，aha1+和hlyA+為代表；副溶血弧菌、溶藻弧菌和嗜水氣單胞菌代表菌株相應(yīng)基因的檢出率分別為57.1%、40.0%和50.0%。用24種常見(jiàn)抗生素對(duì)3種細(xì)菌的分離代表菌株進(jìn)行藥敏調(diào)查，耐藥率分別為4.17%、8.33%和29.17%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明寧波-舟山港口航道3種致病性細(xì)菌具備較豐富的毒力基因種類(lèi)和耐藥性，需要有針對(duì)性地制定預(yù)防措施。此外，鑒于毒力基因型與致病性之間的相關(guān)性，毒力基因可作為標(biāo)記基因，用于致病性細(xì)菌的檢測(cè)。

關(guān)鍵詞:港口航道；致病菌；毒力基因；耐藥性

0引言

弧菌屬Vibrio和氣單胞菌屬Aeromonas細(xì)菌均屬于革蘭氏陰性菌，廣泛分布于海水中，尤其是近岸海域。這些細(xì)菌主要的感染對(duì)象有蝦、魚(yú)和貝等，不僅是海洋動(dòng)物的主要致病菌，而且被認(rèn)為是沿海地區(qū)細(xì)菌性食物中毒的重要病原菌。由于這類(lèi)細(xì)菌在沿海生態(tài)危害以及食源中毒方面的問(wèn)題日顯突出，加深對(duì)于它們的認(rèn)識(shí)，對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物細(xì)菌性疾病的防治，人類(lèi)細(xì)菌性食物中毒的診斷、治療以及微生態(tài)制劑研發(fā)等具有重要意義。

寧波-舟山港是世界上最大貨物吞吐港口之一，在我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)建設(shè)、物種多樣性保育和海岸帶開(kāi)發(fā)等方面具有舉足輕重的作用。受人類(lèi)活動(dòng)以及洋流影響，該海域海洋微生物種類(lèi)多，活性高，同時(shí)受偏高水溫、多樣漁業(yè)資源和頻繁氣候變化等影響，寧波-舟山港細(xì)菌數(shù)量和差異巨大。因此，研究寧波-舟山港口航道致病性細(xì)菌的毒力基因分布情況及耐藥規(guī)律，對(duì)深入探討致病菌的防控具有重要意義。

在國(guó)外，關(guān)于海洋細(xì)菌學(xué)的研究較早就已經(jīng)開(kāi)展[1-6]，我國(guó)微生物研究者對(duì)沿海港口航道海水細(xì)菌致病性的研究也有相關(guān)報(bào)道[7-16]。而對(duì)于寧波-舟山港口航道副溶血弧菌、溶藻弧菌和嗜水氣單胞菌毒力基因型與藥物敏感性的研究工作此前鮮見(jiàn)報(bào)道。這3種細(xì)菌是我國(guó)沿海常見(jiàn)的人-畜-魚(yú)共患病原菌，可引起魚(yú)類(lèi)出血性敗血癥、腸炎等，也會(huì)導(dǎo)致人急性疾病，但病原菌的流行規(guī)律及毒力特征至今仍不明確。本研究通過(guò)毒力基因和耐藥性檢測(cè)，分析了寧波-舟山港口3種致病菌的毒力特性和耐藥特征，以期為海洋細(xì)菌致病機(jī)理和耐藥性研究提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1采樣區(qū)信息

設(shè)置鎮(zhèn)海碼頭、橫山碼頭、白峰碼頭、沈家門(mén)碼頭和朱家尖大橋等5個(gè)樣品采集點(diǎn)。按春(4月)、夏(7月)、秋(10月)和冬(1月)四季采集海水表層下30 ~50 cm處水樣。每處采集500 mL水樣，采樣過(guò)程均按照無(wú)菌要求，樣品4 ℃保存，由滅菌管保存并帶回實(shí)驗(yàn)室，于16 h內(nèi)處理完畢。采集點(diǎn)信息見(jiàn)表1。

1.1.2主要試劑

所有培養(yǎng)基、生化鑒定試劑均購(gòu)自青島海博生物公司；2×Taq MasterMix(含染料)購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物公司；pMD18-T載體和DL 2000 marker購(gòu)自Takara公司；藥敏紙片購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司；無(wú)菌脫纖維綿羊全血(瓶裝)購(gòu)自杭州新銳生物工程有限公司。

1.1.3標(biāo)準(zhǔn)菌株

標(biāo)準(zhǔn)菌株副溶血弧菌ATCC 17802、溶藻弧菌ATCC 17749和嗜水氣單胞菌ATCC 7966等由寧波市微生物與環(huán)境工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

表1　采樣點(diǎn)位置

1.2方法

1.2.1菌株分離

樣品25 mL無(wú)菌接種225 mL堿性蛋白胨水28 ℃增菌培養(yǎng)6~8 h。取培養(yǎng)物接種TCBS瓊脂，置28 ℃培養(yǎng)18~24 h。從被檢材料分離目標(biāo)菌株，純培養(yǎng)后-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2常規(guī)生理生化鑒定

參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[17]和《伯杰氏細(xì)菌學(xué)鑒定手冊(cè)》[18]方法，以標(biāo)準(zhǔn)菌株作為參照對(duì)分離菌株進(jìn)行生理生化特征測(cè)定。

1.2.316S rDNA分子鑒定

將新鮮培養(yǎng)的菌液煮沸后離心取上清液作為基因組模板。用16S rDNA通用引物27 F和1492 R擴(kuò)增細(xì)菌基因組，將PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上進(jìn)行克隆測(cè)序。用Clustal X2軟件進(jìn)行序列比對(duì)，再用Mega 6.0軟件構(gòu)建N-J系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并進(jìn)行1 000次Bootstraps重復(fù)檢驗(yàn)。

1.2.4毒力基因檢測(cè)

將毒力基因引物擴(kuò)增PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，目的片段回收純化，T載體連接克隆轉(zhuǎn)化，鑒定無(wú)誤送上海生工測(cè)序。

1.2.5耐藥性檢測(cè)

根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLS)制定的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，耐藥性檢測(cè)采用Kirby-Bauer 紙片瓊脂擴(kuò)散法，選擇24 種常用的抗生素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。以標(biāo)準(zhǔn)菌株作為質(zhì)控菌株。結(jié)果判定按NCCL 2003 版執(zhí)行，耐藥性分為3個(gè)層次：敏感(S)、中度敏感(I)和耐受(R)。

1.2.6溶血性實(shí)驗(yàn)

將無(wú)菌的10%脫纖維綿羊全血平板或者哥倫比亞血平板(自制)復(fù)溫至25 ℃后，挑取分離菌株劃線(xiàn)接種于綿羊全血平板或者哥倫比亞血平板上，28 ℃培養(yǎng)，24~48 h后觀察溶血現(xiàn)象。若菌落周?chē)霈F(xiàn)溶血環(huán)，表明該細(xì)菌具溶血能力，是潛在的病原菌；溶血環(huán)越大，其致病力也可能越強(qiáng)。若菌落周?chē)闯霈F(xiàn)溶血環(huán)，表明該細(xì)菌無(wú)溶血能力。

2結(jié)果與分析

2.1菌株鑒定結(jié)果

本研究分離出致病性副溶血弧菌7株，致病性溶藻弧菌3株，致病性嗜水氣單胞菌4株，實(shí)驗(yàn)室分別編號(hào)為VP(1~7)、VA(1~3)和AH(1~4)。由表2可見(jiàn)VP(3、5、7)、VA(1、2、3)和AH-1分別是副溶血弧菌、溶藻弧菌和嗜水氣單胞菌中溶血性能最強(qiáng)的菌株，選擇VP-3(VP LWW01109)、VA-1(VA LWW01106)和AH-1(AH LWW17749)作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)菌株。由表3可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)菌株生理生化結(jié)果與陸源同種細(xì)菌結(jié)果基本一致[17-18]。

表2　3種細(xì)菌分離菌株的溶血特征

注：+++++：溶血能力最強(qiáng)；++++：溶血能力較強(qiáng)；+++：溶血能力中等；++：溶血能力較弱；+：溶血能力弱；-：無(wú)溶血能力。

表3　代表菌株的生理生化特性

注：“+”代表陽(yáng)性；“-”代表陰性

2.2序列分析

圖1　代表菌株16S rDNA基因核苷酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig.1　Phylogenetic trees of 16S rDNA ofrepresentative strains

分離菌株經(jīng)16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物純化，克隆并測(cè)定序列。細(xì)菌16S rDNA基因1 466個(gè)核苷酸序列比對(duì)表明，菌株VP LWW01109與副溶血弧菌核苷酸序列相似性超過(guò)98%，菌株VA LWW01106與溶藻弧菌核苷酸序列相似性最高，菌株AH LWW17749與嗜水氣單胞菌核苷酸序列相似性最為接近(圖1)。序列分析結(jié)合生理生化特性結(jié)果表明，菌株VP LWW01109為副溶血弧菌，菌株VA LWW01106為溶藻弧菌，菌株AH LWW17749為嗜水氣單胞菌。

2.3毒力基因分布模式

分離菌株基因組DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后，毒力基因擴(kuò)增片段與預(yù)期片段大小一致。將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆測(cè)序，經(jīng)Blast序列比對(duì)，擴(kuò)增片段均為目的基因。

對(duì)所有分離株細(xì)菌毒力基因進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，每株細(xì)菌的毒力基因型都不相同，副溶血弧菌均能檢出gyrB+和tlh+，最復(fù)雜的毒力基因型是gyrB+、tlh+、toxR+和tdh+；每株溶藻弧菌只含有1~2種毒力基因；每株嗜水氣單胞菌含有1~4種毒力基因不等，最復(fù)雜的是aerA+、hlyA+、aha1+和alt+，多樣性較為豐富。代表菌株的毒力基因種類(lèi)及檢出率如表4所示。

2.4耐藥性特征

對(duì)具有強(qiáng)溶血能力的VP LWW01109、VA LWW01106和AH LWW17749進(jìn)行抗生素耐藥性檢測(cè)，耐藥性特征見(jiàn)表5。為便于統(tǒng)計(jì)，耐藥性處于中度敏感(I)并入耐藥(R)分析代表菌株對(duì)抗生素的耐受性，計(jì)算耐藥性時(shí)僅統(tǒng)計(jì)耐藥(R)的數(shù)量。結(jié)果表明具有強(qiáng)溶血能力的細(xì)菌普遍存在耐藥性。VP LWW01109對(duì)氨基糖苷類(lèi)、大環(huán)內(nèi)脂類(lèi)、多肽類(lèi)、部分β-內(nèi)酰胺類(lèi)、利福霉素類(lèi)和香豆素類(lèi)抗生素具有耐受性，耐藥率為4.17%。VA LWW01106對(duì)氨基糖苷類(lèi)、多肽類(lèi)、大部分β-內(nèi)酰胺類(lèi)、香豆素類(lèi)抗生素以及克拉霉素、克林霉素和磷霉素等有一定耐受性，耐藥率為8.33%。AH LWW17749對(duì)大環(huán)內(nèi)脂類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)、多肽類(lèi)、部分β-內(nèi)酰胺類(lèi)、利福霉素類(lèi)和香豆素類(lèi)抗生素等有耐受性，耐藥率為29.17%。

表4　代表菌株的毒力基因種類(lèi)

表5　代表菌株對(duì)24種抗生素的耐藥性特征

注：R表示耐受，I表示中度敏感，S表示敏感

3討論

在我國(guó)大榭港[9]、秦皇島港[12, 14]、煙臺(tái)港[13]和鹽田港[15]等地分別發(fā)現(xiàn)致病性弧菌(如副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌)、致病性單胞菌(如嗜水氣單胞菌、銅綠假單胞菌)和致病性腸桿菌(如大腸埃希氏菌、陰溝腸桿菌)等。本研究中分離的副溶血弧菌和溶藻弧菌是寧波-舟山港口航道的優(yōu)勢(shì)弧菌種(數(shù)據(jù)另文發(fā)表)，這與我國(guó)沿海五省——山東、上海、浙江、廣東和海南發(fā)現(xiàn)的致病性弧菌構(gòu)成以溶藻弧菌和副溶血弧菌占多數(shù)[19]基本相符。鹽田港海水優(yōu)勢(shì)弧菌種為溶藻弧菌(39.13%)和創(chuàng)傷弧菌(17.39%)[15]，珠海港海區(qū)多達(dá)10種弧菌為主要分離菌[8]，與寧波-舟山港區(qū)檢出情況略有不同，表明不同的海域優(yōu)勢(shì)菌種也存在區(qū)域性差異。鹽田港壓艙水優(yōu)勢(shì)弧菌種為溶藻弧菌(34.69%)和副溶血性弧菌(28.57%)[15]；珠海港壓艙水中致病性弧菌比海水中種類(lèi)更多、污染更為嚴(yán)重[8]；山東日照港、煙臺(tái)港和青島港壓艙水中氣單胞菌和溶藻弧菌有較高檢出率，而副溶血弧菌檢出率較低[13, 16]，說(shuō)明港區(qū)中致病菌種類(lèi)和數(shù)量很可能受壓艙水排放影響，可通過(guò)病原菌溯源追查兩者之間的聯(lián)系。

我國(guó)沿海細(xì)菌耐藥性的研究較少，而寧波-舟山港口航道細(xì)菌的耐藥性更缺乏研究?；【鷮俸蜌鈫伟鷮偌?xì)菌分布于海洋，耐藥屬性普遍存在，尤其沿海生活、醫(yī)用廢水將大量抗生素帶入海中更是激發(fā)細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。本研究顯示在寧波-舟山港口航道具備強(qiáng)致病性的細(xì)菌也具有廣譜的耐藥性。ROQUE et al[20]的研究發(fā)現(xiàn)副溶血弧菌對(duì)氨芐西林耐藥率超過(guò)65%。胡瓏玉 等[21]發(fā)現(xiàn)溶藻弧菌具有嚴(yán)重的多種耐藥性，對(duì)四環(huán)素和青霉素類(lèi)抗生素耐藥率超過(guò)90%。本研究發(fā)現(xiàn)，分離菌株對(duì)紅霉素、青霉素等具有較強(qiáng)耐受性，說(shuō)明分離海水受到臨床抗生素以及水產(chǎn)抗生素的污染，并使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。例如新霉素、克拉霉素、萬(wàn)古霉素等一般僅用于臨床治療，而卡那霉素和新生霉素可用于水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病預(yù)防。本研究發(fā)現(xiàn)嗜水氣單胞菌分離株對(duì)新生霉素和四環(huán)素具有耐藥性，這與新生霉素和四環(huán)素作為預(yù)防性抗生素添加劑在飼料中投放入海水，導(dǎo)致海洋細(xì)菌對(duì)它們產(chǎn)生普遍抗藥性有關(guān)，特別是弧菌屬和氣單胞菌屬[22]。KABIR et al[23]研究表明霍亂弧菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素可形成具有抗性的L型形態(tài)，在一定程度上解釋了未接觸過(guò)抗生素的弧菌屬細(xì)菌對(duì)氨芐青霉素具有耐藥性的原因。喹諾酮類(lèi)抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用較為廣泛，已被證明具有高效治療效果，其耐藥性發(fā)生的頻率也較低，并且針對(duì)弧菌屬具有殺菌活性[24]，這也與本研究結(jié)果一致。值得注意的是，3株代表細(xì)菌都發(fā)現(xiàn)具備中等以上耐受萬(wàn)古霉素的能力，而這種抗生素通常被認(rèn)為與其他抗生素?zé)o交叉耐藥性，并且較難形成耐藥菌株，通常用于耐藥致病菌的治療。這可能與寧波-舟山沿海養(yǎng)殖防治弧菌病或者氣單胞菌引發(fā)的綜合征有關(guān)，建議交叉使用環(huán)丙沙星等既廉價(jià)又高效的抗生素，可減少海洋細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。

雖然普遍認(rèn)為致病菌的檢出與疾病發(fā)生之間并沒(méi)有必然的聯(lián)系，暴發(fā)細(xì)菌性疾病需要致病菌在一定的環(huán)境中達(dá)到最低致病量以上，但是致病菌的檢出提示了感染風(fēng)險(xiǎn)和危害，因此不宜在寧波-舟山港口航道附近進(jìn)行海產(chǎn)養(yǎng)殖，以防人-魚(yú)蝦貝的食源性細(xì)菌傳播。根據(jù)實(shí)地調(diào)查，由于可利用的海岸帶有限，客運(yùn)碼頭1 km外存在圍網(wǎng)養(yǎng)殖和魚(yú)排養(yǎng)殖現(xiàn)象，危害性風(fēng)險(xiǎn)較大，一方面養(yǎng)殖海洋生物會(huì)增加帶菌風(fēng)險(xiǎn)，另一方面養(yǎng)殖廢水中超標(biāo)的有機(jī)物也會(huì)造成水體的富營(yíng)養(yǎng)化，進(jìn)一步刺激細(xì)菌的增生。而且人類(lèi)的醫(yī)療、工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)以及飼用抗生素引起水體中的病原菌耐藥性的問(wèn)題也亟需關(guān)注，由此需要更多監(jiān)測(cè)近海微生物致病基因和耐藥性的變化，發(fā)展新型控制病原菌技術(shù)以及制劑，保證生產(chǎn)、生活安全。

4小結(jié)

本研究發(fā)現(xiàn)在寧波-舟山港口航道分離獲取的副溶血弧菌、溶藻弧菌和嗜水氣單胞菌菌株的毒力基因分布呈現(xiàn)多樣性，代表菌株的毒力基因檢出率分別達(dá)到57.1%、40.0%和50.0%。3種細(xì)菌對(duì)常見(jiàn)抗生素耐藥譜較廣，代表菌株的耐藥率分別為4.17%、8.33%和29.17%。耐受的藥物主要分布于常用的氨基糖苷類(lèi)、β-內(nèi)酰胺類(lèi)等抗生素。另外，3種細(xì)菌的代表菌株都對(duì)萬(wàn)古霉素產(chǎn)生或強(qiáng)或弱的耐藥性，說(shuō)明港口航道中致病菌危害較大，需要加強(qiáng)對(duì)此海域細(xì)菌的監(jiān)管。

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three pathogenic bacteria isolated from the channels and

ports in Ningbo and Zhoushan

GUAN Feng1, 2，GAO Wei1，CHEN Ji-gang1, 2，MAO Zhi-juan1, 2，YANG Ji-fang*1, 2

(1.FacultyofBiological&EnvironmentalScience,ZhejiangWanliUniversity,Ningbo315100,China;

2.MunicipalKeyLaboratoryofMicroorganismandEnvironmentalEngineering,Ningbo315100,China)

Abstract:Virulence characteristics and antimicrobial susceptibility of Vibrio parahaemolyticus(VP), Vibrio alginolyticus(VA) and Aeromonas hydrophila(AH) isolated from the channels and ports in Ningbo and Zhoushan were investigated. The distribution patterns of virulent genes in isolated pathogenic bacteria are found that VP is represented by tlh+, toxR+, gyrB+and tdh+; VA is represented by aspA+, tlh+, collagenase+and toxS+; AH is represented by aerA+, alt+, aha1+and hlyA+. The detection rates of relevant genes in representative strains for these three kinds of bacteria are 57.1%, 40.0%, 50.0%. 24 common kinds of drug resistance rates of representative strains are 4.17%, 8.33% and 29.17% respectively. The results show that harmful characteristics of the pathogenic bacteria are found in Ningbo-Zhoushan, and the right defense measures needed to make to prevent them. Moreover, the correlation of virulence genotypes and pathogenicity of the bacteria show that virulent genes can be chosen as gene-markers to detect pathogenic strains of bacteria.

Key words:channels and ports; pathogenic bacteria; virulent gene; antimicrobial susceptibility

通訊作者：*徐善良(1962-)，男，教授，主要從事海水魚(yú)類(lèi)苗種繁育研究。E-mail:xushanliang@nbu.edu.cn

作者簡(jiǎn)介:王騰飛(1989-)，男，安徽阜陽(yáng)市人，主要從事海水魚(yú)類(lèi)健康養(yǎng)殖研究。E-mail:15267850309@163.com

基金項(xiàng)目:寧波市科技重大專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目資助(2015C110003)

收稿日期:2015-01-23修回日期:2015-07-30

Doi:10.3969/j.issn.1001-909X.2015.04.009

中圖分類(lèi)號(hào):Q938.8

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1001-909X(2015)04-0077-06