黃世玉，張麗莉

(1.集美大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院, 福建 廈門361021；2.農(nóng)業(yè)部東海海水健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門361021)

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鮑及牡蠣內(nèi)臟可溶物培養(yǎng)球等鞭金藻的效果

黃世玉1,2，張麗莉1,2

(1.集美大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院, 福建 廈門361021；2.農(nóng)業(yè)部東海海水健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門361021)

摘要:在培養(yǎng)基中添加鮑及牡蠣內(nèi)臟團(tuán)可溶物來培養(yǎng)球等鞭金藻Isochrysis galbana，測定了藻細(xì)胞密度、藻細(xì)胞葉綠素a和類胡蘿卜素含量。結(jié)果表明，適宜添加量的鮑及牡蠣內(nèi)臟可溶物對金藻生長具有促進(jìn)作用，發(fā)酵過的內(nèi)臟團(tuán)比不發(fā)酵的促進(jìn)效果更好。1∶1 000比例添加的發(fā)酵牡蠣內(nèi)臟可溶物促進(jìn)金藻生長的效果最好，其次是1∶100比例的發(fā)酵鮑魚內(nèi)臟可溶物；這2組的藻細(xì)胞葉綠素a和類胡蘿卜素含量顯著低于其它組。按1∶100比例添加的牡蠣內(nèi)臟可溶物對金藻生長有抑制作用。

關(guān)鍵詞:金藻； 生長； 鮑魚內(nèi)臟； 牡蠣內(nèi)臟

0引言

球等鞭金藻Isochrysisgalbana屬于金藻門、普林藻綱、等鞭藻目、等鞭藻科。其藻體細(xì)胞小，生長繁殖快，富含水產(chǎn)動物生長發(fā)育所需的不飽和脂肪酸,由于其細(xì)胞壁不含纖維素，易于消化，因此成為水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動物苗種生產(chǎn)中重要的餌料藻類。此外，球等鞭金藻總油脂含量高，富含多糖、類胡蘿卜素、抗氧化劑等生物活性物質(zhì),在生物能源和醫(yī)療保健方面具有較高的利用價(jià)值。但球等鞭金藻對營養(yǎng)需求嚴(yán)格，其培養(yǎng)液配方復(fù)雜，培養(yǎng)過程中容易被其它微藻和原生動物等污染，較難實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的高密度培養(yǎng)，成為限制球等鞭金藻開發(fā)利用的瓶頸[1-2]。

鮑和牡蠣是我國主要的貝類養(yǎng)殖種類。鮑內(nèi)臟在鮑深加工過程中一般作為下腳料拋棄。牡蠣主要以鮮食為主，食品加工尚處于初級階段，產(chǎn)品以蠔干、罐頭和耗油為主。目前我國對牡蠣的加工和綜合利用還不充分。而且由于鮑和牡蠣內(nèi)臟容易滋生微生物，腐敗變質(zhì)速度快，致使大量貝類內(nèi)臟被直接拋棄，浪費(fèi)資源、污染環(huán)境。鮑和牡蠣內(nèi)臟是沿海地區(qū)容易獲得的材料，本文利用鮑和牡蠣內(nèi)臟可溶物來培養(yǎng)金藻，探討其培養(yǎng)效果，該研究不僅為利用鮑和牡蠣內(nèi)臟提供一個(gè)新途徑，而且為優(yōu)化金藻培養(yǎng)條件提供一個(gè)新方法。

1材料與方法

1.1藻種及培養(yǎng)條件

球等鞭金藻購自廈門大學(xué)近海海洋環(huán)境科學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室海洋藻類保種中心。培養(yǎng)用海水為砂濾海水，經(jīng)脫脂棉過濾后，120 ℃ 30 min滅菌處理。藻種接種于500 mL三角燒瓶中于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為25 ℃，光周期為L∶D=14 h∶10 h,光強(qiáng)4 000 Lx,每天早、中、晚分別搖動1次。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)平行樣，藻種接種密度約100萬個(gè)/mL。

基礎(chǔ)培養(yǎng)液為f/2培養(yǎng)液[3]，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相應(yīng)添加不同比例的鮑或牡蠣內(nèi)臟可溶物提取液。

1.2鮑和牡蠣內(nèi)臟可溶物制備

取新鮮的6只鮑內(nèi)臟團(tuán)，經(jīng)65 ℃烘干48 h，用玻璃勻漿器充分碾磨，準(zhǔn)確稱取2 g，轉(zhuǎn)移至20 mL雙蒸水中充分?jǐn)嚢? h，以促進(jìn)可溶物提取。將該懸濁液均分為2份。其中1份離心(2 000 r/min，5 min)后取上清液于-20 ℃保存?zhèn)溆?。?份于室溫存放48 h自然發(fā)酵后，同樣離心后取上清液于-20 ℃保存?zhèn)溆?。培養(yǎng)金藻時(shí)，按內(nèi)臟可溶物上清液∶f/2培養(yǎng)液為1∶100、1∶1 000和1∶10 000的體積比添加，并設(shè)置1組f/2基礎(chǔ)培養(yǎng)液的作為對照組。

牡蠣內(nèi)臟可溶物的制備及添加同鮑內(nèi)臟處理過程。

1.3金藻樣品收集及指標(biāo)測定

1.3.1金藻生長測定

每天用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)金藻細(xì)胞密度，同時(shí)按照下列公式計(jì)算金藻日生長速率(μn)：

μn=(lnXtn-lnXtn-1)

(1)

式中：Xtn和Xtn-1為第n天和第n-1天的細(xì)胞密度，單位：×104/ mL；本實(shí)驗(yàn)中n的取值范圍為2~7。

1.3.2金藻樣品收集

培養(yǎng)至第7天時(shí)，將藻液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管，3 000 r/min，離心15 min，棄上清液，將藻膏用雙蒸水沖洗離心3次，將藻膏定容至2 mL無菌海水中，置于4 ℃冰箱中備用。

1.3.3葉綠素a及類胡蘿卜素的測定

取上述藻膏400 μL至5 mL樣品管，4 000 r/min，離心10 min。倒去上清液，加4 mL丙酮，避光在4 ℃下萃取24 h后，再4 000 r/min,離心10 min，取上清液分別在特定波長470、662和645 nm讀取吸光度值。根據(jù)以下公式計(jì)算葉綠素a(Chla)和類胡蘿卜素(Car)的含量[4]：

Chla=(11.75A662-2.350A645)×V/金藻個(gè)數(shù)

(2)

Chlb=(18.61A645-3.960A662)×V/金藻個(gè)數(shù)

(3)

Car=(1 000A470-2.270Chla-81.4Chlb)/

(227×V/金藻個(gè)數(shù))

(4)

式中：A為相應(yīng)波長下的吸光度，V為丙酮提取液體積(4 mL)，金藻個(gè)數(shù)為400 μL中所有藻細(xì)胞數(shù)量。公式計(jì)算后得到單位為pg/個(gè)。

藻細(xì)胞密度、日生長率、葉綠素a含量及類胡蘿卜素含量用單因素方差分析進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，Ducan進(jìn)行多重比較分析。

2結(jié)果

2.1鮑內(nèi)臟發(fā)酵可溶物不同添加比例對金藻生長的影響

鮑內(nèi)臟發(fā)酵可溶物對金藻生長的影響如圖1所示。方差分析表明不同添加比例可溶物在培養(yǎng)第3天時(shí)，1∶100添加組的日生長率最高，為225%，顯著高于其它組(p<0.05)；另外，1∶10 000添加組和1∶1 000添加組的日生長率也都顯著高于對照組(p<0.05)。

圖1　鮑內(nèi)臟發(fā)酵可溶物不同添加比例對金藻生長的影響Fig.1　The effect of solvend from fermented abalone visceral mass with different dilution on the growth of I. galbana

在培養(yǎng)至第5天時(shí)，1∶100添加組的藻細(xì)胞密度最高達(dá)到810萬個(gè)/mL，顯著高于其它組(p<0.05)；對照組的藻細(xì)胞密度最低，為215萬個(gè)/mL，顯著低于其它組(p<0.05)。培養(yǎng)至第6天時(shí)，1∶100添加組的藻細(xì)胞密度繼續(xù)增加至最高點(diǎn)，為992萬個(gè)/mL，顯著高于其它3組(p<0.05)，而其它3組之間沒有顯著性差異。培養(yǎng)至第7天時(shí)，1∶100添加組的藻細(xì)胞密度開始下降，但是仍高于其它3組;對照組的藻細(xì)胞密度增加迅速，僅次于1∶100添加組，顯著高于其它2個(gè)添加組(p<0.05)。

2.2鮑內(nèi)臟未發(fā)酵可溶物不同添加比例對金藻生長的影響

鮑內(nèi)臟未發(fā)酵可溶物對金藻生長的影響如圖2所示。除第1天外，金藻日生長率都存在顯著性差異(p<0.05)。對照組的日生長率波動非常大，第2天時(shí)為164%，但第3天到第5天都是負(fù)增長。未發(fā)酵可溶物添加組在培養(yǎng)至第4天時(shí)，日生長率約為100%。其中1∶100添加組在第5天時(shí)，日生長率還是維持在較高的水平。而對照組在第6天和第7天時(shí)，日生長率才開始恢復(fù)，超過了添加組(p<0.05)。

圖2　鮑內(nèi)臟未發(fā)酵可溶物不同添加比例對金藻生長的影響Fig.2　The effect of solvend from unfermented abalone visceral mass with different dilution on the growth of I. galbana

培養(yǎng)至第4天時(shí)，添加組的藻細(xì)胞密度顯著高于對照組(p<0.05)。第5天時(shí)，1∶100添加組的藻細(xì)胞密度為873萬個(gè)/mL，達(dá)到最高點(diǎn)，顯著高于其它3組(p<0.05)。

2.3牡蠣內(nèi)臟發(fā)酵可溶物不同添加比例對金藻生長的影響

牡蠣內(nèi)臟發(fā)酵可溶物對金藻生長的影響如圖3所示。在第2天到第5天中，1∶1 000添加組的藻細(xì)胞在各組中一直保持最高的日生長率。其中在第2天和第5天顯著性高于其它3組(p<0.05)。1∶100添加組的日生長率一直維持在比較低的水平；從第3天到第7天中，只有第6天的日生長率是正增長，其它均為負(fù)增長。1∶10 000添加組的日生長率幾乎與對照組相同。

圖3　牡蠣內(nèi)臟發(fā)酵可溶物不同添加比例對金藻生長的影響Fig.3　The effect of solvend from fermented oyster visceral mass with different dilution on the growth of I. galbana

在培養(yǎng)到第5天時(shí)，1∶1 000添加組的藻細(xì)胞密度最高，為1 300萬個(gè)/mL，是試驗(yàn)過程中獲得的最高值。不僅顯著性高于其它牡蠣內(nèi)臟發(fā)酵可溶物添加組，也顯著性高于所有其它試驗(yàn)組(p<0.05)。

2.4牡蠣內(nèi)臟未發(fā)酵物不同添加比例對金藻生長的影響

牡蠣內(nèi)臟未發(fā)酵可溶物對金藻生長的影響如圖4所示。金藻的日生長率在第2天存在顯著性差異，1∶1 000添加組顯著性高于其它3組(p<0.05)。但是對照組也顯著性高于其它2個(gè)添加組。第4天和第5天時(shí)，1∶1 000添加組維持了較高的日生長率。第6天時(shí)，對照組的日生長率顯著性高于其它3個(gè)添加組。

1∶1 000添加組的藻細(xì)胞密度在第6天達(dá)到最高點(diǎn)。并且在第4天到第7天中，一直是各組中藻細(xì)胞密度最高的。但在第7天時(shí)，與1∶10 000添加組和對照組沒有顯著性差異(p>0.05)。

圖4　牡蠣內(nèi)臟未發(fā)酵可溶物不同添加比例對金藻生長的影響Fig.4　The effect of solvend from unfermented oyster visceral mass with different dilution on the growth of I. galbana

2.5添加內(nèi)臟可溶物對金藻葉綠素a含量的影響

培養(yǎng)至第7天后，離心收集各組金藻，測定葉綠素a的含量，結(jié)果如圖5所示。鮑和牡蠣內(nèi)臟可溶物不管是否經(jīng)過發(fā)酵都對培養(yǎng)金藻的葉綠素a含量有顯著性影響(p<0.05)。在鮑內(nèi)臟發(fā)酵可溶物和未發(fā)酵可溶物處理中，1∶100添加組葉綠素a含量最少，顯著低于其它3組(p<0.05)。而1∶1 000添加組葉綠素a含量最高，高于其它3組(p<0.05)。牡蠣內(nèi)臟發(fā)酵可溶物和未發(fā)酵可溶物處理中，1∶100添加組的葉綠素a含量顯著高于其它3組，而另外3組葉綠素a的含量沒有顯著性差異。

圖5　鮑和牡蠣內(nèi)臟可溶物對金藻葉綠素a含量的影響Fig.5　The effect of solvend from abalone or oyster visceral mass on the chlorophyll a contents of I. galbana

2.6添加內(nèi)臟可溶物對金藻類胡蘿卜素含量的影響

各實(shí)驗(yàn)組收集的金藻中類胡蘿卜素含量如圖6所示。鮑內(nèi)臟發(fā)酵和未發(fā)酵可溶物兩種處理中，都是1∶100添加組的類胡蘿卜素含量最低，顯著低于其它3組(p<0.05)，但是其它3組之間沒有顯著性差異(p>0.05)。牡蠣內(nèi)臟發(fā)酵可溶物和未發(fā)酵可溶物兩種處理中，1∶100添加組的類胡蘿卜素含量最高，顯著高于其它3組(p<0.05)。

圖6　鮑和牡蠣內(nèi)臟可溶物對金藻類胡蘿卜素含量的影響Fig.6　The effect of solvend from abalone or oyster visceral mass on the carotenoid contents of I. galbana

3討論

微藻的大規(guī)模高效培養(yǎng)是微藻利用的基礎(chǔ)和關(guān)鍵技術(shù)之一[5]。作為重要水產(chǎn)餌料和富含生物活性物質(zhì)的球等鞭金藻，其大規(guī)模高效培養(yǎng)一直受到科技工作人員的高度重視[5]。而培養(yǎng)基營養(yǎng)成分是影響金藻生物量最重要的因素。目前對球等鞭金藻營養(yǎng)成分的需求主要集中在氮源、磷源、碳源、鐵源和硅源等無機(jī)營養(yǎng)鹽的研究[2,5-8]。但是對于有機(jī)物對球等鞭金藻生長影響的研究相對較少。一般認(rèn)為異養(yǎng)培養(yǎng)會抑制球等鞭金藻的生長[9-10]，相對于其它常用餌料微藻，球等鞭金藻對培養(yǎng)基營養(yǎng)要求更苛刻[7]。快速方便的高密度培養(yǎng)球等鞭金藻一直是水產(chǎn)科技人員需要解決的問題。

在起始密度約100萬個(gè)/mL的情況下，采用無機(jī)營養(yǎng)鹽培養(yǎng)球等鞭金藻在第7天以后，可以獲得300~500 萬個(gè)/mL 的生物量[6,8,10-11]。本文采用適當(dāng)配比的鮑或牡蠣內(nèi)臟可溶物培養(yǎng)到第5天時(shí)就能夠達(dá)到600萬個(gè)/mL以上的生物量，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對照組。這表明添加鮑或牡蠣內(nèi)臟可溶物能夠獲得較高密度的球等鞭金藻。

添加鮑或牡蠣內(nèi)臟可溶物后，球等鞭金藻一般在第2天就能獲得較大的日增長率。這尚處于培養(yǎng)的起始階段，球等鞭金藻所需的營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)充足，不存在短缺的問題。因此，內(nèi)臟可溶物中含有促進(jìn)球等鞭金藻生長的物質(zhì)，能夠使球等鞭金藻高于正常的速率生長。值得注意的是，添加發(fā)酵過的內(nèi)臟可溶物相對于添加未發(fā)酵的內(nèi)臟可溶物，能夠獲得更多的生物量。這表明對金藻生長的促進(jìn)作用是經(jīng)過微生物分解的物質(zhì)，或者是微生物的代謝產(chǎn)物。趙培 等[12]發(fā)現(xiàn)赤霉素可以影響球等鞭金藻的細(xì)胞形態(tài)，使之長時(shí)間保持在指數(shù)增長期。經(jīng)發(fā)酵后的鮑和牡蠣內(nèi)臟可溶物中的某些物質(zhì)可能發(fā)揮了類似植物激素的作用，全方位提高了藻細(xì)胞光合作用的強(qiáng)度和合成物質(zhì)的能力，并且促進(jìn)了藻細(xì)胞的分裂增殖。

微藻快速生長的生理基礎(chǔ)是其藻細(xì)胞具有較高的活性，能夠保持快速的分裂增殖。微藻在指數(shù)增長期光合色素的含量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于平臺期[13]。在營養(yǎng)限制的條件下光合色素會降低,同時(shí)生物量也會顯著降低[14]。脂肪酸等營養(yǎng)物質(zhì)的積累一般與生長負(fù)相關(guān)[8]。而本試驗(yàn)的結(jié)果表明，1∶1 000比例添加的發(fā)酵牡蠣內(nèi)臟可溶物等高生物量組別的葉綠素a含量要低于其它組別。本試驗(yàn)中藻細(xì)胞不可能受到營養(yǎng)限制，因此高生物量組的光合色素應(yīng)當(dāng)能夠滿足藻細(xì)胞的正常需要。其葉綠素a含量較低表明其藻細(xì)胞將主要物質(zhì)和能量主要用來合成細(xì)胞必需組成成分，進(jìn)行細(xì)胞分裂增殖，而不是進(jìn)行某種營養(yǎng)物質(zhì)的積累。在光合色素能夠滿足基本需求的情況下，沒有必要進(jìn)行大量的色素積累。

已有報(bào)道多采用葡萄糖、甘油、乙酸鹽等單一碳源對球等鞭金藻進(jìn)行異養(yǎng)培養(yǎng)，但效果較差[10]，尚未有利用多肽、氨基酸等物質(zhì)異養(yǎng)培養(yǎng)球等鞭金藻的報(bào)道。在添加甘油作為碳源進(jìn)行兼養(yǎng)培養(yǎng)時(shí)，能有效提高球等鞭金藻生物量[10,15]。這表明球等鞭金藻具有直接利用外界有機(jī)物質(zhì)的能力，但是對有機(jī)物的種類有選擇。貝類內(nèi)臟含有豐富的多肽和氨基酸[16-17],添加內(nèi)臟可溶物能夠比較全面地補(bǔ)充球等鞭金藻各種的營養(yǎng)需要，因此能夠獲得較高的生物量。

牡蠣內(nèi)臟含有豐富的Na、Cu、Zn、Fe、Sr、Mn和Ca[16]，鮑內(nèi)臟含有Ca、Mg和K[17]等礦物質(zhì)，而適宜濃度的 Cu、Zn、Mu、Co和Mn對金藻生長有很好的促進(jìn)作用[18]，因而發(fā)酵牡蠣內(nèi)臟對金藻生長的影響優(yōu)于發(fā)酵鮑內(nèi)臟。但是過高濃度的Cu和Zn含量對金藻生長有毒害作用[18]，會抑制金藻的生長。這可能是牡蠣內(nèi)臟可溶物1∶100添加組球等鞭金藻生長受抑制的原因。

4小結(jié)

本文采用鮑及牡蠣內(nèi)臟可溶物進(jìn)行球等鞭金藻的培養(yǎng)，1∶1 000添加組的發(fā)酵牡蠣內(nèi)臟可溶物和1∶100添加組的發(fā)酵鮑魚內(nèi)臟可溶物能夠顯著提高金藻的生長速度，在培養(yǎng)至第5天藻細(xì)胞密度可超過800萬個(gè)/mL。內(nèi)臟可溶物中可能存在促進(jìn)微藻分裂生長的物質(zhì)，并且能夠全面滿足金藻的營養(yǎng)需求，因此能夠?qū)崿F(xiàn)金藻的快速高密度培養(yǎng)。

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The effects of solvend from abalone or oyster visceral

mass onIsochrysisgalbanaincubation

HUANG Shi-yu1,2, ZHANG Li-li1,2

(1.CollegeofAuaculture,JimeiUniversity,Xiamen361021,China; 2.KeyLaboratoryof

HealthyMariculturefortheEastChinaSea,MinistryofAgriculture,Xiamen361021,China)

Abstract:The solvend of abalone or oyster visceral mass was added in the culture media of Isochrysis galbana. The algal cell density, chlorophyll a and carotenoid were measured. The results show that the suitable dilution of visceral mass solvend can accelerate the growth of I. galbana. The solvend of fermented visceral mass has better effect on growth of I. galbana than the solvend of unfermented visceral mass. The 1∶1 000 dilution of fermented oyster visceral mass is the best for the growth of I. galbana, while the 1∶100 dilution of fermented abalone visceral mass is next. Contents of chlorophyll a and carotenoid in the two test groups are lower than those of other groups. The 1∶100 dilution of fermented oyster visceral mass can inhibit the growth of I. galbana.

Key words:Isochrysis galbana; growth; abalone visceral mass; oyster visceral mass

通訊作者：*楊季芳(1963—)，男，研究員，主要從事海洋微生物(病毒)生態(tài)過程、病原微生物病原病理學(xué)研究。E-mail:jfkwlq@163.com

作者簡介:管峰(1985—)，男，江蘇淮安市人，實(shí)驗(yàn)師，主要從事環(huán)境病原微生物研究。E-mail:guanfengxy@163.com

基金項(xiàng)目:國家海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)項(xiàng)目資助(201105007-7-Ⅱ)

收稿日期:2015-05-08修回日期:2015-05-28

Doi:10.3969/j.issn.1001-909X.2015.04.008

中圖分類號:Q943.1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

文章編號:1001-909X(2015)04-0070-07