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(1徐州醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，江蘇徐州221000；2 徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

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BMSCs對(duì)糖尿病腎病大鼠的治療作用及機(jī)制探討

張?jiān)?，高克瑜1，戴春2

(1徐州醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，江蘇徐州221000；2 徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

摘要：目的觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)對(duì)糖尿病腎病(DN)大鼠的治療作用，并探討其作用機(jī)制。 方法將20只DN造模型成功大鼠隨機(jī)分為觀察組和對(duì)照組各10只，分別于造模4周尾靜脈輸注BMSCs、生理鹽水；另選10只正常大鼠作為空白組，不做任何處理。造模12周，檢測(cè)各組24 h尿蛋白定量、血肌酐(Scr)、血糖、裂孔隔膜蛋白(nephrin)和肌間線蛋白(desmin)水平。結(jié)果與空白組比較，對(duì)照組及觀察組血糖、24 h尿蛋白量、 Scr和desmin表達(dá)升高，nephrin表達(dá)減少(P均<0.05)；與對(duì)照組比較，觀察組24 h尿蛋白量、 Scr和desmin表達(dá)降低，nephrin表達(dá)增加(P均<0.05)。結(jié)論BMSCs對(duì)DN大鼠腎臟具有治療作用，可能與其改善足細(xì)胞EMT有關(guān)。

關(guān)鍵詞：糖尿病腎??； 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞； 上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化;足細(xì)胞；裂孔隔膜蛋白；肌間線蛋白

糖尿病腎病(DN)是糖尿病患者的常見(jiàn)并發(fā)癥，是導(dǎo)致終末期腎病(ESRD)的最主要病因。研究發(fā)現(xiàn)，足細(xì)胞損傷在DN的發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用[1]。上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(EMT)是DN足細(xì)胞損傷的早期事件，表現(xiàn)為上皮細(xì)胞標(biāo)志物如裂孔隔膜蛋白(nephrin)水平降低，間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物如肌間線蛋白(desmin)水平升高，導(dǎo)致細(xì)胞足突融合，腎小球?yàn)V過(guò)屏障受損，最終導(dǎo)致尿蛋白水平增高[2]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是一種具有多項(xiàng)分化潛能的干細(xì)胞，在體內(nèi)能趨化、歸巢至受損組織中，分化或修復(fù)組織[3]。研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs可延緩DN病情進(jìn)展、降低蛋白尿，但具體機(jī)制尚不清楚[4]。2014年6～12月，我們觀察了BMSCs對(duì)DN大鼠的治療作用，并探討其作用機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1材料大鼠BMSCs由本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)。8周齡健康SPF級(jí)雄性SD大鼠38只，體質(zhì)量200～250 g，購(gòu)自徐州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。鏈脲佐霉素(STZ，Sigma)；胎牛血清(杭州四季青)；改良Eagle培養(yǎng)基(北京賽默)；CD90-FITC(Biolegend)、CD29-FITC、CD45-PE (Ebioscience)；兔抗大鼠nephrin多克隆抗體(武漢博士德)；兔抗大鼠desmin多克隆抗體(無(wú)錫藥科美生物科技有限公司)；羊抗兔二步法免疫組化試劑盒(二抗)；IRDyeTM800 標(biāo)記的山羊抗兔抗體(二抗)。

1.2分組與處理取28只大鼠根據(jù)文獻(xiàn)[5,6]采用STZ 55 mg/kg一次性腹腔注射方法制作糖尿病模型。造模3 d后連續(xù)3 d尾靜脈檢測(cè)血糖，血糖均>16.7 mmol/L則造模成功。造模后4周若大鼠尿量>原尿量150%、尿蛋白>30 mg/24 h尿則視為DN模型造模成功。最終造模成功20只，隨機(jī)分為觀察組和對(duì)照組各10只，另選10只健康大鼠為空白組。觀察組于DN造模成功4周時(shí)通過(guò)尾靜脈輸注BMSCs2×106，對(duì)照組同時(shí)尾靜脈注射生理鹽水1 mL，空白組不做任何處理。

1.3 24 h尿蛋白量、血糖、血肌酐(Scr)測(cè)定干預(yù)8周后檢測(cè)24 h尿蛋白量、血糖、Scr。

1.4腎組織足細(xì)胞nephrin、desmin檢測(cè)采用Western blot法。各組大鼠斷頭處死后取部分腎臟組織，電泳、轉(zhuǎn)膜、牛奶封閉后加入兔抗大鼠nephrin、desmin抗體。4 ℃孵育24 h，加入二抗(1∶1 000 IRDyeTM800 標(biāo)記的山羊抗兔抗體)，室溫避光孵育2 h, Odyssey激光成像系統(tǒng)掃描，圖像用Image J軟件分析。以β-actin作為內(nèi)參照，測(cè)定蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2結(jié)果

2.1各組24 h尿蛋白量、血糖、Scr比較見(jiàn)表1。

表1　各組24 h尿蛋白量、血糖、Scr比較

注：與空白組比較，*P<0.05；與對(duì)照組比較，#P<0.05。

2.2各組足細(xì)胞nephrin、desmin表達(dá)比較見(jiàn)表2。

表2　各組足細(xì)胞nephrin、desmin表達(dá)比較

注：與空白組比較，*P<0.05；與對(duì)照組比較，#P<0.05。

3討論

足細(xì)胞損傷是DN早期重要病理特征[1]，蛋白尿形成與足細(xì)胞損傷密切相關(guān)[7,8]。近年研究認(rèn)為，EMT在DN足細(xì)胞損傷中發(fā)揮重要作用[9,10]。足細(xì)胞是一種高度特異、終末分化的腎小球臟層上皮細(xì)胞，是由后腎中胚層的間充質(zhì)細(xì)胞向上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化發(fā)育而來(lái)，并通過(guò)以肌動(dòng)蛋白為主的細(xì)胞骨架系統(tǒng)和足細(xì)胞特異表達(dá)的蛋白分子，在腎小球結(jié)構(gòu)和功能上發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，炎癥、缺血缺氧、高血糖、全身免疫系統(tǒng)疾病等因素均可導(dǎo)致腎臟細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的改變，使得轉(zhuǎn)分化因子與逆轉(zhuǎn)分化因子之間失去平衡，導(dǎo)致EMT[11，12]，從而導(dǎo)致腎小球?yàn)V過(guò)屏障受損，尿蛋白水平升高，腎小球硬化[2,9,10]。足細(xì)胞表型即足細(xì)胞成熟的蛋白標(biāo)志物，包括足細(xì)胞表面蛋白分子和nephrin分子。nephrin是維持裂孔膜完整性的不可缺少的分子。細(xì)胞發(fā)生EMT時(shí)，將失去成熟足細(xì)胞的上皮細(xì)胞樣表型標(biāo)志物如nephrin、緊密連接蛋白-1、P鈣黏蛋白等，而表達(dá)上調(diào)間充質(zhì)細(xì)胞樣表型標(biāo)志物如desmin、成纖維細(xì)胞特殊蛋白-l、整合素連接激酶、細(xì)胞外基質(zhì)纖維連接蛋白、膠原I和基質(zhì)金屬蛋白酶9等[13]。

BMSCs是一類具有自我更新、多向分化潛能、免疫調(diào)節(jié)和低免疫原性的細(xì)胞，具有向骨、軟骨、肌肉、脂肪等多向分化能力[3，14]。實(shí)驗(yàn)表明，BMSCs可向腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，以往廣泛用于各種腎病模型的實(shí)驗(yàn)研究[15]。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，在阿霉素[16]和氨基核苷嘌呤霉素誘導(dǎo)的腎病模型中給予BMSCs可明顯降低蛋白尿水平，減輕足細(xì)胞損傷。在1型和2型糖尿病動(dòng)物模型中給予BMSCs同樣可顯著降低蛋白尿水平，減輕足細(xì)胞的損傷和丟失[4,14]。本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組足細(xì)胞上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白nephrin表達(dá)明顯降低，間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白desmin表達(dá)明顯升高，提示DN大鼠足細(xì)胞存在EMT過(guò)程。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)，BMSCs能明顯改善足細(xì)胞上述病理變化降低蛋白尿，而對(duì)血糖水平無(wú)明顯改善作用。提示BMSCs對(duì)DN有一定治療作用，且該作用獨(dú)立于降糖作用之外，可能與降低足細(xì)胞EMT過(guò)程有關(guān)。

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收稿日期：(2015-07-19)

通信作者：戴春

中圖分類號(hào)：R587.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X(2015)46-0030-02

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.46.011