何潔華 廖建友 吳玨 鄧偉溪

組織特異miRNA在小鼠造血體系細(xì)胞終末分化中的表達(dá)和意義

何潔華 廖建友 吳玨 鄧偉溪

【摘要】目的 鑒定小鼠造血體系發(fā)育過程中特異性表達(dá)的miRNAs，探討其調(diào)控細(xì)胞終末分化的分子機(jī)制。方法 PMA誘導(dǎo)HL-60分化為巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞，Cayman吞噬作用檢測(cè)試劑盒結(jié)合熒光顯微鏡顯影檢測(cè)誘導(dǎo)后細(xì)胞的吞噬作用，Real-time PCR檢測(cè)巨噬細(xì)胞分化指標(biāo)CD 11 b、CD 4以及miR-155的表達(dá)。結(jié)果 成功建立使用PMA誘導(dǎo)人前髓性白血病細(xì)胞HL-60分化為巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞模型，并發(fā)現(xiàn)組織特異性miR-155隨著巨噬細(xì)胞分化表達(dá)水平逐漸上調(diào)。結(jié)論 造血體系特異miR-155參與調(diào)控巨噬細(xì)胞終末分化，揭示組織特異性miRNAs調(diào)控小鼠組織細(xì)胞分化和組織發(fā)育的普遍意義。

【關(guān)鍵詞】造血體系特異miRNA；巨噬細(xì)胞；終末分化

研究發(fā)現(xiàn)[1-2]，小鼠各個(gè)組織中存在著一批時(shí)空特異性表達(dá)miRNA，它們的表達(dá)隨著組織發(fā)育進(jìn)程而改變，同時(shí)只在某個(gè)組織中高表達(dá)，暗示這些miRNA在組織的發(fā)育和組織細(xì)胞的定向分化過程中發(fā)揮著重要的作用[3]。在前期研究中發(fā)現(xiàn)起源于內(nèi)胚層的肝臟的特異性表達(dá)miR-122在小鼠肝細(xì)胞分化和肝臟發(fā)育中有重要的調(diào)控作用[4]，本研究在起源于中胚層造血系統(tǒng)中鑒定到特異性表達(dá)miR-155參與巨噬細(xì)胞終末分化，為證明組織特異性miRNA在小鼠各組織細(xì)胞命運(yùn)決定和組織發(fā)育過程中的調(diào)控作用是普遍存在的提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1 材料

人前髓性白血病細(xì)胞株HL-60 RPMI-1 640 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)的胎牛血清、培養(yǎng)基均購(gòu)自Invitrogen公司；RT-PCR kit購(gòu)自Takara公司；PMA購(gòu)自Sigama公司；巨噬細(xì)胞吞噬作用檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Cayman公司。

1.2 HL-60細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞

HL-60接種到6孔板并同時(shí)加入PMA 進(jìn)行誘導(dǎo)，以0.1 nM，1 nM終濃度加入，誘導(dǎo)兩天后檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)變化，并收取RNA進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 巨噬細(xì)胞吞噬作用檢測(cè)

使用Cayman吞噬作用檢測(cè)試劑盒結(jié)合熒光顯微鏡拍照檢測(cè)誘導(dǎo)后細(xì)胞的吞噬作用，主要根據(jù)細(xì)胞是否吞噬了表面涂有帶熒光標(biāo)記rabbit-IgG的玻璃珠子，即表示體外細(xì)胞的吞噬能力的強(qiáng)弱。

1.4 Real-time PCR

Trizol試劑分別提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)為cDNA，然后于SYBR Green熒光定量試劑盒檢測(cè)，miRNA的表達(dá)量以U 6的表達(dá)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.5 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

qRT-PCR的結(jié)果數(shù)據(jù)來自于至少3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，每次3個(gè)復(fù)孔。在進(jìn)行兩組之間的差異分析時(shí)使用雙尾的Student’s Test；進(jìn)行多組之間的差異分析時(shí)使用ANOVA，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1 巨噬細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化模型的建立

HL-60細(xì)胞在0.1 nM和1 nM的PMA誘導(dǎo)后，細(xì)胞從原來的懸浮狀態(tài)變成貼壁生長(zhǎng)狀態(tài)，吞噬作用檢測(cè)顯示細(xì)胞能夠吞噬帶有熒光標(biāo)記的玻璃珠子。見圖1 A。熒光定量PCR顯示巨噬細(xì)胞分化標(biāo)志物CD 11 b和CD 14 mRNA 表達(dá)上調(diào)。見圖2 B。綜上所示，我們成功構(gòu)建了使用PMA誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞的體外細(xì)胞誘導(dǎo)模型。

2.2 miR-155參與調(diào)控造血體系中巨噬細(xì)胞的分化發(fā)育過程

在HL-60誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞的細(xì)胞模型中確定各造血體系特異性表達(dá)的miRNA的表達(dá)情況，見圖2。在多個(gè)特異性miRNA中，只有miR-155的表達(dá)隨著PMA誘導(dǎo)HL-60分化為巨噬細(xì)胞的分化水平提高，表達(dá)量逐漸上調(diào)，指示miR-155在巨噬細(xì)胞分化發(fā)育中具有調(diào)控作用。

3　討論

圖1　PMA誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞終末分化水平檢測(cè)

圖2　miR-155表達(dá)在巨噬細(xì)胞分化發(fā)育過程中上調(diào)

鑒于我們實(shí)驗(yàn)小組在前期的研究成果，證實(shí)了小鼠肝臟特異性表達(dá)的miR-122能調(diào)節(jié)肝臟細(xì)胞在肝臟發(fā)育過程中增殖和終末分化的平衡，使得肝臟組織的發(fā)育順利進(jìn)行[5]。眾所周知，miR-122是肝臟中表達(dá)量最高的miRNA，占了肝臟中miRNA總量的70%，而且組織特異性極高[6]，在其它組織中基本不表達(dá)。過往對(duì)于miR-122的研究主要集中在其對(duì)于肝炎和肝癌的發(fā)生發(fā)展中的調(diào)控作用[7]。我們的研究首次揭示了miR-122在肝臟細(xì)胞的分化和肝臟的發(fā)育過程中發(fā)揮極其重要的調(diào)控作用，而組織特異性miRNA在組織的發(fā)育過程中的調(diào)控作用的研究已逐漸成為miRNA的研究熱點(diǎn)[8]。因此，進(jìn)一步猜想，是否在小鼠的其它的組織中也存在著像miR-122這樣對(duì)于組織的發(fā)育具有重要調(diào)控作用的組織特異性miRNA。我們將從小鼠組織特異性miRNA開始入手。在本研究中，我們驚喜地在起源于中胚層的造血體系中證明，組織特異性miR-155的表達(dá)量隨著巨噬細(xì)胞的分化程度表達(dá)量逐漸上調(diào)，暗示其在巨噬細(xì)胞終末分化過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。以往的研究已有證明CUX 1在巨噬細(xì)胞系的發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，它主要是通過抑制髓單核細(xì)胞特異性基因gp 91-phox 發(fā)揮功能的，該基因只在終末分化的髓單核細(xì)胞中表達(dá)，CUX 1通過DNA結(jié)合的方式對(duì)gp 91-phox的抑制作用的下調(diào)是誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)育的必需步驟[9-10]。因此，我們大膽提出假設(shè)：組織特異性miR-155是否通過靶向轉(zhuǎn)錄抑制因子CUX 1 調(diào)控小鼠造血體系細(xì)胞命運(yùn)決定，該調(diào)控機(jī)制是否為組織特異性miRNA參與細(xì)胞終末分化的通用機(jī)制？在后續(xù)的研究中，我們將進(jìn)一步探討miR-155調(diào)控巨噬細(xì)胞終末分化的分子機(jī)制，并集中篩選miR-155的靶向基因及其調(diào)控機(jī)制，探索組織特異性miRNA在調(diào)控組織細(xì)胞命運(yùn)決定和組織分化發(fā)育的通用機(jī)制。

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作者單位：510120中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心

廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目：2014A030313175

The Significance of Tissue Specific miRNA in Mice of Hematopoietic System Cells Terminal Differentiation Expression

HE Jiehua LIAO Jianyou WU Jue DENG Weixi Sun Yat-Sen Memorial Hospital Medical Research Center of Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510120, China

[Abstract]Objective To identify the specific miRNA during the development of hematopoietic system, and explore its molecular mechanism. Methods Induction of HL-60 differentiating into macrophage cells with PMA, detection of the phagocytosis with cayman phagocytosis assay kit, expression of miR-155, CD 11 b and CD 14 mRNA were tested by real-time PCR. Results Establish in the induction macrophage differentiation model of HL-60 by PMA successfully, and found that expression of miR-155 increased gradually during differentia. Conclusion Hematopoietic system specific miR-155 regulates macrophage terminal differentiation. This observation indicates an universal regulatory mechanism that different tissue-specific miRNAs are employed to control different tissues development.

[Key words]Hematopoietic system specific miRNA, Macrophage cells, Terminal differentiation

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目：C060604

doi：10.3969/j.issn.1674-9308.2015.23.014

【文章編號(hào)】1674-9308（2015）23-0019-02

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B

【中圖分類號(hào)】R329.2+3