譚量量,沈立榮(浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院,馥莉食品研究院,杭州310058)

果蠅組織中多不飽和脂肪酸代謝產(chǎn)物——類(lèi)二十烷酸的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定

譚量量,沈立榮*
(浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院,馥莉食品研究院,杭州310058)

摘要果蠅樣品經(jīng)固相萃取后,采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行樣品分析,檢測(cè)條件用Endeavorsil(TM)C(18)色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8μm),以0.1%甲酸水-乙腈為流動(dòng)相,流速為0.3 m L/min,柱溫40℃;采用電噴霧離子源負(fù)離子多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式,內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)定量,建立了果蠅組織中15種多不飽和脂肪酸代謝產(chǎn)物——類(lèi)二十烷酸的測(cè)定方法.結(jié)果顯示,在2.5～200 ng/m L范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系(r=0.991),回收率范圍在89.3%～108.9%,日內(nèi)精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)在1.2%～12.4%,日間精密度RSD在1.0%～15.0%,檢出限0.1～2.6 ng/g,定量限0.3～8.7 ng/g.所建方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、選擇性高,為研究模式生物果蠅對(duì)多不飽和脂肪酸的代謝特性提供了科學(xué)依據(jù).

關(guān)鍵詞果蠅;多不飽和脂肪酸;代謝產(chǎn)物;類(lèi)二十烷酸;液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版) 42(1):8～16,2016

Journal of Zhejiang University(Agric.&Life Sci.)

http://www.journals.zju.edu.cn/agr

E-mail:zdxbnsb@zju.edu.cn

第一作者聯(lián)系方式:譚量量(http://orcid.org/0000-0002-2079-3488),E-mail:tll9095@zju.edu.cn

URL:http://www.cnki.net/kcms/detail/33.1247.S.20151215.1750.008.html

Determination of the metabolites,eicosanoids derived from polyunsaturated fatty acids in Drosophila tissue with high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry.Journal of Zhejiang University(Agric.&Life Sci.),2016,42(1):8-16

TAN Liangliang,SHEN Lirong*(College of Biosystems Engineering and Food Science,Fuli Institute of Food Science,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China)

Summary Eicosanoids,which mediate various physiological and pathophysiological processes,are mainly formed from C20 polyunsaturated fatty acids(PUFAs)such as arachidonic acid(AA,20:4n-6)and eicosapentaenoic acid (EPA,20:5n-3)through cyclooxygenases(COX),lipoxygenases(LOXs)and cytochrome P450(CYPs) pathways,including prostaglandins(PGs),thromboxanes(TXs)and the lipoxin/leukotriene family of eicosanoids such as hydroperoxyeicosatetraenoic acids (HPETEs),hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs),and epoxyeicosatrienoic acids(EETs).Vast knowledge of eicosanoids stems from works in mammals.Lipid signaling that complicates our understanding of fatty acid signaling is highly complex and fine-tuned in mammal species.Fortunately,the small genetic model Drosophila melanogaster is considered to be an ideal model to investigate the flexible nature of eicosanoids signaling pathways.However,it seems that Drosophila possess a special lipid ____metabolic system which is different from mammals.Thus,before studying the physiological mechanism ofeicosanoids by using Drosophila,it is necessary to clarify its metabolic characteristics to C20 PUFAs based on the detection of eicosanoids in Drosophila.Therefore,this study is aimed to develop a high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS)method for the determination of eicosanoids in Drosophila.

Fifteen metabolites of AA and EPA produced by human in COX,LOX and CYP pathway were chosen,and each pathway contained 1 or 2 metabolites as delegates to ensure the representative of the method.These eicosanoids included PGF2α,PGE2,PGF3α,PGE3,15(S)-HETE,LTB4,15(S)-HEPE,11(12)-EET,20-HETE,17(18)-Ep ETE,17,18-Di HETE,15(S)-Hp EPE,15(S)-Hp ETE,PGH2and 5(S)-Hp ETE,and PGE2-d4,15(S)-HETE-d8and 20-HETE-d6were used as internal standards.Samples were prepared by solid phase extraction and separated on an EndeavorsilTMC18column(100 mm×2.1 mm,1.8μm).The analytes were detected by using multiple reaction monitoring(MRM)in a negative electrospray ion mode.The HPLC-MS/MS method to analyze 15 selected eicosanoids in Drosophila qualitatively and quantitatively was established by optimizing the sample pretreatment and the detection conditions.

It was found that the recoveries were significantly influenced by the p H of sample adjusted by 1 mol/L sodium acetate buffer containing 5% methanol,and the optimized p H was at 6.The response values of analytes separated on a mobile phase of ultrapure water with 0.1%formic acid-acetonitrile were higher than these of ultrapure water with 0.1%formic acid-methanol,ultrapure water-acetonitrile or ultrapure water-methanol.To reduce the matrix interference,the blank Drosophila matrix was used to prepare the standard working solution.Obtained results showed that the calibration curves were of good linearity for the 15 metabolites in the range of 2.5-100 ng/m L with the correlation coefficient(r)of 0.991.The limits of detection and quantitation were about 0.1-2.6 ng/g and 0.3-8.7 ng/g,respectively.Spiked recovery experiments showed that both recoveries(89.3%-111.5%)and relative standard deviations(1.0%-15.0%)met the requirements of analytical methods.

In conclusion,our study has established a simple,specific and sensitive method that suitable for the determination of eicosanoids in Drosophila which serves an approach to clarify the metabolic characteristics of Drosophila to C20 PUFAs.

Key words Drosophila;polyunsaturated fatty acids;metabolites;eicosanoids;high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry

多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFAs)分為n-3 PUFAs和n-6 PUFAs.前者包括α-亞麻酸(18:3n-3,α-linolenic acid,ALA)、二十碳五烯酸(20:5n-3,eicosapentaenoic acid,EPA)、二十四碳六烯酸(22:6n-3,docosahexenoic acid,DHA);后者包括亞油酸(18:2n-6,linoleic acid,LA)和花生四烯酸(20:4n-6,arachidonic acid,AA).它們?cè)谏矬w內(nèi)具有多種重要的生理功能,如PUFAs能優(yōu)化細(xì)胞膜生物物理特性,PUFAs及其衍生物一起組成了作用廣泛的脂質(zhì)信號(hào)分子群.類(lèi)二十烷酸屬于PUFAs最重要的一類(lèi)衍生物[1],它由20C PUFAs通過(guò)環(huán)氧合酶(cyclooxygenase,COX)、脂氧合酶(lipoxidase,LOX)和細(xì)胞色素P450(cytochrome P450,CYP)3種酶路徑代謝產(chǎn)生[2],主要包括前列腺素(prostaglandins,PGs)、白細(xì)胞三烯(leucotrienes,LTs)、凝血噁烷(thromboxanes,TXs)過(guò)氧化羥基二十碳四烯酸(hydroperoxyeicosatetraenoics,HPETEs)、羥基二十碳四烯酸(hydroxyeicosatetraenoics,HETEs)、羥基二十碳五烯酸(hydroxyeicosapentaenoics,HEPEs)和環(huán)氧化三烯二十烷酸(epoxyeicosatrienoics,EETs)等脂氧素類(lèi)[3],它們幾乎參與了所有人體器官、組織和細(xì)胞的生理活動(dòng)[4],對(duì)穩(wěn)定細(xì)胞膜功能、調(diào)控基因表達(dá)、維持細(xì)胞因子和脂蛋白平衡、抗心血管病、促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育等具有重要作用[5].

早期對(duì)類(lèi)二十烷酸的了解都通過(guò)哺乳動(dòng)物模型上得到,但由于哺乳動(dòng)物生理結(jié)構(gòu)復(fù)雜,過(guò)程多變,且不易控制,還受到成本和倫理學(xué)制約,因此給研究帶來(lái)很多不便.果蠅、線(xiàn)蟲(chóng)和酵母等簡(jiǎn)單模式生物具有成本低廉、生命周期短、繁殖力強(qiáng)等優(yōu)勢(shì),如能與遺傳學(xué)、生物信息學(xué)和代謝組學(xué)方法相結(jié)合,可消除以往類(lèi)二十烷酸研究工作的很多障礙,可為其生理機(jī)制研究提供一條簡(jiǎn)捷有效的新途徑.在簡(jiǎn)單模式生物中,果蠅由于具有類(lèi)似脂肪的身體組織和脂質(zhì)運(yùn)輸系統(tǒng),在生理上更接近人體,最適合作為哺乳動(dòng)物的替代模型[6-7].從理論分析看,通過(guò)果蠅了解類(lèi)二十烷酸的作用機(jī)制后,可為在哺乳動(dòng)物和人體中進(jìn)一步驗(yàn)證提供明確目標(biāo)和方向.但由于果蠅與哺乳動(dòng)物的脂質(zhì)代謝特性畢竟存在差別[8],果蠅能否真正替代哺乳動(dòng)物,首先需通過(guò)實(shí)驗(yàn)了解其對(duì)C20PUFAs的代謝特性及與哺乳動(dòng)物的差異程度.

類(lèi)二十烷酸的提取和檢測(cè)是研究果蠅對(duì)C20 PUFAs代謝特性的基礎(chǔ).但目前關(guān)于果蠅組織中類(lèi)二十烷酸的檢測(cè)還沒(méi)有現(xiàn)成的方法,因此解決這一問(wèn)題是本研究的主要目標(biāo).由于C20 PUFAs通過(guò)COX、LOX和CYP 3種酶代謝路徑產(chǎn)生的衍生物種類(lèi)很多,為了有效分析果蠅與哺乳動(dòng)物對(duì)C20 PUFAs代謝特性的差異,本研究從3條PUFAs代謝路徑各選了1～2種AA和EPA的代表性代謝物共15種類(lèi)二十烷酸.1)COX路徑的代表性代謝產(chǎn)物:PGH2(AA的初級(jí)衍生物,是AA產(chǎn)生的所有PGs前體物質(zhì)),PGE2和PGF2(AA的代謝物),PGE3和PGF3(EPA的代謝物);2)5-LOX路徑的代表性代謝產(chǎn)物:5(S)-HpETE和LTB4(AA的初級(jí)衍生物和次級(jí)代謝產(chǎn)物);15-LOX路徑的代表性代謝產(chǎn)物:15(S)-Hp ETE和15-HETE(AA的初級(jí)衍生物和次級(jí)代謝產(chǎn)物),15(S)-Hp EPE和15-HEPE(EPA的初級(jí)衍生物和次級(jí)代謝產(chǎn)物);3)CYP路徑的代表性代謝產(chǎn)物:11,12-EET和20 HETE(AA代謝產(chǎn)物),17,18-Ep ETE和17,18-Di HETE(EPA代謝產(chǎn)物)[2].根據(jù)15種類(lèi)二十烷酸的性質(zhì),通過(guò)樣品前處理方法優(yōu)化和液相色譜條件以及質(zhì)譜檢測(cè)條件研究,建立了果蠅組織中15種類(lèi)二十烷酸的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry,HPLC-MS/MS)定性、定量分析方法.

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

野生型Canton-S黑腹果蠅(Drosophila melanogaster),采用人工氣候箱培養(yǎng),光照條件為12 h/12 h黑白交替,恒溫25℃,恒濕65%.實(shí)驗(yàn)用飼料配制方法:將玉米粉105 g、瓊脂7.5 g、蔗糖75 g、酵母粉40 g溶解在1 L水中,加熱攪拌均勻,高溫滅菌冷卻至60℃,加5 mL丙酸配制成基礎(chǔ)飼料.果蠅培養(yǎng)14 d后,收集樣品于-80℃保存作為檢測(cè)樣品.

1.1.2試劑

類(lèi)二十烷酸標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)(PGE2-d4、15(S)-HETE-d8和20-HETE-d6,美國(guó)Cayman公司),購(gòu)自上海紐雀客生物科技有限公司;2,6-二叔丁基對(duì)甲苯酚(butylated hydroxytoluene,BHT,色譜純,美國(guó)Sigma公司),購(gòu)自上海通善生物科技有限公司;甲醇、乙腈(色譜純,美國(guó)sigma公司);Milli-Q超純水,其他試劑均為分析純,購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司.

1.1.3儀器與設(shè)備

EkSpertTMultra LC 100型液相色譜儀(美國(guó)Applied Biosystems Sciex公司);Triple QuadTM5500型質(zhì)譜儀(美國(guó)Applied Biosystems Sciex公司);Varian Bond Elute CerifyⅡ固相萃取柱(500 mg/6 m L,美國(guó)Agilent公司);EndeavorsilTMC18色譜柱[(100 mm×2.1 mm,1.8μm)北京迪科馬科技有限公司];KA-1000低速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng));DKS-24電熱恒溫水浴鍋(嘉興市中新醫(yī)療儀器有限公司);雷磁p HS-3C型p H儀(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司);MTN-5800W圓形氮吹濃縮裝置(杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司).

1.2方法

1.2.1樣品預(yù)處理

提取和凈化:準(zhǔn)確稱(chēng)量100 mg果蠅于1.5-m L離心管中,液氮研磨成粉,加到1.5 m L含0.1% BHT冰甲醇中,研磨組織樣品直至完全均質(zhì),加入內(nèi)標(biāo)PGE2-d4、15(S)-HETE-d8和20-HETE-d6各5 ng,渦旋0.5 min,超聲提取10 min,12 000 r/min離心5 min收集上清液,剩余沉淀用1.5 m L冰甲醇(含0.1% BHT)重新懸浮,12 000 r/min離心5 min后收集,合并2次上清液.添加1 mol/L的醋酸鈉緩沖液(含5%甲醇)定容到10 m L調(diào)節(jié)樣品p H,待凈化.用25 ng/m L的混合標(biāo)準(zhǔn)品,比較用p H為5、5.5、6、6.5、7的1 mol/L醋酸鈉緩沖液(含5%甲醇)調(diào)節(jié)樣品p H時(shí)對(duì)脂肪酸代謝產(chǎn)物回收率的影響.采用固相萃取法凈化[9].

1.2.2質(zhì)譜分析方法

采用ESI負(fù)離子掃描模式進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(multi reaction monitoring mode,MRM),掃描時(shí)間為50 ms,離子噴霧電壓為-4 500 V,離子源溫度為400℃,氣簾氣壓力為30 psi(0.21 MPa),霧化氣壓力為35 psi(0.24 MPa),輔助氣壓力為35 psi(0.24 MPa).霧化氣、錐孔氣為氮?dú)?碰撞氣為高純氮?dú)?通過(guò)條件優(yōu)化得到各標(biāo)準(zhǔn)品的定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、去簇電壓、入口電壓、碰撞氣能量和碰撞室出口電壓等質(zhì)譜參數(shù).

1.2.3色譜分析方法

使用EndeavorsilTMC18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8μm),柱溫40℃,進(jìn)樣量5μL,流速0.3 m L/min.用適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液考察比較甲醇和乙腈作為流動(dòng)相的有機(jī)成分以及水相中加或不加1%的甲酸,對(duì)18種代謝產(chǎn)物的分離效果和響應(yīng)值的影響,最終選擇最佳流動(dòng)相.

1.2.4基質(zhì)干擾

取不含類(lèi)二十烷酸的空白果蠅,按樣品前處理方法進(jìn)行,進(jìn)樣檢測(cè)分析果蠅基質(zhì)中是否含有干擾峰.同時(shí),向空白果蠅基質(zhì)樣品添加適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,檢測(cè)分析樣品基質(zhì)碎片離子對(duì)待測(cè)脂肪酸代謝產(chǎn)物和內(nèi)標(biāo)定量離子的干擾.

1.2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備

樣品采用內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法[10]進(jìn)行定量,選用空白果蠅基質(zhì)來(lái)配制所使用的一系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作.配制質(zhì)量濃度為2.5、5、12.5、25、50、100、200 ng/m L混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,取200μL不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別加入15μL內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(1/3 μg/m L)(相當(dāng)于加內(nèi)標(biāo)各5 ng),在相同的HPLCMS/MS條件下測(cè)定.每一濃度平行3次,以標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)的定量離子峰面積之比的平均值為縱坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)作圖,繪制內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn),并計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù).

1.2.6回收率和精密度

在空白果蠅樣品中添加低(10 ng/g)、中(25 ng/g)、高(50 ng/g)3個(gè)質(zhì)量濃度水平的15種類(lèi)二十烷酸的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,每個(gè)濃度做3個(gè)平行,進(jìn)行回收率和精密度實(shí)驗(yàn).

1.2.7檢測(cè)限和定量限

用低濃度為10 ng/g添加水平的峰高測(cè)定值與3倍信噪比(S/N=3)進(jìn)行比值換算得到檢測(cè)限,用其峰高與10倍的信噪比(S/N=10)進(jìn)行比值換算得到定量限.

2　結(jié)果

2.1醋酸鈉緩沖液(含5%甲醇)p H的優(yōu)化

不同的醋酸鈉緩沖液(含5%甲醇)p H對(duì)目標(biāo)提取物回收率的影響分析結(jié)果顯示,總體趨勢(shì)相同.從COX、LOX和CYP路徑分別選取PGE2、15(S)-HETE和15(S)-HEPE、17(18)-EpETE為代表性目標(biāo)分析物(圖1)可見(jiàn),當(dāng)醋酸鈉緩沖液的p H為5和5.5時(shí)回收率很低,p H為6時(shí)最高,p H為6.5時(shí)稍降,p H為7時(shí)回收率較低,故最終選擇p H為6的1 mol/L醋酸鈉緩沖液(含5%甲醇)調(diào)節(jié)樣品p H值.

2.2質(zhì)譜條件

代謝產(chǎn)物檢測(cè)質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1.

2.3液相色譜條件

流動(dòng)相組成優(yōu)化結(jié)果(圖2)表明,與不加酸的水-甲醇和水-乙腈體系相比,水相加酸的流動(dòng)相響應(yīng)值明顯更高,且用0.1%甲酸水-乙腈比用0.1%

甲酸水-甲醇作流動(dòng)相對(duì)分析物的響應(yīng)值更高,原因可能是在負(fù)離子模式下加甲酸作為添加劑,有利于類(lèi)二十烷酸的離子化,且乙腈比甲醇更有利于類(lèi)二十烷酸丟失H質(zhì)子.以上所述,本實(shí)驗(yàn)選擇0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)作為流動(dòng)相.梯度洗脫程序?yàn)?～10 min,80%～5% A;10～12 min,5% A;13～15 min,5%～80% A;16～17 min,80% A.

2.4基質(zhì)干擾

由不含類(lèi)二十烷酸的果蠅基質(zhì)液相色譜圖(圖3A)可見(jiàn),空白樣品的響應(yīng)值很低,響應(yīng)值(countspersecond,cps)范圍為20～200 cps,無(wú)特征離子峰的出現(xiàn),說(shuō)明空白對(duì)照組果蠅體內(nèi)缺乏待測(cè)目標(biāo)產(chǎn)物.由果蠅基質(zhì)中的混合標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖(圖3B)待測(cè)脂肪酸代謝產(chǎn)物和內(nèi)標(biāo)定量離子沒(méi)有受到樣品基質(zhì)碎片離子的干擾,峰形良好,不影響類(lèi)二十烷酸的檢測(cè).果蠅基質(zhì)樣品添加25 ng/g 15種標(biāo)準(zhǔn)品的定量離子對(duì)有明顯的出峰,峰高響應(yīng)值范圍為6 600～89 000 cps.

2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)的線(xiàn)性方程及相關(guān)系數(shù)(表2)表明,15種類(lèi)二十烷酸在2.5～200 ng/m L的范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.991,可滿(mǎn)足定量分析要求.

2.6回收率與精密度

表3顯示,加標(biāo)回收率在89.3%～108.9%,日內(nèi)精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD) 在1.2%～12.4%,日間精密度RSD在1.0%～15.0%,故本方法的準(zhǔn)確度和精密度均滿(mǎn)足分析要求.

2.7 檢測(cè)限與定量限

由15種代謝產(chǎn)物在果蠅基質(zhì)中的檢測(cè)限和定量限(表4)可見(jiàn),檢測(cè)限范圍為0.1～2.6 ng/g,定量限范圍為0.3～8.7 ng/g.

3　討論

現(xiàn)有的文獻(xiàn)中對(duì)果蠅對(duì)C20 PUFAs的代謝特性一直存在很大爭(zhēng)議:一方面,有研究表明果蠅既不需要也不能合成C20及以上的PUFAs,如RAPPORT等[11]發(fā)現(xiàn)果蠅可以在完全無(wú)菌且不含外源脂肪酸的合成培養(yǎng)基中連續(xù)生存十代以上;酶同源性分析表明,由于果蠅缺乏哺乳動(dòng)物多不飽和脂肪酸合成和代謝途徑的限制性酶—Δ-6/Δ-5去飽和酶的編碼基因[8],可以推測(cè),即使含有外源的C18PUFAs,果蠅也不能合成C20PUFAs[8,12-13];另一方面,也有報(bào)道顯示,C20 PUFAs的衍生物類(lèi)二十烷酸對(duì)果蠅的免疫應(yīng)答[14 15]和卵泡成熟[16]有著至關(guān)重要的作用,但相關(guān)報(bào)道都未作果蠅組織中是否含有相關(guān)類(lèi)二十烷酸的檢測(cè).

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)系統(tǒng)檢索結(jié)果,迄今為止,只發(fā)現(xiàn)1篇報(bào)道檢測(cè)果蠅組織中類(lèi)二十烷酸的文獻(xiàn).GUALDE等[17]通過(guò)GC-MS檢測(cè),發(fā)現(xiàn)用AA培養(yǎng)的果蠅勻漿中有AA在LOX路徑的代謝產(chǎn)物8-、9-、12-、15-HETE,并通過(guò)HPLC-RIA(放射免疫分析)檢測(cè)到了AA通過(guò)COX路徑的代謝物PGE2.但該報(bào)道中的樣品前處理只經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的有機(jī)提取,有存在帶來(lái)雜質(zhì)干擾的可能.另外GC-MS甲酯化過(guò)程繁瑣且所用試劑毒性很大,HPLC-RIA太過(guò)耗時(shí),還涉及放射性物質(zhì),不利于環(huán)境保護(hù)和人體健康.

本研究采用固相萃取法進(jìn)行了樣品前處理,可有效去除基質(zhì)中的雜質(zhì),并保留待測(cè)物.同時(shí)采用內(nèi)標(biāo)法測(cè)定,在樣品前處理時(shí)加入了內(nèi)標(biāo)物,減少了檢測(cè)誤差;特別是采用最新檢測(cè)設(shè)備,以及更靈敏、快速HPLC-MS/MS檢測(cè)方法,通過(guò)MRM掃描模式跟蹤待測(cè)物的特征離子對(duì),實(shí)現(xiàn)了對(duì)待測(cè)物的特異性?huà)呙?體現(xiàn)出選擇性好,可以在較短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)小量樣品中微量化合物的定量分析優(yōu)勢(shì),具有精密度和回收率較高,專(zhuān)屬性強(qiáng)的特點(diǎn).

4　結(jié)論

本研究建立了HPLC-MS/MS方法同時(shí)檢測(cè)果蠅組織中15種類(lèi)二十烷酸最佳定性、定量分析方法,為研究果蠅對(duì)PUFAs的代謝特性提供了方法學(xué)基礎(chǔ),更為進(jìn)一步探究果蠅與哺乳動(dòng)物對(duì)多不飽和脂肪酸代謝的差異性,評(píng)價(jià)其作為營(yíng)養(yǎng)基因組學(xué)研究的模型適用性提供了技術(shù)支撐.

致謝 浙江大學(xué)農(nóng)學(xué)院朱國(guó)念教授為本研究提供了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜設(shè)備,桂文君副教授、李舒盈同學(xué)和楊梅博士為本研究提供了指導(dǎo)和幫助,謹(jǐn)致謝意.

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收稿日期(Received):2015-03-23;接受日期(Accepted):2015-07-11;網(wǎng)絡(luò)出版日期(Published online):2015-12-15

*通信作者(

Corresponding author):沈立榮(http://orcid.org/0000-0003-3606-632X),Tel:+86-571-88982167,E-mail:shenlirong@zju.edu.cn

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金(31271848);浙江大學(xué)馥莉食品研究院基金項(xiàng)目(KY201404).

DOI:10.3785/j.issn.1008-9209.2015.03.232

中圖分類(lèi)號(hào)Q 591.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A