高連如

·述評·

“生物藥”
——Wharton’s jelly源間充質干細胞

高連如

干細胞治療代表生物冶療進入到了一個嶄新的時代。間充質干細胞是存在于胚胎或成體組織中來源于中胚層具有多向分化潛能的干細胞。由于成體間充質干細胞的質量與數量自身缺陷，使之應用受到了很大限制。Wharton’s jelly組織，是起始于胚胎發(fā)育第13天的胚外中胚層組織。使用基因微陣列分析及功能分析，首次發(fā)現Wharton’s jelly源間充質干細胞（Wharton’s jelly derived mesenchymal stem cells，WJMSCs）高表達胚胎早期干性基因及心肌細胞分化早期特異轉錄因子，可分化心肌細胞等多種細胞。進而，應用臨床級WJMSCs經冠狀動脈移植治療ST抬高型急性心肌梗死患者的隨機雙盲臨床試驗，首次證明WJMSCs可明顯改善心肌活力及心臟功能。因此，WJMSCs具有極其重要益處；無倫理涉及，有強的分化潛能，無致瘤性；加之，WJMSCs可作為產品，在任何時候病情需要時立即應用。為此，WJMSCs作為真正意義上的干細胞族，將最有希望成為具有應用前景的干細胞生物藥。

間充質干細胞；Wharton’s jelly源間充質干細胞；生物藥物

［Abstract］Cell-based treatment represents a new generation in the evolution of biological therapeutics.Mesenchymal stem cells（MSCs）are mesoderm-derived multipotent stromal cells that reside in embryonic and adult tissues.The use of adult MSCs is limited by the quality and quantity of host stem cells.Wharton’s jelly of the umbilical cord originates from the extraembryonic and/or the embryonic mesoderm at day 13 of embryonic development.Using Affymetrix GeneChip microarray and functional network analyses，we found for the first time that Wharton’s jelly-derived MSCs （WJMSCs），except for their expression of stemness molecular markers in common with human ESCs （hESCs），exhibited a high expression of early cardiac transcription factor genes and could be induced to differentiate into cardiomyocyte-like cells.Further，we demonstrated for the first time that intracoronary delivery of prepared clinical-grade WJMSCs was safe in treating patients with an STAMI attack by double-blind，randomized controlled trial and could significantly improve myocardial viability and heart function.It is therefore important to consider the benefits of WJMSCs，which are not ethically sensitive，have differentiation potential，and do not have the worrying issue of teratoma formation.Moreover，as the off the shelf product，WJMSCs can be applied immediately，and on demand.Thus，WJMSCs constitute a true stem cell population and are promising cells as a biological drug for stem cell-based therapies.

［Key words］Mesenchymal stem cells（MSCs）；Wharton’s jelly-derived mesenchymal stem cells（WJMSCs）；Biological drug

21世紀，人類疾病治療模式在繼現代醫(yī)學——藥物、手術、機械輔助等手段后，一個嶄新的充滿希望的新理念——細胞生物治療理論誕生了，這將給人類帶來什么樣的變化與影響，如此快速之進展，正如Science、Nature中所表述的“即使站在世界最前沿的科學家也難以預料”［1-2］。干細胞再生醫(yī)學正是在這日新月異的科學進展中不斷更新傳統治療理念。干細胞是一類未分化的細胞或原始細胞，具有自我復制、能夠分化成為至少1種功能細胞的早期未分化細胞。在一定的條件下，干細胞可以定向分化成機體內的功能細胞，形成任何類型的組織和器官，即具有“可塑性”。根據在個體發(fā)育過程中出現的先后次序不同，干細胞可分為胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs）和成體干細胞。當受精卵分裂發(fā)育為囊胚時，內層細胞團的細胞即為ESCs。ESCs雖然有最好的分化潛能，但涉及倫理道德、潛在免疫和致瘤風險還不能應用于臨床。2006年Takahashi 和Yamanaka［3］首個建立了誘導型多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPS），將自體成體細胞經基因工程改造為類似ESCs的具有多向分化潛能的iPS，至今已10年，雖對iPS寄予了極大希望，但目前研究發(fā)現，iPS由于基因整合如c-myc基因，或基因插入突變，及對腫瘤抑制基因的分裂作用等不良因素存在，具有明顯致瘤風險［4］，以致iPS至今難以應用于臨床。成體干細胞，是指那些具有組織或器官特異性的干細胞，具有很強的可塑性，組織類型非常廣泛，是目前較為理想的再生醫(yī)學種子細胞［5］。

1 間充質干細胞

間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是來源于中胚層具有自我更新、多向分化潛能及特殊免疫調節(jié)功能的一個重要的干細胞成員。MSCs廣泛存在于成體及胚胎組織中，如脂肪、肌肉、肺、心臟、血液、牙齦、胎盤、子宮內膜、羊膜、Wharton’s jelly。MSCs有一個廣泛分化譜，它可以向骨、軟骨、脂肪、心肌細胞、血管內皮、肌肉、腎小管、神經元、肝細胞/島細胞的中胚層、外胚層、內胚層細胞分化。正是由于MSCs廣泛分化潛能，使它在再生醫(yī)學代替修復病損及衰竭的組織器官上占有特殊重要地位［5］。不僅如此，MSCs廣泛旁/自分泌功能，分泌多種細胞因子、生長因子、生物活性肽介導參與了多臟器修復與重建效應。MSCs最獨特之處是特殊的免疫調節(jié)功能，這使它在多種自身免疫疾病治療上已嶄露頭角［5］。而最為重要的是，經廣泛基礎研究及初期臨床研究發(fā)現，MSCs體內應用安全性好，無突變致瘤性。因此，作為目前最具應用前景的“生物藥”——MSCs，國際上已注冊400多項臨床研究。

2 自體成體間充質干細胞的缺陷

2014年Science、Nature相繼發(fā)表2篇文章引起世界震動，即科學家將年輕小鼠的血液輸給了老年小鼠，結果發(fā)現年輕小鼠血液中的干細胞幫助老年小鼠恢復了肌肉和神經功能［6-7］。然而，衰老的自身干細胞卻難以獲得如此效果?，F眾多基礎研究證據表明，成體MSCs隨著年齡增長其端粒酶長度進行性縮短，尤其合并各種病理狀態(tài)時，MSCs的抗氧化應激能力逐漸減弱，凋亡增加，存活增殖能力及分化潛能明顯下降，以致其無論是再生能力還是免疫調節(jié)功能均顯著減低［8］。在對一組急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）患者行經冠狀動脈自體骨髓間充質干細胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）移植的隨機對照臨床試驗中，首次發(fā)現AMI患者尤其老年患者BMSCs數目及增殖能力明顯減低，以致AMI患者BMSCs移植后6個月、1年既未能顯著縮小梗死范圍，也未能明顯改善心功能及限制心室重構［9］。因此，擺在臨床面前一個重要且急需解決的問題是如何獲得富有生命力的MSCs。胚胎外組織，新生兒出生后遺留的組織如胎盤、臍帶、Wharton’s jelly、臍血、羊膜、絨毛膜正是介于胚胎與成體組織之間的具有原始特性的組織［10-11］。

3 Wharton’s jelly源間充質干細胞

3.1Wharton’s jelly源間充質干細胞的特殊組織來源 Wharton’s jelly起源于胚胎發(fā)育13 d時的中/內胚層。此時，卵黃囊壁的胚外中胚層內由間充質干細胞密集而成的細胞團即血島，血島周邊細胞分化為內皮細胞，內皮細胞圍成的內皮管即原始血管，血島中央的游離細胞分化為原始造血細胞，內皮管不斷向外出芽延伸，逐漸形成一個叢狀分布的內皮管網，分布于胚體內外的間充質中，稱之為“心血管系統發(fā)源地”“干細胞池”。此后，隨胚胎發(fā)育遺存于臍帶內2條動脈、1條靜脈間的膠狀組織即Wharton’s jelly組織［12］。

3.2Wharton’s jelly源間充質干細胞的多能干細胞生物學特性 Wharton’s jelly源間充質干細胞（Wharton’s jelly-derived mesenchymal stem cells，WJMSCs）在標準培養(yǎng)條件下黏附于塑料制品生長；表達CD44、CD73、CD90、CD105、人類白細胞抗原ABC；不表達CD45、CD34、人類白細胞抗原DR；體外可誘導分化為成骨細胞和脂肪細胞；故其符合國際細胞治療學會規(guī)定的MSCs標準。而WJMSCs增殖能力遠遠高于BMSCs，集落形成單位是BMSCs的300倍（3 000/ 106比10/106），原代培養(yǎng)僅需6～8 d。WJMSCs分泌大量細胞因子、生長因子遠高于BMSCs，如分泌肝細胞生長因子是BMSCs的31.3倍（12 569.8± 710.2比402.6±203.0）、分泌粒細胞刺激因子水平是BMSCs 1 677倍（1 845.0±881.0比1.1±0.3），與BMSCs基因對比分析顯示WJMSCs表達胚胎干細胞基因標志的NANOG、DNMT3B和GABRB3，而BMSCs通常不表達［13-14］。應用全基因微陣列與ESCs對比分析發(fā)現，WJMSCs不僅表達多種胚胎干細胞標志基因，如OCT4、SSEA3、SSEA4、Nkx2.5、KLF4、FLK1、SOX2、NANOG、MYC、TERT、REX1、CRIPTO DAPPA4、TRA-1-8、Isl-1，而特征性高表示心肌特異轉錄因子Isl-1、Nkx2.5、Flk-1［15］。WJMSCs具有顯著心肌細胞分化潛能，在體外WJMSCs與鼠胎兒心肌細胞共培養(yǎng)5 d，50%以上形成規(guī)律跳動的心肌細胞，呈現同步協調收縮，有電偶聯［動作電位（186±12）ms］，表達特異心肌細胞標志物α-肌動蛋白、肌鈣蛋白T、轉錄因子GATA-4、間隙連接蛋白43。當WJMSCs與小鼠缺血心肌組織共培養(yǎng)時，WJMSCs可與小鼠心肌組織整合［16-17］。WJMSCs在體外內皮細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d，分化為表達CD133、血小板-內皮細胞黏附分子、血管內皮生長因子受體、血管性血友病因子標志的典型內皮細胞；14 d分化為鵝卵石樣單層內皮，可形成毛細血管網、微血管。當把Wharton’s jelly間充質干細胞來源的內皮祖細胞移植到股動脈損傷（用金屬絲損傷）的小鼠，小鼠受損的股動脈迅速內皮化，14 d新生膜與中膜面積比值明顯減少，表明其可修復內皮并顯著抑制內膜增殖［18-19］。以上表明WJMSCs可向不同細胞分化，分化為心肌細胞、內皮細胞、平滑肌細胞。這種分化特征在其他成體MSCs中均未見過。因此，越來越多研究者認為WJMSCs是真正意義的原始干細胞、iPS［20］。

3.3WJMSCs特殊的免疫學性質 WJMSCs雖然具有ESCs某些生物學特性，但關鍵不同的是WJMSCs具有獨特的免疫學特性，WJMSCs僅表達人類白細胞抗原ABC，不表達人類白細胞Ⅱ類抗原、人類白細胞抗原DR，協同刺激抗原CD80、CD86而表達人類白細胞抗原G，從而抑制免疫殺傷自然殺傷細胞、調節(jié)T淋巴細胞，達到免疫調節(jié)、抗炎癥反應，而無免疫源性。WJMSCs移植后整體免疫學觀察:①動態(tài)混合淋巴細胞培養(yǎng)實驗發(fā)現，WJMSCs對異體淋巴細胞有明顯抑制增殖反應功能；②外周血T細胞亞群檢測，流式細胞儀動態(tài)檢測移植后大鼠周圍血T淋巴細胞CD3、CD4、CD8均無刺激增加［21］。Rachakatla等［22］將大劑量的WJMSCs通過不同途徑，經靜脈和皮下注射移植到嚴重免疫缺陷的小鼠，移植后50 d進行多臟器、多組織病理學檢測，尋找腫瘤證據，結果無任何異常組織病理改變發(fā)現，無致瘤性傾向。

3.4WJMSCs治療急性心肌梗死隨機雙盲安慰劑對照臨床試驗 在完成WJMSCs治療慢性缺血性心力衰竭Ⅰ期臨床試驗后［21］，在國內11家心臟中心，入選160例ST抬高型AMI患者，剔除43例（因多種原因），116例ST抬高型AMI發(fā)病12 h內成功支架置入血流重建（心肌梗死溶栓3級）患者，由計算機統一隨機雙盲分配。①WJMSCs組:冠狀動脈介入治療術后第5天行經冠狀動脈WJMSCs移植術，即在梗死相關冠狀動脈經導絲球囊導管在阻斷血流下分4次共灌入6×106WJMSCs。②對照組:安慰劑除細胞外的溶液，灌注方法相同。移植后4個月應用檢測心肌活力金標準18F-氟脫氧葡萄糖正電子發(fā)射計算機斷層顯像及99mTc-單光子發(fā)射計算機斷層成像檢測心肌再生與灌注，發(fā)現心肌活力絕對值增加［（6.9±0.6）%、95%置信區(qū)間（confidence interval，CI）5.7～8.2比（3.3±0.7）%、95%CI 1.8～4.7，P＜0.000 1］；心肌灌注絕對值增加［（7.1±0.8）%、95%CI 5.4～8.8比（3.9±0.6）%、95%CI 2.8～5.0，P=0.002］；左室射血分數持續(xù)改善，至18個月左心室射血分數絕對值增加［7.8±0.9（6.0～9.7）比2.8± 1.2（0.4～5.1），P=0.001］。最為突出的是WJMSCs治療顯著限制了心室重構，18個月左室收縮末容量及舒張末容量均顯著低于對照組（P分別為0.000 4、0.004）［23］。研究呈現心肌梗死范圍縮小與心功能改善、心室重構限制一致性效應［23］，顯著優(yōu)于其他臨床研究［24-25］。安全性18個月隨訪，無任何不良事件發(fā)生，異基因WJMSCs體內移植未觸發(fā)免疫反應［23］。

3.5目前WJMSCs其他臨床研究 ①Ⅰ型糖尿病:一個雙盲臨床研究，入選15例新發(fā)生的Ⅰ型糖尿病，經靜脈輸入（1.5～3.2）×107WJMSCs 2次后，20% （3/15）的患者停止了胰島素應用、53%（8/15）的患者胰島素用量減至50%，還有20%（3/15）的患者胰島素用量減為15%～50%，已持續(xù)24個月［26］。②Ⅱ型糖尿病:一個非安慰劑對照臨床研究，22例Ⅱ型糖尿病患者中17例胰島素依賴患者，經WJMSCs 106/kg 2次移植，6個月隨訪17例中7例停用胰島素，另9例胰島素用量減少50%或50%以上，均伴糖化血紅蛋白逐漸減低，血中炎性因子明顯減低［27］。③系統性紅斑狼瘡:一組典型嚴重系統性紅斑狼瘡患者40例，給予106/kg WJMSCs 2次移植，12個月隨訪，其中24例癥狀包括蛋白尿、臨床癥狀、實驗室指標、系統性紅斑狼瘡指數明顯緩解，無任何不良反應，僅少數患者效果不明顯［28］。④其他免疫性疾病、器官移植抗排斥反應均顯示其良好治療效果。尤其是對長期因應用免疫抑制、激素所遭受不良反應磨難的患者，WJMSCs特殊的免疫調節(jié)功能可抑制B細胞產生過多抗體損害自身組織，抑制效應及細胞毒性T淋巴細胞增殖破壞自身組織，提高抑制性調節(jié)性T細胞數目，增加白介素-10及轉化生長因子-β炎癥抑制因子分泌，最終達到免疫平衡狀態(tài)，終止了自身免疫反應［29］。

3.6WJMSCs臨床應用的特殊地位 鑒于上述研究，ESCs、多能干細胞尚不能應用于臨床。成體干細胞，尤其是老年人及在各種病理條件下，患者自身成體干細胞存在數量少、增殖能力差、劑量與功能不足，又是有創(chuàng)性取材，不能滿足臨床需求。WJMSCs取材于臍帶，為出生后遺棄物，無倫理道德問題、取材方便、規(guī)范標準制備、可靠凍存、隨時應用，尤其是WJMSCs獨特的類似原始iPS的生物學特性，無免疫源性、無致瘤性，構成了異體干細胞臨床應用的特殊地位。如AMI患者，細胞移植可在最佳時間窗進行；冠狀動脈支架置入術后可早期快速內皮化及預防再狹窄。尤其在心血管再生醫(yī)學、免疫調節(jié)及糖尿病等治療上顯示出其極其重要的應用前景，受到了國際社會廣泛高度關注［30］。

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“Biological drug”:mesenchymal stem cells derived from umbilical cord

GAO Lianru
（Heart Center，Navy General Hospital，Beijing 100048，China）

R329.2+4

A

2095-3097（2016）04-0193-05

10.3969/j.issn.2095-3097.2016.04.001

國家863項目（2011AA020102、2013AA020101）

100048北京，海軍總醫(yī)院心臟中心（高連如）

（2016-07-08 本文編輯:徐海琴）