甘亞平，李敏才，朱小龍，蔣偉，廖文莉，李素琴，黃海燕(湖北科技學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北咸寧43700;咸寧市第一人民醫(yī)院)

胃癌組織中Ki-67、p63和p16的表達(dá)變化及意義

甘亞平1，李敏才1，朱小龍1，蔣偉1，廖文莉1，李素琴1，黃海燕2
(1湖北科技學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北咸寧437100;2咸寧市第一人民醫(yī)院)

摘要:目的觀察胃癌組織中Ki-67、p63和p16的表達(dá)變化，并探討其意義。方法收集58例胃癌患者手術(shù)切除標(biāo)本，另取胃鏡檢查組織學(xué)相對正常的胃黏膜組織標(biāo)本20份作為正常對照。采用免疫組化法檢測胃癌組織及正常胃黏膜組織中Ki-67、p63和p16表達(dá)。結(jié)果Ki-67、p63和p16在正常胃黏膜組織中的陽性表達(dá)率分別為25%(5/20)、15%(3/20)、60%(12/20)，在胃癌組織中的陽性表達(dá)率分別為76%(44/58)、78%(45/58)、40%(34/ 58)。胃癌組織中Ki-67和p63陽性表達(dá)率顯著高于、p16陽性表達(dá)率顯著低于正常胃黏膜組織(P均＜0.05)。胃癌組織中Ki-67蛋白陽性表達(dá)率與浸潤深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均＜0.05)。p63陽性表達(dá)率與胃癌的浸潤深度與分化程度有關(guān)(P均＜0.05)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無明顯相關(guān)性。p16陽性表達(dá)率與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜0.05)，與浸潤深度、分化程度無明顯關(guān)系。在胃癌組織中，Ki-67表達(dá)與p63表達(dá)呈正相關(guān)(r =0.560，P =0.044); Ki-67表達(dá)與p16表達(dá)無相關(guān)性(r =0.472，P =0.111)。結(jié)論胃癌組織中Ki-67、p63和p16表達(dá)明顯升高，三者表達(dá)與胃癌的浸潤深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān); Ki-67、、p63、p16可作為胃癌診斷的選擇性標(biāo)記物。

關(guān)鍵詞:胃腫瘤; Ki-67蛋白; p63蛋白; p16蛋白

原發(fā)性胃癌是多種致癌因子協(xié)同作用的結(jié)果［1］。探討胃癌中致癌因子的蛋白表達(dá)、作用機(jī)制及相互之間的聯(lián)系，對闡明胃癌的發(fā)生、發(fā)展、生物學(xué)行為與病理特征具有重要價值［2］。同時檢測特異性生物學(xué)標(biāo)記物有助于胃癌早期診斷、治療和預(yù)后評估［3］。2014年6月～2015年3月，我們采用免疫組化法檢測了Ki-67、p63和p16蛋白在胃癌組織中的表達(dá)，分析三種蛋白在胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中的意義，旨在為胃癌臨床診斷和治療提供依據(jù)。

1　資料與方法

1.1臨床資料收集2012年1月～2014年12月咸寧市第一人民醫(yī)院病理科檢查的58例胃癌患者手術(shù)切除癌組織標(biāo)本，患者男38例、女20例，年齡34～63歲、平均55歲。切片均經(jīng)HE染色觀察并確診為腺癌，按WHO標(biāo)準(zhǔn)分類診斷標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)病理學(xué)檢查確診，其中高中分化35例，低分化23例;侵及漿膜及漿膜以外者22例，未及漿膜者36例(其中侵及黏膜8例，侵及肌層28例);有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例，未見淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36例。另取胃鏡檢查組織學(xué)相對正常的胃黏膜組織標(biāo)本20例作為正常對照，其中男12例、女8例，年齡平均50歲。兩組年齡、性別等具有可比性。

1.2胃癌組織及正常胃黏膜組織中Ki-67、p63、p16蛋白表達(dá)檢測標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋。APES涂膠后切片，按免疫組化試劑盒說明書操作進(jìn)行免疫組化染色。一抗用Ki-67、p63、p16單克隆抗體孵育過夜，PBS洗后用二抗孵育;最后用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液顯色;蘇木素復(fù)染，中性樹脂封片，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況。結(jié)果判定: Ki-67表達(dá)定位于胞核，陽性細(xì)胞為棕黃色顆粒。p63表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，陽性細(xì)胞呈黃色或棕黃色顆粒，彌漫性或局灶性分布。p16表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，陽性細(xì)胞呈彌漫性或局灶性分布。染色結(jié)果按每張切片的陽性細(xì)胞數(shù)比例及著色深淺計(jì)分，行半定量分析。光學(xué)顯微鏡下(×400)計(jì)數(shù)5個視野中的100個細(xì)胞，采用雙評分法，陽性細(xì)胞百分率評分≤10%為0分、11%～24%為1分、25%～50%為2分、51%～75%為3分、＞75%為4 分;染色強(qiáng)度評分:無顯色為0分、淺棕黃色為1分、棕黃色為2分、棕褐色為3分。將上述2項(xiàng)得分相加，≥2分為陽性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。組間兩兩比較用χ2檢驗(yàn)，Ki-67與p63、p16蛋白表達(dá)的

關(guān)系采用Spearman相關(guān)性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1 p16、p63和Ki-67在正常胃黏膜組織和胃癌組織中的表達(dá)Ki-67、p63和p16在正常胃黏膜組織中的陽性表達(dá)率分別為25%(5 /20)、15%(3 /20)、60%(12 /20)，在胃癌組織中的陽性表達(dá)率分別為76%(44 /58)、78%(45 /58)、40%(34 /58)。胃癌組織中Ki-67和p63陽性表達(dá)率顯著高于、p16陽性表達(dá)率顯著低于正常胃黏膜組織(P均＜0.05)。

2.2 Ki-67、p63和p16表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系Ki-67蛋白的陽性表達(dá)率與浸潤深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均＜0.05)。p63陽性表達(dá)率與胃癌的浸潤深度與分化程度有關(guān)(P均＜0.05)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無明顯相關(guān)性。p16陽性表達(dá)率與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜0.05)，與浸潤深度、分化程度無明顯關(guān)系。見表1。

表1　Ki-67、p63和p16在胃癌組織中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 Ki-67與p63、p16蛋白表達(dá)的相關(guān)性在胃癌組織中，Ki-67表達(dá)與p63表達(dá)呈正相關(guān)(r =0.560，P = 0.044); Ki-67表達(dá)與p16表達(dá)無相關(guān)性(r = 0.472，P =0.111)。

3　討論

Ki-67抗原是一類與細(xì)胞周期相關(guān)的增殖細(xì)胞核抗原，抗原定位于第10號染色體上。細(xì)胞在G0期無表達(dá)，G1期出現(xiàn)，S期和G2期逐漸增加，M期達(dá)高峰［4］，在細(xì)胞分裂晚期很快消失。腫瘤組織中Ki-67異常表達(dá)是腫瘤細(xì)胞增殖表現(xiàn)，是反映腫瘤病變和分級的敏感指標(biāo)。因此Ki-67表達(dá)情況可反映腫瘤細(xì)胞的增殖活性、增殖指數(shù)、分化程度、浸潤轉(zhuǎn)移等，與預(yù)后密切相關(guān)，常作為評判腫瘤預(yù)后參考指標(biāo)之一［5］。Ki-67表達(dá)陽性表示細(xì)胞處于細(xì)胞分裂期，可能對化療藥物治療更有效，其原因是細(xì)胞毒性化療藥物只對進(jìn)入細(xì)胞分裂周期(G1、S、G和M期)的腫瘤細(xì)胞有效［6］。本研究結(jié)果顯示，在正常胃黏膜組織中僅有少量細(xì)胞Ki-67蛋白表達(dá)陽性，隨著胃癌病變的發(fā)展，其陽性細(xì)胞數(shù)量增多，腫瘤組織中Ki-67表達(dá)率高，提示腫瘤細(xì)胞增殖活性與癌變的浸潤進(jìn)展、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有明顯相關(guān)性。

p63是抑癌基因P53家族一員［7］。P53基因分為野生型和突變型兩種:野生型P53基因?yàn)橐职┗?，能引起?xì)胞周期阻滯、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和促進(jìn)分化;突變型P53則抑制野生型P53活性，引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化、促進(jìn)細(xì)胞癌變。p63轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物主要為TAp63和△Np63，TAp63具有抑癌作用，△Np63可能與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡、增殖及細(xì)胞遷移有關(guān)［8］。目前對p63蛋白研究較少，有研究表明p63在有增殖活性的鱗狀上皮組織中表達(dá)，細(xì)胞分化程度低組織中表達(dá)上調(diào)［9，10］。本研究結(jié)果顯示，p63蛋白在正常胃黏膜組織中表達(dá)較少，在腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，可解釋為p63蛋白功能的多樣性，與腫瘤分化程度相關(guān)，與浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無明顯關(guān)系。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)p63與Ki-67表達(dá)呈正相關(guān)。

p16蛋白是重要的細(xì)胞周期抑制因子。p16屬于抑癌基因CDKN2A家族，阻斷細(xì)胞由G期進(jìn)入S期從而抑制細(xì)胞的增殖［11］。在多數(shù)腫瘤中存在p16失活(如基因缺失或高甲基化)或基因變異，失去對細(xì)胞周期的調(diào)控作用，使細(xì)胞無控制性增殖［11］。本研究中p16蛋白在胃癌組織中表達(dá)降低與p16基因失活有關(guān)，提示p16可作為胃癌病變診斷的輔助指標(biāo)之一。

p16、P2l等基因是一類抑制細(xì)胞增殖的重要抑癌基因，在腫瘤的發(fā)生中起重要作用。目前胃癌發(fā)生是諸多基因異常表達(dá)的結(jié)果，包括基因序列改變和基因表達(dá)改變，基因表達(dá)改變可通過DNA甲基化來實(shí)現(xiàn)［12，13］。目前對這些腫瘤相關(guān)基因高甲基化的研究還很少，腫瘤相關(guān)基因高甲基化的研究可能成為今后胃癌發(fā)病研究的新熱點(diǎn)。

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收稿日期:( 2015-05-10)

通信作者:李敏才

基金項(xiàng)目:湖北省科技廳基金項(xiàng)目(2014CFB211);湖北科技學(xué)院科研項(xiàng)目(ZX13065，20130927027)。

文章編號:1002-266X(2015)33-0044-03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:B

中圖分類號:R735.2

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.33.016