董長(zhǎng)征，孔艷莉，靳洪波，張素芳，鄭杰，梁傳棟，武江，岳向勇，李文玲(河北省人民醫(yī)院，石家莊05005;石家莊市第二醫(yī)院)

伽瑪?shù)墩丈鋵?duì)青霉素致癲癇貓腦組織中MDA水平、SOD活力的影響

董長(zhǎng)征1，孔艷莉1，靳洪波2，張素芳1，鄭杰1，梁傳棟1，武江1，岳向勇1，李文玲1(1河北省人民醫(yī)院，石家莊050051;2石家莊市第二醫(yī)院)

摘要:目的探討伽瑪?shù)墩丈鋵?duì)青霉素致癲癇貓腦組織中丙二醛(MDA)水平和超氧化物歧化酶(SOD)活力的影響。方法選擇雄性成年貓30只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、癲癇模型組和伽瑪?shù)吨委?、8、12周組各6只。除正常對(duì)照組外，其余組通過向貓右額葉皮質(zhì)注射青霉素制作癲癇模型，伽瑪?shù)吨委?、8、12周組在造模成功后給予低劑量伽瑪?shù)墩丈?。采用Racine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行行為學(xué)觀察。4周后正常對(duì)照組、癲癇模型組和伽瑪?shù)吨委?周組均將貓?zhí)幩?，伽瑪?shù)吨委?、12周組于治療8、12周后分別將貓?zhí)幩?，處死后均立即取出貓右額葉腦組織，采用硫代巴比妥酸比色法檢測(cè)腦組織中MDA水平，WST-1法檢測(cè)SOD活力。結(jié)果癲癇模型組貓發(fā)作級(jí)別多達(dá)到Ⅳ～Ⅵ級(jí);伽瑪?shù)吨委?、8周組貓癲癇發(fā)作級(jí)別和持續(xù)時(shí)間與癲癇模型組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)變化;伽瑪?shù)吨委?2周組癲癇發(fā)作級(jí)別降低，多為Ⅰ～Ⅱ級(jí)。與正常對(duì)照組比較，癲癇模型組腦組織中MDA水平升高，SOD活力降低(P均＜0.05);與癲癇模型組比較，伽瑪?shù)吨委?周和8周組MDA水平及SOD活力無統(tǒng)計(jì)學(xué)變化，而伽瑪?shù)吨委?2周組MDA水平減低(P＜0.05)，SOD活力升高(P＜0.05)。結(jié)論伽瑪?shù)墩丈渲委熌芙档颓嗝顾刂掳d癇貓腦組織中MDA水平，提高SOD活力，減輕實(shí)驗(yàn)貓癲癇發(fā)作后的氧化應(yīng)激損傷。

關(guān)鍵詞:癲癇;伽瑪?shù)?氧化應(yīng)激;丙二醛;超氧化物歧化酶

自由基與癲癇的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切［1］。研究［2］發(fā)現(xiàn)，腦內(nèi)脂質(zhì)過氧化物顯著增加、氧自由基清除劑相對(duì)減少是癲癇發(fā)生、發(fā)展的重要原因。伽瑪?shù)墩丈鋵?duì)部分難治性癲癇的治療取得一定療效，為進(jìn)一步研究其抗癲癇的作用機(jī)制，我們選用青霉素致癲癇貓模型，觀察伽瑪?shù)墩丈鋵?duì)青霉素致癲癇貓腦組織丙二醛(MDA)水平、超氧化物歧化酶(SOD)活力的影響，探討伽瑪?shù)墩丈涫欠駥?duì)癲癇發(fā)作后腦損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康雄性成年貓30只，體質(zhì)量2.5～3.5 kg，河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2試劑及儀器注射用青霉素(華北制藥股份有限公司，批號(hào)13020655);異丙酚(200mg/支，北京費(fèi)森尤斯公司);伽瑪?shù)?LEKSELL C型，瑞典ELEKTA公司);磁共振儀(美國(guó)GE公司); SOD、MDA試劑盒購(gòu)自南京市建成生物工程研究所。

1.3動(dòng)物分組、造模及干預(yù)將30只貓按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組、癲癇模型組和伽瑪?shù)吨委?、8、12周組，每組各6只。正常對(duì)照組不做任何處理;癲癇模型組和伽瑪?shù)吨委熃M在貓額葉皮質(zhì)多次注射青霉素制作癲癇模型，異丙酚靜脈麻醉，貓右額頭皮做直切口，長(zhǎng)約3 cm，暴露貓右額葉皮層組織，用MS4000U-1生物信號(hào)定量記錄分析系統(tǒng)刺激器刺激腦皮質(zhì)，引起對(duì)側(cè)后肢收縮的區(qū)域定為運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)。用微量注射器抽取青霉素1萬U，以60°角斜刺入動(dòng)物右額皮質(zhì)的無血管區(qū)，縫合頭皮。青霉素每間隔3d注射1次，共注射7次。伽瑪?shù)吨委熃M在造模成功后給予伽瑪?shù)墩丈洌?%戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔注射麻醉實(shí)驗(yàn)用貓，將其頭部安裝于Leksell立體定向頭架，用磁共振儀進(jìn)行無間隔定位掃描，層厚2mm。

掃描圖像經(jīng)計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)傳至Gamma Plan系統(tǒng)制定治療計(jì)劃，確定照射靶區(qū)位于右側(cè)額葉的X、Y、Z坐標(biāo)。然后將固定貓腦的Leksell框架按所定坐標(biāo)安放于伽瑪?shù)抖ㄎ患苌?，?mm準(zhǔn)直器，對(duì)靶區(qū)腦組織實(shí)施照射，邊緣劑量15 Gy，等劑量曲線50%。

1.4行為學(xué)觀察參照Racine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)觀察各組貓的癲癇發(fā)作行為。0級(jí):無反應(yīng)或抽搐停止;Ⅰ

級(jí):節(jié)律性口角或面部抽動(dòng);Ⅱ級(jí):點(diǎn)頭或甩尾;Ⅲ級(jí):單肢抽動(dòng);Ⅳ級(jí):多肢抽動(dòng)或強(qiáng)直;Ⅴ級(jí):全面性強(qiáng)直陣攣發(fā)作。視頻監(jiān)控下觀察實(shí)驗(yàn)貓的發(fā)作級(jí)別和持續(xù)時(shí)間。

1.5腦組織中MDA水平、SOD活力測(cè)定4周后正常對(duì)照組、癲癇模型組和伽瑪?shù)吨委?周組均將貓?zhí)幩?，伽瑪?shù)吨委?、12組于治療8、12周后分別將貓?zhí)幩?，立即取出右額葉腦組織稱重，用生理鹽水作勻漿介質(zhì)，充分勻漿，離心，取上清液放入－70℃冰箱保存待用。嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行分步操作，分別采用硫代巴比妥酸比色法檢測(cè)腦組織中MDA水平，WST-1法檢測(cè)SOD活力。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SAS8.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以珋x±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1行為學(xué)變化正常對(duì)照組無癲癇發(fā)作。癲癇模型組均有癇性發(fā)作，為間斷性，發(fā)作級(jí)別達(dá)Ⅳ～Ⅵ級(jí)，全身強(qiáng)直陣攣發(fā)作多見，每次發(fā)作持續(xù)3～5min。伽瑪?shù)吨委?、8周組癲癇發(fā)作級(jí)別和持續(xù)時(shí)間與癲癇模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;伽瑪?shù)吨委?2周組癲癇發(fā)作級(jí)別減低，多為Ⅰ～Ⅱ級(jí)，表現(xiàn)為貓的面部抽搐或點(diǎn)頭動(dòng)作，發(fā)作時(shí)間為1～3min。

2.2各組貓腦組織中MDA水平、SOD活力比較伽瑪?shù)吨委熀?，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，MDA水平有減低趨勢(shì)，SOD活力有上升趨勢(shì)，伽瑪?shù)吨委?2周組MDA水平明顯降低，SOD活力明顯升高，與癲癇模型組比較，P均＜0.05，見表1。

表1　各組貓腦組織中MDA水平及SOD活力比較()

表1　各組貓腦組織中MDA水平及SOD活力比較()

注:與正常對(duì)照組比較，▲P＜0.05;與癲癇模型組比較，△P＜0.05。

組別　nmDA(nmol/mg蛋白)SOD(U/mg蛋白)正常對(duì)照組6　10.37±1.52　200.63±11.33癲癇模型組　6　31.65±1.47▲　130.72±12.24▲伽瑪?shù)吨委?周組　6　29.54±1.17　138.27±5.37伽瑪?shù)吨委?周組　6　25.04±2.36　145.38±8.27伽瑪?shù)吨委?2周組　6　19.16±2.01△　173.68±11.41△

3　討論

自由基過量產(chǎn)生引起的氧化應(yīng)激損傷參與了癲癇的發(fā)生和發(fā)展過程［3，4］。正常生理情況下，腦組織內(nèi)氧化與抗氧化系統(tǒng)處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。當(dāng)機(jī)體發(fā)生癲癇時(shí)，腦組織氧代謝障礙產(chǎn)生大量氧自由基，氧自由基可使神經(jīng)細(xì)胞膜中的多不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化反應(yīng)，且通過脂氫過氧化物的分解產(chǎn)物引起神經(jīng)細(xì)胞損傷，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、溶酶體等結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞膜對(duì)離子通透性的改變［5］，與此同時(shí)，機(jī)體內(nèi)抗氧化酶類活性減低，清除氧自由基的能力下降，腦內(nèi)氧化與抗氧化系統(tǒng)平衡失調(diào)，活性氧增加，從而導(dǎo)致腦組織氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成神經(jīng)細(xì)胞過氧化損傷，神經(jīng)細(xì)胞興奮性增加，癲癇發(fā)作進(jìn)一步加重，使氧自由基平衡系統(tǒng)進(jìn)一步被破壞，氧自由基繼續(xù)增多，神經(jīng)細(xì)胞的損傷繼續(xù)加重，形成惡性循環(huán)。

MDA是體內(nèi)生物膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的中間產(chǎn)物，其對(duì)機(jī)體的損害作用主要使不飽和脂肪酸過氧化，進(jìn)而造成細(xì)胞膜的持續(xù)損害，因此其含量反映了腦內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度，間接反映了氧自由基對(duì)神經(jīng)細(xì)胞損傷的程度［6］。

SOD是機(jī)體內(nèi)防御生命活動(dòng)中氧自由基破壞損傷的抗氧化酶，為機(jī)體直接清除自由基的重要酶類，其主要功能是將氧的單價(jià)還原物超氧陰離子自由基歧化成H2O2和O2，能減輕缺血缺氧導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷，阻斷氧自由基對(duì)機(jī)體的進(jìn)一步損傷。其活力高低間接反映了機(jī)體清除氧自由基的能力［7］。

青霉素是腦內(nèi)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA的A受體拮抗劑，常被用來建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的癲癇模型。前期研究中，我們應(yīng)用青霉素反復(fù)多次腦額葉皮質(zhì)注射成功建立了貓的慢性癲癇模型，適于伽瑪?shù)吨委煱d癇的模型研究［8］。本研究結(jié)果顯示，低劑量伽瑪?shù)墩丈?2周后抑制了青霉素誘導(dǎo)貓的癲癇發(fā)作，對(duì)控制和預(yù)防癲癇的發(fā)作有一定作用，與我們既往結(jié)果大致相同。本研究結(jié)果還顯示，與正常對(duì)照組比較，癲癇模型組MDA水平升高，而SOD活力較正常對(duì)照組明顯降低，說明癲癇反復(fù)發(fā)作后腦組織內(nèi)氧化和抗氧化系統(tǒng)平衡被打亂，產(chǎn)生過量的氧自由基，SOD過量耗損而明顯減少，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷，興奮性增高，異常放電增加，癲癇發(fā)作進(jìn)一步發(fā)展。蔡紅衛(wèi)等［9］研究認(rèn)為大鼠腹腔注射戊四氮誘發(fā)抽搐發(fā)作后大鼠海馬組織中MDA水平明顯升高，SOD含量明顯減少。劉鳳英等［10］研究表明，成人癲癇存在SOD的代謝紊亂，下降的SOD可能通過損傷線粒體，增加腦內(nèi)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的合成，促進(jìn)神經(jīng)元凋亡，進(jìn)而參與成人癲癇的病理生理過程。以上研究與本研究結(jié)果相一致。與癲癇模型組比較，伽瑪?shù)墩丈?2周組中MDA水平明顯降低，SOD活力明顯升高，貓的癲癇發(fā)作級(jí)別減低;伽瑪?shù)墩丈?、8周組MDA水平和SOD活力雖有變化，但變化不明顯，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明伽瑪?shù)墩丈渲委煱d癇需一定時(shí)間后才能顯現(xiàn)效果;伽瑪?shù)墩丈淇山档桶d癇腦組織中MDA水平，提高SOD活力，從而降低腦內(nèi)氧自由基含量，重建氧化和抗氧化系統(tǒng)的平衡，進(jìn)而

實(shí)現(xiàn)神經(jīng)保護(hù)作用，抑制貓的癲癇發(fā)作。

總之，伽瑪?shù)吨委煱d癇的機(jī)制尚不十分清楚，可能與伽瑪?shù)墩丈浣档椭掳B灶內(nèi)谷氨酸的水平［11］、抑制神經(jīng)元的凋亡及相關(guān)凋亡基因的表達(dá)［12］等有關(guān)。本研究提示，抑制氧自由基引起的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，增加自由基的清除可能參與了伽瑪?shù)吨委煱d癇的生理機(jī)制，為進(jìn)一步伽瑪?shù)吨委煱d癇提供了充分的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

參考文獻(xiàn):

［1］王飛鳳，溫玉梅，孫俊巖，等.尼莫地平輔助治療難治性癲癇對(duì)血自由基水平的影響［J］.貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，38(2): 171-172.

［2］Rowley S，Patelm.Mitochondrial involvement and oxidative stress in temporal lobe epilepsy［J］.Free Radic Biolmed，2013，62(9): 121-131.

［3］孫錫波，韓玉香，韓濤，等.二氮嗪對(duì)氯化鋰-匹魯卡品致癇大鼠海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)及自由基的影響［J］.山東大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2011，49(2): 19-23.

［4］段曉秋，王浩.癲癇過程中腦組織自由基的變化與細(xì)胞損傷關(guān)系的研究［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2012，21(18): 1961-1962.

［5］Shin EJ，Jeong JH，Chung YH，et al.Role of oxidative stress in epileptic seizures［J］.Neurochem Int，2011，59(2): 122-137.

［6］Bajpai A，Verma AK，Srivastavam，et al.Oxidative stress andmajordepression［J］.J Clindiagn Res，2014，8(12): 4-7.

［7］張笑天，鄭曉瑛.氧化自由基清除劑超氧化物歧化酶與疾病［J］.中國(guó)公共衛(wèi)生，2014，30(10): 1349-1352.

［8］董長(zhǎng)征，李文玲，董秀芳，等.適合伽瑪?shù)墩丈涞呢埞δ軈^(qū)慢性點(diǎn)燃癲癇模型制作及其致癇機(jī)制［J］.中國(guó)老年學(xué)雜志，2013，33(20): 5063-5065.

［9］蔡紅衛(wèi)，馮娟娟.三氟拉嗪對(duì)癲癇大鼠NO、NOS、SOD、MDA的影響［J］.世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2010，5(7): 585-587.

［10］劉鳳英，蔡學(xué)坤，張琪，等.成人癲癇患者血清超氧化物歧化酶的水平變化及意義［J］.山東醫(yī)藥，2013，53(12): 12-14.

［11］董長(zhǎng)征，岳向勇，趙文清，等.低劑量伽瑪?shù)墩丈鋵?duì)功能區(qū)癲癇貓模型的治療作用及機(jī)制研究［J］.中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2011，14(4B): 1219-1221.

［12］董長(zhǎng)征，李文玲，趙文清，等.低劑量伽瑪?shù)墩丈渲委煂?duì)功能區(qū)癲癇動(dòng)物行為及其皮層神經(jīng)元顯微結(jié)構(gòu)的影響［J］.山東醫(yī)藥，2011，51(2): 24-25.

收稿日期:( 2015-04-08)

基金項(xiàng)目:河北省衛(wèi)生廳指令性計(jì)劃項(xiàng)目(20120009)。

文章編號(hào):1002-266X(2015)33-0025-03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號(hào):R742.1

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.33.008