通訊作用：馮中，男，工程師，研究方向：新藥開發(fā)和研究，Tel:0539-5030526,E-mail:fengzhong22@163.com

HPLC法測定注射用阿扎胞苷的含量

聶德平，鄭玉麗，馮中

(魯南制藥集團股份有限公司，山東 臨沂 276000)

摘要：目的建立測定阿扎胞苷含量的高效液相色譜方法。方法采用Welch Ultimate XB-C18(4.6 mm×250 mm，3 μm)色譜柱，以0.02 mol·L-1磷酸氫二鉀溶液(以磷酸溶液調(diào)pH至6.5)-甲醇(90∶10)為流動相，檢測波長為243 nm，柱溫為(15±2)℃。結(jié)果阿扎胞苷濃度在8.16～30.6 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性良好(r=0.999 9)，平均回收率為98.97%，RSD為0.73%。結(jié)論本方法專屬性強、準(zhǔn)確度高，可用于阿扎胞苷的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法；注射用阿扎胞苷；含量

作者簡介：聶德平，男，研究方向：新藥開發(fā)和研究，E-mail:niedeping@163.com

中圖分類號：R927.2文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Determination of Azacitidine for Injection by HPLC

NIEDe-ping,ZHENGYu-li,FENGZhong

(LunanPharmaceuticalCo.,Ltd.,Linyi276000,China)

Abstract：ObjectiveTo establish an HPLC method for the determination of Azacitidine.MethodsWelch Ultimate XB-C18 column (4.6 mm×250 mm,3 μm)was used.The mobile phase consisted of 0.02 mol·L-1 dipotassium hydrogen phosphate solution(adjust pH to 6.5 by phosphoric acid)-methanol (90∶10).The detection wavelength was 243 nm and the column temperature was(15±2)℃.ResultsThe calibration curve was linear in the range of 8.16～30.6 μg·mL-1(r=0.999 9).The average recoveries was 98.97% with corresponding RSD of 0.73%.ConclusionThe method had strong specialization and high accuracy,and can be used for the quality control of azacitidine.

Key words:HPLC;Azacitidine for Injection;Determination

骨髓增生異常綜合征(MDS)是一組以造血干細(xì)胞克隆性異常為特征的疾病，會導(dǎo)致造血功能衰竭，并有進(jìn)展為急性髓細(xì)胞樣白血病(AML)的高危險性。阿扎胞苷是美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)的第一個DNA脫甲基化的嘧啶類抗代謝藥物，也是治療骨髓增生異常綜合征(MDS)的第一個有效藥物，它通過恢復(fù)骨髓細(xì)胞的正常生長和分化而發(fā)揮作用[1～6]。

目前尚無文獻(xiàn)報道阿扎胞苷含量測定的方法，按照《中國藥典》2010年版[7]要求，首次建立了測定注射用阿扎胞苷含量的高效液相色譜(HPLC)法，結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確可靠，靈敏度高，可用于測定注射用阿扎胞苷的含量。

1儀器與試藥

高效液相色譜儀(Agilent 1200)；十萬分之一電子天平(Mettler Toledo XS205);阿扎胞苷對照品(標(biāo)定純度98.8%，批號:130501)和注射用阿扎胞苷(批號:130901、130902、130903)均由山東新時代藥業(yè)有限公司提供；磷酸氫二鉀為分析純，甲醇為色譜純，水為超純水。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件用Welch Ultimate XB-C18(4.6 mm×250 mm，3 μm)為填充劑，以0.02 mol·L-1的磷酸氫二鉀溶液(用磷酸調(diào)pH值至6.5)-甲醇(90∶10)為流動相，柱溫為(15±2)℃。檢測波長為243 nm。理論塔板數(shù)按阿扎胞苷峰計算應(yīng)不低于3 500，阿扎胞苷與相鄰雜質(zhì)峰的分離度應(yīng)不小于2.0。

2.2溶液制備取本品適量，精密稱定，加流動相溶解并稀釋成每1 mL中含阿扎胞苷0.02 mg的溶液，作為供試品溶液；取阿扎胞苷對照品適量，精密稱定，同法制備作為對照品溶液；另取注射用阿扎胞苷空白輔料適量，同法配制作為陰性空白溶液。

2.3陰性試驗按照上述色譜條件，分別取對照品溶液、供試品溶液和陰性空白溶液各20 μL注入高效液相色譜儀，并記錄色譜圖，HPLC圖譜見圖1。實驗結(jié)果表明：按阿扎胞苷峰計算理論板數(shù)為5 210；空白輔料和其他雜質(zhì)對本品的含量測定未見干擾，說明本法專屬性較好。

圖1　供試品溶液HPLC色譜圖

2.4線性與范圍試驗精密稱取阿扎胞苷對照品100.2 mg，置于50 mL的容量瓶中，加流動相使溶解并定容至刻度，搖勻后作為對照品母液；精密量取上述儲備液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5 mL，分別置于100 mL的量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，精密量取20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以濃度C(μg·mL-1)對主峰峰面積A進(jìn)行線性回歸，得線性方程為：A=8.231C+0.214 2(r=0.999 9)。結(jié)果表明阿扎胞苷含量在8.16～30.6 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5精密度試驗分別精密量取線性與范圍試驗項下的對照品儲備液0.8、1.0和1.2 mL，各置于100 mL容量瓶中，用流動相稀釋制成濃度分別為16.32(80%)、20.40(100%)和24.48 μg·mL-1(120%)的溶液，各3份，以峰面積計算精密度RSD分別為0.56%、0.49%、0.51%。

2.6回收率試驗精密稱取阿扎胞苷對照品8.14、10.02、12.28 mg和空白輔料各3份，分別置于500 mL容量瓶中，加流動相溶解并定容至刻度，搖勻后作為供試品溶液。精密稱取阿扎胞苷對照品適量，加流動相制成每1 mL中約含阿扎胞苷0.02 mg的溶液，作為對照品溶液；取上述兩種溶液，依法測定，按外標(biāo)法以峰面積計算回收率，平均回收率為98.97%，RSD為0.73%(n=9)。

2.7樣品測定取注射用阿扎胞苷3批樣品(批號:130901、130902、130903)，依法測定，含量分別為99.63%、99.48%和99.91%。

3討論

大量的研究已經(jīng)證明去甲基化藥物的應(yīng)用在惡性腫瘤治療方面具有良好的應(yīng)用前景,對于老年人和無法耐受常規(guī)化療或失去移植時機的MDS/AML患者，阿扎胞苷可作為一種低毒而有效的治療選擇[5,6]。

阿扎胞苷中含有酰胺鍵[8]，在水中快速降解，故本品含量測定用樣品應(yīng)臨用新配。在工業(yè)化生產(chǎn)過程中，應(yīng)縮短生產(chǎn)時間，并控制生產(chǎn)環(huán)境在較低的溫度，延緩水解的產(chǎn)生。本文建立了檢測注射用阿扎胞苷含量的方法，該方法專屬性強，精密度良好，準(zhǔn)確度高，可用于工業(yè)化生產(chǎn)中注射用阿扎胞苷含量測定的過程控制。

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