韋曉勇，王　毅，閔紅星，陸　波，李　軍

七氟醚對(duì)老齡大鼠海馬CA3區(qū)突觸結(jié)構(gòu)的影響

韋曉勇1，王毅2a，閔紅星2a*，陸波2b，李軍2b

[摘要]目的觀(guān)察七氟醚對(duì)老齡大鼠海馬CA3區(qū)突觸結(jié)構(gòu)的影響。方法健康SD大鼠60只，18月齡，隨機(jī)分為4組：空白對(duì)照組(C組)、3%七氟醚組(S1組)、1.5%七氟醚組(S2組)、3%異氟醚組(I組)，每組15只。于麻醉結(jié)束后1、3、7 d (T1~T3)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，并測(cè)定海馬CA3區(qū)突觸結(jié)構(gòu)各指標(biāo)。結(jié)果與C組比較，I組T1~T3、S1組T1~T2時(shí)逃避潛伏期延長(zhǎng)，穿越原平臺(tái)象限次數(shù)減少，I組、S1組T1~T3海馬CA3區(qū)突觸間隙增寬，PSD厚度變薄，突觸活性區(qū)長(zhǎng)度縮短，突觸界面曲率減小(P<0.05)；與I組、S1組比較，S2組T1~T2時(shí)逃避潛伏期縮短，T1~T3海馬CA3區(qū)突觸間隙變窄，PSD厚度增厚，突觸活性區(qū)長(zhǎng)度延長(zhǎng)，突觸界面曲率增大(P<0.05)；與I組比較，S1組、S2組T3時(shí)逃避潛伏期縮短，穿越原平臺(tái)象限次數(shù)增加(P<0.05)；與S1組比較，I組T3時(shí)逃避潛伏期延長(zhǎng)，穿越原平臺(tái)象限次數(shù)減少(P<0.05)；與T1比較，I組、S1組、S2組T2~T3時(shí)逃避潛伏期縮短(P<0.05)。結(jié)論低濃度七氟醚對(duì)老齡大鼠認(rèn)知功能無(wú)明顯影響，高濃度七氟醚、異氟醚均可導(dǎo)致老齡大鼠認(rèn)知功能減退，其機(jī)制可能與抑制海馬CA3區(qū)突觸結(jié)構(gòu)的改變有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]七氟醚；認(rèn)知障礙；海馬；突觸；異氟醚

[Abstract]Objective To observe the effects of sevoflurane on the synaptic interface structure in hippocampal CA3 area in senile rats. MethodsSixty healthy SD rats aged 18 months were randomly divided into 4 groups: blank control group(group C,n=15),3% sevoflurance group (group S1,n=15),1.5% sevoflurance group (group S2,n=15),3% isoflurane group (group I,n=15). The Morris water maze test was performed at the 1st,3rd and 7th day (T1~T3) after anesthesia,and the synaptic structure in hippocampal CA3 area was measured.ResultsCompared with group C,the escape latency was longer,the frequency of crossing the original platform was reduced at T1~T3in group I and at T1~T2in group S1,the width of synaptic cleft increased,the thickness of the postsynaptic density decreased,the length of active zones was shortened,and the curvature of the synaptic interface decreased at T1~T3in group I and group S1(P<0.05);Compared with group I and group S1,the escape latency was shortened at T1~T2in group S2,the width of synaptic cleft decreased,the thickness of the postsynaptic density increased,the length of active zones was prolonged,and the curvature of the synaptic interface was increased at T1~T3in group S2(P<0.05);Compared with group I,the escape latency was shortened,the frequency of crossing the original platform increased at T3in group S1and group S2(P<0.05);Compared with group S1,the escape latency was longer,the frequency of crossing the original platform was reduced at T3in group I (P<0.05);Compared with T1,the escape latency was shortened at T2~T3in group I,group S1and group S2(P<0.05).ConclusionSevoflurane of low concentration has no obvious effect on cognitive function in senile rats. Both sevoflurane and isoflurane of high concentration can induce the cognitive hypofunction in senile rats,and the mechanism may be associated with the inhibition of the changes of synaptic structure in hippocampal CA3 area.

收稿日期：2015-02-10

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金(81102885)

通信作者*

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201510002

Effects of sevoflurane on the synaptic interface structure in hippocampal CA3 area in senile ratsWEI Xiao-yong1,WANG Yi2a,MIN Hong-xing2a*,LU Bo2b,LI Jun2b(1.Ningxia Medical University,Yinchuan 750004,China;2.a.Department of Anesthesiology,b.Department of Preventive Care,General Hospital of Ningxia Medical University,Yinchuan 750004,China)

Key words：Sevoflurane;Cognition disorders;Hippocampus;Synapses;Isoflurane

0引言

術(shù)后認(rèn)知功能障礙(POCD)是老年患者術(shù)后常見(jiàn)的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，臨床表現(xiàn)為以記憶下降為主的認(rèn)知功能減退[1]。大量研究表明，七氟醚麻醉可引起老年大鼠空間認(rèn)知功能障礙[2-3]。前期研究結(jié)果表明，高濃度七氟醚可引起老齡大鼠早期空間學(xué)習(xí)和記憶能力一過(guò)性下降，但未闡明機(jī)制[4]。突觸是神經(jīng)元之間傳遞信息的重要結(jié)構(gòu)，海馬不同區(qū)域的功能不盡相同，其中CA3區(qū)在學(xué)習(xí)記憶中起重要作用[5]。因此，本研究擬通過(guò)觀(guān)察七氟醚對(duì)老齡大鼠海馬CA3區(qū)突觸結(jié)構(gòu)的影響，探討七氟醚導(dǎo)致認(rèn)知功能減退的可能機(jī)制。

1材料與方法

1.1動(dòng)物選擇及分組健康雄性SD大鼠60只(由寧夏醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，清潔級(jí)，合格證號(hào)：SCXK(寧)2011-0001)，18個(gè)月齡，體重450~500 g，隨機(jī)分為4組：空白對(duì)照組(C組)、3%七氟醚組(S1組)、1.5%七氟醚組(S2組)、3%異氟醚組(I組)，每組15只。

1.2主要藥品及儀器七氟醚(魯南貝特制藥有限公司，批號(hào)：65130101)，異氟醚(魯南貝特制藥有限公司，批號(hào)：110408)，Morris水迷宮視頻跟蹤系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)，麻醉氣體監(jiān)測(cè)儀(Drager infinity kappa，德國(guó))，麻醉機(jī)(Drager，SA2-C型，德國(guó))，H-7500型透射電鏡(Hitachi公司，日本)，生物安全柜[力康HealForce，A2型，力新儀器(上海)有限公司]。

1.3麻醉方法自制透明麻醉箱，為透明玻璃材質(zhì)，體積為40 cm×30 cm×25 cm，麻醉箱30 cm×25 cm的兩側(cè)壁中線(xiàn)距上下頂?shù)? cm處各有一孔，一孔接麻醉機(jī)，另一孔連接麻醉氣體監(jiān)測(cè)儀，麻醉時(shí)在箱底部鋪設(shè)一薄層鈉石灰，吸收二氧化碳，防止麻醉過(guò)程箱內(nèi)二氧化碳蓄積影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并在鈉石灰上平鋪一層醫(yī)用紗布，防止大鼠吸入鈉石灰粉塵和灼傷四肢皮膚。每組隨機(jī)取6只大鼠進(jìn)行Morris水迷宮適應(yīng)性訓(xùn)練3 d，之后將其與每組剩余的大鼠分別置于自制的循環(huán)密閉麻醉箱中，并把麻醉箱放于生物安全柜中，以便收集廢氣，麻醉箱連接于麻醉呼吸機(jī)螺紋管回路中，麻醉呼吸機(jī)工作狀態(tài)為手控模式，調(diào)節(jié)排氣閥至最小壓力，調(diào)節(jié)七氟醚揮發(fā)罐輸出濃度為3%行麻醉誘導(dǎo)，吸入氧濃度40%，麻醉機(jī)輸出氣體總流量2 L/min,接氣體監(jiān)測(cè)儀監(jiān)測(cè)麻醉箱內(nèi)氧氣、二氧化碳、七氟醚的濃度。待大鼠翻正反射消失后，S2組調(diào)節(jié)七氟醚揮發(fā)罐使箱內(nèi)七氟醚濃度達(dá)1.5%，吸入2 h，觀(guān)察大鼠皮膚顏色，監(jiān)測(cè)呼吸頻率、心率和脈搏血氧飽和度，之后將大鼠置于氧濃度約為40%的環(huán)境中任其自然蘇醒，之后回籠飼養(yǎng)，自由取食。S1組、I組方法同上，分別調(diào)節(jié)七氟醚、異氟醚揮發(fā)罐，維持箱內(nèi)七氟醚、異氟醚濃度均為3%，吸入2 h。C組只吸入含有40%氧氣的空氧混合氣體2 h。維持麻醉箱溫度(25±1)℃。

1.4行為學(xué)測(cè)試于麻醉結(jié)束后1、3、7 d (T1~T3) 3個(gè)時(shí)段，將每組適應(yīng)性訓(xùn)練后的6只大鼠分別行Morris水迷宮測(cè)試，具體過(guò)程參照文獻(xiàn)[4]，記錄大鼠尋找并爬上平臺(tái)所需時(shí)間(逃避潛伏期)，如果在120 s內(nèi)未到達(dá)平臺(tái)，則由實(shí)驗(yàn)者將其引至平臺(tái)，逃避潛伏期記為120 s，每次訓(xùn)練間隔1 min。取大鼠4次逃避潛伏期的平均值，作為其該日的學(xué)習(xí)成績(jī)，即逃避潛伏期(s)。定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后撤除平臺(tái)，將大鼠于原平臺(tái)象限池壁中點(diǎn)背向池壁放入水中，記錄120 s內(nèi)穿越原平臺(tái)象限的次數(shù)。

1.5電鏡觀(guān)察于上述3個(gè)時(shí)段每組隨機(jī)取3只大鼠，10%水合氯醛(0.4 mL/100 mg)腹腔注射麻醉下，待大鼠翻正反射消失后，開(kāi)胸，暴露心臟，經(jīng)升主動(dòng)脈依次灌注4%多聚甲醛和生理鹽水，灌注結(jié)束后快速斷頭取腦，并在冰盤(pán)上分離海馬組織，置于2.5%戊二醛中固定，4 ℃過(guò)夜。參照邊緣系統(tǒng)解剖圖譜切取左側(cè)海馬CA3區(qū)1 mm×1 mm×1 mm組織塊，l%鋨酸固定l h，常規(guī)乙醇、丙酮脫水、透明，Epon 812包埋，制備厚度約70 nm超薄切片，醋酸鈾-檸檬酸鉛雙重染色。采用H-7500型透射電鏡(Hitachi公司，日本)下進(jìn)行觀(guān)察，取40 000倍放大倍數(shù)，每張切片隨機(jī)選5個(gè)視野，采用多點(diǎn)平均法測(cè)量突觸間隙寬度，參照文獻(xiàn)[6]介紹的方法，測(cè)量突觸后膜致密物(PSD)厚度、突觸活性區(qū)長(zhǎng)度及突觸界面曲率(突觸界面弧長(zhǎng)與弦長(zhǎng)之比)。

2結(jié)果

與C組比較，I組T1~T3、S1組T1~T2時(shí)逃避潛伏期延長(zhǎng)，穿越原平臺(tái)象限次數(shù)減少(P<0.05)；與I組比較，S2組T1~T3、S1組T3時(shí)逃避潛伏期縮短，穿越原平臺(tái)象限次數(shù)增加(P<0.05)；與S1組比較，S2組T1~T2時(shí)逃避潛伏期縮短，I組T3時(shí)逃避潛伏期延長(zhǎng)，穿越原平臺(tái)象限次數(shù)減少(P<0.05)；與T1比較，I組、S1組、S2組T2~T3時(shí)逃避潛伏期縮短(P<0.05)，見(jiàn)表1。

與C組比較，I組、S1組T1~T3海馬CA3區(qū)突觸間隙增寬，PSD厚度變薄，突觸活性區(qū)長(zhǎng)度縮短，突觸界面曲率減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；S2組與C組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與I組、S1組比較，S2組T1~T3海馬CA3區(qū)突觸間隙變窄，PSD厚度增厚，突觸活性區(qū)長(zhǎng)度延長(zhǎng)，突觸界面曲率增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；I組與S1組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表1　四組大鼠各時(shí)段逃避潛伏期和穿越平臺(tái)次數(shù)比較

注：*與C組比較，P<0.05；#與I組比較，P<0.05；&與S1組比較，P<0.05；△與T2比較，P<0.05

表2　四組大鼠各時(shí)段海馬CA3區(qū)突觸結(jié)構(gòu)參數(shù)的比較

注：*與C組比較，P<0.05；#與I組比較，P<0.05；&與S1組比較，P<0.05

3討論

Morris水迷宮是用于評(píng)估嚙齒類(lèi)動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶功能的重要工具，已成為一種研究空間學(xué)習(xí)和記憶機(jī)制的標(biāo)準(zhǔn)工具[7]。前期研究發(fā)現(xiàn)，七氟醚和異氟醚對(duì)老齡大鼠的學(xué)習(xí)和記憶均有影響，且異氟醚較七氟醚對(duì)學(xué)習(xí)和記憶的影響恢復(fù)慢[4]。吸入麻醉藥對(duì)老年大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能影響的發(fā)病機(jī)制尚無(wú)定論[8]。研究表明，海馬區(qū)域是重要的學(xué)習(xí)與記憶的存儲(chǔ)結(jié)構(gòu)[9-10]，特別是CA3區(qū)與年齡相關(guān)性認(rèn)知功能損害有關(guān)[11]，突觸是神經(jīng)元之間進(jìn)行信息交流的關(guān)鍵部位[12]，其可塑性是突觸發(fā)育及神經(jīng)通路重塑的先決條件，是學(xué)習(xí)和記憶的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)[13]。因此，本研究采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)觀(guān)察吸入麻醉藥七氟醚及異氟醚對(duì)老齡大鼠認(rèn)知功能障礙的影響，并通過(guò)電鏡測(cè)定海馬CA3區(qū)突觸結(jié)構(gòu)各參數(shù)的變化，以探討其可能的相關(guān)機(jī)制。本研究以逃避潛伏期測(cè)量大鼠的學(xué)習(xí)能力，以穿越原平臺(tái)象限次數(shù)測(cè)量大鼠的記憶能力。結(jié)果顯示，與C組比較，S1組、I組逃避潛伏期延長(zhǎng)，穿越原平臺(tái)象限次數(shù)減少，S2組各指標(biāo)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與I組、S1組比較，S2組逃避潛伏期縮短，穿越原平臺(tái)象限次數(shù)增加，由此提示，低濃度七氟醚對(duì)老齡大鼠認(rèn)知功能無(wú)明顯影響，高濃度七氟醚、異氟醚均可導(dǎo)致老齡大鼠認(rèn)知功能減退。

突觸是神經(jīng)元與神經(jīng)元之間以及神經(jīng)元與效應(yīng)細(xì)胞之間相互聯(lián)系和信息傳遞的結(jié)構(gòu)，是神經(jīng)系統(tǒng)可塑性變化最敏感的部位[1,6]，其功能及結(jié)構(gòu)完整性對(duì)維持大腦功能的正常至關(guān)重要。突觸前膜和突觸后膜之間的狹窄間隙稱(chēng)為突觸間隙，其內(nèi)含有包含物、微絲、突觸間絲及特異性S-100蛋白質(zhì)等。有報(bào)道，突觸間隙增寬，影響間隙內(nèi)某些包含物的合成及其與遞質(zhì)間的結(jié)合，并且影響S-100蛋白質(zhì)與鈣離子的接觸，導(dǎo)致神經(jīng)沖動(dòng)傳導(dǎo)受阻，學(xué)習(xí)記憶能力下降[14]。PSD是位于突觸活性區(qū)突觸后膜下方與胞質(zhì)相連的一層致密物質(zhì)，由細(xì)胞骨架蛋白與調(diào)節(jié)蛋白組成，其含有多種蛋白質(zhì)、酶及離子通道，這些物質(zhì)構(gòu)象或數(shù)量的變化均可引起PSD 超微結(jié)構(gòu)的變化，即厚度的改變，其厚度與神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能和學(xué)習(xí)記憶的保持能力密切相關(guān)[15]。突觸前膜與聚集成簇的突觸小泡相接觸形成突觸活性區(qū)，其長(zhǎng)度反映神經(jīng)遞質(zhì)釋放的有效面積，且PSD厚度變化影響突觸可塑性[12]，進(jìn)而影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的信息傳導(dǎo)。突觸界面曲率為活性區(qū)弧長(zhǎng)與其相對(duì)應(yīng)弦長(zhǎng)之比，是突觸可塑性的潛在性特征，其增大可加大突觸間的接觸面，提高神經(jīng)信息傳遞的有效性。

本研究結(jié)果表明，與C組比較，Ⅰ組、S1組T1~T3海馬CA3區(qū)突觸間隙增寬，PSD厚度變薄，突觸活性區(qū)長(zhǎng)度縮短，突觸界面曲率減小，S2組與C組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示高濃度七氟醚、異氟醚均可引起老齡大鼠海馬CA3區(qū)突觸結(jié)構(gòu)的損傷。研究發(fā)現(xiàn)，異氟醚主要對(duì)PSD和突觸間隙寬度產(chǎn)生影響[14]，七氟醚可引起大鼠海馬內(nèi)PSD蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)，造成長(zhǎng)期的空間學(xué)習(xí)和記憶損害[16]。因此，推測(cè)高濃度七氟醚、異氟醚導(dǎo)致老齡大鼠認(rèn)知功能減退，其機(jī)制可能與抑制海馬CA3區(qū)突觸結(jié)構(gòu)的改變有關(guān)。

綜上所述，低濃度七氟醚對(duì)老齡大鼠認(rèn)知功能無(wú)明顯影響，高濃度七氟醚、異氟醚均可導(dǎo)致老齡大鼠認(rèn)知功能減退，其機(jī)制可能與抑制海馬CA3區(qū)突觸結(jié)構(gòu)的改變有關(guān)。

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作者單位：1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，南京 210029；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京 210023