陳　穎，劉竹影，周福興，楊　倩，李　驊，孫紀(jì)元，王四旺*

(1.第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院天然藥物學(xué)教研室，西安　710032；2.第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院正畸科，西安　710032；3.第四軍醫(yī)大學(xué)附屬西京醫(yī)院婦產(chǎn)科，西安　710032)

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雙丹口服液對(duì)大鼠糖尿病腎病的作用研究

陳穎1，劉竹影2，周福興3，楊倩1，李驊1，孫紀(jì)元1，王四旺1*

(1.第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院天然藥物學(xué)教研室，西安710032；2.第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院正畸科，西安710032；3.第四軍醫(yī)大學(xué)附屬西京醫(yī)院婦產(chǎn)科，西安710032)

摘要：目的探討雙丹口服液(SDO)對(duì)大鼠糖尿病腎病(DN)的治療效果及其作用機(jī)制。方法采用高脂高糖飼料加30 mg·kg-1鏈脲佐菌素誘導(dǎo)大鼠DN模型，隨機(jī)分為治療組、陽性對(duì)照組、模型組和正常對(duì)照組。治療組分別灌胃(ig)10.0，5.0和2.5 mL·kg-1SDO高劑量組，皮下注射10 μ·kg-1胰島素組(陽性對(duì)照)，模型組和正常組分別ig 5.0 mL·kg-1生理鹽水，各組給藥2次/d，連續(xù)給藥8周后檢測大鼠空腹血糖(FBG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、24 h尿量、血肌酐、尿素氮和血脂等生化值，測定T-SOD、T-AOC、MDA和NO等氧化應(yīng)激指標(biāo)，血液流變儀測定全血黏度，光鏡下觀察腎臟組織病理學(xué)改變。結(jié)果SDO各給藥組大鼠24 h尿量、血肌酐、尿素氮、血總膽固醇、三酰甘油和低密度脂蛋白的含量明顯較模型組降低，高密度脂蛋白含量升高，血黏度降低(P<0.05或P<0.01)；SDO各劑量組大鼠血T-SOD、T-AOC活力明顯升高，MDA、NO含量降低(P<0.05或P<0.01)；SDO各給藥組對(duì)血糖及糖化血紅蛋白無影響(P>0.05)；SDO各給藥組對(duì)大鼠的全血黏度和腎組織損傷均有所改善。結(jié)論首次證實(shí)SDO對(duì)大鼠DN具有顯著治療作用，其機(jī)制與改善血脂代謝紊亂、促進(jìn)抗氧化應(yīng)激能力有關(guān)。

關(guān)鍵詞：雙丹口服液；DN模型；氧化應(yīng)激

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)[1]是在糖尿病(diabetes mellitus，DM)病程中出現(xiàn)的以高血壓、水腫、蛋白尿及腎功能不全等腎臟病變?yōu)樘卣鞯募膊。荄M常見的嚴(yán)重微血管并發(fā)癥之一；DN是多因素共同作用的結(jié)果，其中自由基的作用極為重要，患DM時(shí)體內(nèi)自由基生成增多造成氧化損傷，自由基可能還參與了DM早期腎小球血流動(dòng)力學(xué)的變化過程，脂質(zhì)過氧化物可直接損傷基底膜和內(nèi)皮細(xì)胞膜，導(dǎo)致腎功能障礙[2]。DM長期高血糖可致內(nèi)皮細(xì)胞功能異常，導(dǎo)致大血管和微血管的病變，是DM各種并發(fā)癥的重要的病理基礎(chǔ)[3]。因此，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞是防治DM并發(fā)癥的關(guān)鍵。雙丹口服液(SDO)主要活性成分為丹參素和丹皮酚等[4-6]，丹參素對(duì)DN的作用機(jī)制可能為：清除組織中的氧自由基，保護(hù)腎血管內(nèi)皮細(xì)胞[7]；抑制血小板聚集，降低血液黏度，顯著改善微循環(huán)；能夠抑制細(xì)胞內(nèi)源性膽固醇合成及抑制脂質(zhì)過氧化[8]。同時(shí)丹皮酚能降低模型動(dòng)物血清中總膽固醇(TC)和低密度脂蛋白(LDL)水平[9]，具有改善血液流變學(xué)、降低脂質(zhì)、抑制脂質(zhì)過氧化等作用[10]。由此可見，SDO中主要成分的藥理作用恰好與DN微血管病變機(jī)制相一致，但SDO對(duì)DN是否有效，其機(jī)制又如何，基于該疑問，我們首次設(shè)計(jì)和研究了SDO對(duì)DN大鼠的作用，并探討SDO治療早期DN的作用機(jī)制。

1儀器與材料

1.1儀器獨(dú)立通風(fēng)動(dòng)物飼養(yǎng)系統(tǒng)(IVC，北京金業(yè)德祥科技有限公司)；半自動(dòng)生化儀(雷杜RT-9600，美國)；光學(xué)顯微鏡(奧林巴斯IX3，日本)；全自動(dòng)血液黏度儀(LG-R-80A，北京中勤世帝科學(xué)儀器有限公司)；電子天平(賽多利斯，德國)；尿液分析儀及配套試紙(優(yōu)利特尿液分析儀-180，中國)；血糖儀及配套試紙(羅氏卓越型，德國)；冷凍離心機(jī)(艾本德5418-R，德國)；恒溫水浴鍋(西安禾普生物科技有限公司)。

1.2試藥SDO(10 mL/支，國藥準(zhǔn)字號(hào)Z20093086；批號(hào)130323，北京九龍制藥有限公司)；注射用胰島素(國藥準(zhǔn)字H20043335；批號(hào)20140102，江蘇萬邦生化醫(yī)藥有限公司)；鏈脲佐菌素(STZ，SIGMA，產(chǎn)品批號(hào)20140314)。

1.3動(dòng)物健康雄性SD大鼠70只，體質(zhì)量220±20 g，購于陜西西安第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK-(軍)2012-0007。

1.4實(shí)驗(yàn)用試劑盒肌酐試劑盒(批號(hào)2014058)，尿素氮試劑盒(批號(hào)2014009)，三酰甘油試劑盒(批號(hào)2014031)，總膽固醇試劑盒(批號(hào)2014036)，高密度脂蛋白試劑盒(批號(hào)2014040)，低密度脂蛋白試劑盒(批號(hào)2014043)，均購自長春匯力生物有限公司；糖化血紅蛋白(批號(hào)20141013)，T-AOC試劑盒(批號(hào)20141007)，T-SOD試劑盒(批號(hào)20141018)，NO試劑盒(批號(hào)20141024)及MDA試劑盒(批號(hào)20141008)，均購于南京建成生物工程研究所。

2方法

2.1動(dòng)物分組及模型的建立SD大鼠70只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按照體質(zhì)量分段隨機(jī)選取10只為正常組，其余60只SD大鼠造模：進(jìn)食高脂、高糖飼料(其中豬油、葡萄糖、膽固醇、膽酸鈉和基礎(chǔ)飼料的質(zhì)量比例為10∶20∶2.5∶1∶66.5)。用高脂高糖飼料喂養(yǎng)8周，將STZ溶于0.1 mol·L-1枸櫞酸鹽緩沖液(pH值為4.4)中，以30 mg·kg-1一次性空腹進(jìn)行腹腔注射，72 h后監(jiān)測血糖。連續(xù)3次空腹血糖≥16.7 mmol·L-1，尿糖呈陽性。尿微量白蛋白定性測量陽性者為DN模型制備成功。挑選造模成功后的大鼠，按照體質(zhì)量區(qū)段隨機(jī)分為5組，即模型組(生理鹽水5 mL·kg-1，灌胃)，胰島素組(10 μ·kg-1，皮下注射)，SDO各組分別ig 10.0，5.0和2.5 mL·kg-1，每組10只，各組給藥均2次/d，連續(xù)給藥8周。

2.2觀察指標(biāo)及檢測方法

2.2.1觀察大鼠一般狀態(tài)包括精神活動(dòng)狀態(tài)、皮毛色澤、凈飲食量和二便等狀況。每天給藥前稱量并記錄體質(zhì)量。

2.2.2血生化指標(biāo)檢測分別在給藥8周后，取血針從尾部取血檢測血糖；大鼠用乙醚麻醉，從眼底靜脈叢取血1.5 mL置于離心管中，離心取上層血清，檢測血肌酐、血尿素氮和三酰甘油等生化指標(biāo)。

2.2.3腎組織病理學(xué)觀察8周后取大鼠腎臟并稱取質(zhì)量，取部分腎臟組織放入中性福爾馬林中固定，HE染色，光鏡下觀察腎組織病理學(xué)改變。

通過問卷調(diào)查、社區(qū)走訪及向相關(guān)醫(yī)生咨詢等途徑，我們對(duì)用戶的需求進(jìn)行了切實(shí)的分析。根據(jù)分析，得到系統(tǒng)的功能性需求，分為以下4部分。

3結(jié)果

3.1SDO對(duì)DN大鼠一般狀態(tài)的影響實(shí)驗(yàn)期間，正常組生長良好、飲食正常、反應(yīng)靈敏；模型組大鼠逐漸出現(xiàn)多飲、多尿、多食、消瘦以及反應(yīng)遲鈍、毛發(fā)枯黃、尾巴蒼白濕冷、精神萎靡等現(xiàn)象。與模型組比較各給藥組，第1～4周與模型組表現(xiàn)相似；但用藥5周后，SDO各組大鼠精神、進(jìn)食量、飲水量、尿量都有所改善。實(shí)驗(yàn)過程中，模型組死亡3只，胰島素組、SDO高劑量組和SDO中劑量組各死亡1只，SDO低劑量組死亡2只；可能與造模過程中STZ的毒性作用有關(guān)，具體原因有待進(jìn)一步研究。

3.2SDO對(duì)DN大鼠血糖、糖化血紅蛋白及24 h尿量的影響模型組與正常對(duì)照組相比，血糖及糖化血紅蛋白含量顯著升高(P<0.01)；SDO各給藥組對(duì)血糖及糖化血紅蛋白沒有顯著影響(P>0.05)，而胰島素組則顯著降低血糖及糖化血紅蛋白(P<0.05)。與模型組比，SDO各組和胰島素組均可顯著降低大鼠24 h尿量(P<0.01) 。見表1。

表1SDO對(duì)DN大鼠血糖、糖化血紅蛋白及24 h尿量的影響

Tab.1 Effects of Shuangdan Oral Liquid on glucose，HbAlC and 24 h Urine in DN rats

組別數(shù)量劑量/mg·kg-1血糖/mmol·L-1糖化血紅蛋白/ABS·10gHemoglobin-124h尿量/mL正常組10等體積生理鹽水6.3±0.9**29.96±4.41**13.67±4.37**模型組12(3#)等體積生理鹽水26.7±5.155.93±4.0386.87±11.73胰島素組12(1#)5.0mL·kg-113.4±3.3**31.26±5.24**57.80±16.83**SDO高劑量組12(1#)10.0mL·kg-123.3±4.850.09±4.7265.30±15.84**SDO中劑量組12(1#)5.0mL·kg-124.1±4.351.86±3.8363.33±18.06**SDO低劑量組12(2#)2.5mL·kg-124.2±5.854.03±6.2457.22±24.86**

注：#實(shí)驗(yàn)期間死亡的大鼠；*P<0.05，**P<0.01VS模型組。

3.3SDO對(duì)DN大鼠體質(zhì)量和腎質(zhì)量系數(shù)的影響表2結(jié)果表明，與正常組相比，模型組大鼠體質(zhì)量明顯降低(P<0.01)；與模型組大鼠相比SDO各劑量組大鼠體質(zhì)量明顯升高(P<0.05)。與正常組相比模型組腎質(zhì)量/體質(zhì)量比明顯升高(P<0.01)，SDO各劑量組大鼠腎質(zhì)量/體質(zhì)量比顯著降低(P<0.05)。

表2SDO對(duì)DN大鼠體質(zhì)量及腎質(zhì)量系數(shù)的影響

Tab.2 Effects of Shuangdan Oral Liquid on kinedy weight / body weight in DN rats

±s)

注：#實(shí)驗(yàn)期間死亡的大鼠；**P<0.01，△P<0.05VS胰島素組。

3.4SDO對(duì)DN大鼠血肌酐、尿素氮的影響由表3可見，與正常組相比，模型組大鼠血肌酐和尿素氮的含量明顯升高(P<0.05)；與模型組大鼠相比，SDO各劑量組大鼠血肌酐和尿素氮水平顯著降低(P<0.05)。在降低血尿素氮方面SDO高劑量組較優(yōu)(P<0.05)；在降低血尿素氮方面雙SDO高、中劑量組作用效果顯著優(yōu)于胰島素組(P<0.01)。

表3SDO對(duì)DN大鼠血尿素氮、血肌酐的影響

Tab.3 Effects of Shuangdan Oral Liquid on BUN and SCr in DN rats

±s)

注：#實(shí)驗(yàn)期間死亡的大鼠；*P<0.05，**P<0.01 VS模型組；△P<0.05，△△P<0.01VS胰島素組。

3.5SDO對(duì)DN大鼠血脂的影響由表4可知，與正常組相比，模型組大鼠血總膽固醇、三酰甘油及低密度脂蛋白的含量明顯升高，血高密度脂蛋白的含量明顯降低(P<0.01)；與模型組相比，SDO各劑量組大鼠的血總膽固醇、三酰甘油和低密度脂蛋白的含量明顯降低(P<0.01)，血高密度脂蛋白含量明顯升高(P<0.01)。

表4SDO對(duì)DN大鼠血膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白的影響

Tab.4 Effects of Shuangdan Oral Liquid on T-CHO，TG，LDL-C and HDL-C in DN rats

±s)

注：#實(shí)驗(yàn)期間死亡的大鼠；*P<0.05，**P<0.01 VS模型組；△P<0.05VS胰島素組。

3.6SDO對(duì)DN大鼠血液流變學(xué)的影響表5可知，與正常組相比，模型組大鼠全血黏度明顯增加(P<0.01)；與模型組相比，SDO各劑量組和胰島素組大鼠全血黏度明顯降低(P<0.01)。

表5SDO對(duì)DN大鼠全血黏度的影響

Tab.5 Effect of Shuangdan Oral Liquid on the while blood viscosity in DN rats

±s)

組別數(shù)量全血黏度/mPa·s200s-130s-15s-11s-1對(duì)照組102.18±0.09**4.21±0.33**7.99±0.71**19.81±1.98**模型組12(3#)3.74±0.256.73±0.3114.64±0.9540.18±2.95胰島素組12(1#)2.64±0.20**3.15±0.41**6.56±0.76**17.41±2.45**SDO高劑量組12(1#)2.23±0.22**3.18±0.28**7.67±0.45**19.08±1.15**SDO中劑量組12(1#)2.96±0.224.31±0.25**8.56±0.50*30.06±5.17SDO低劑量組12(2#)3.41±0.125.53±0.98△8.69±1.41*31.33±4.81

注：#實(shí)驗(yàn)期間死亡的大鼠；*P<0.05，**P<0.01VS模型組；△P<0.05VS胰島素組。

3.7SDO對(duì)DN大鼠T-SOD和T-AOC活力的影響T-SOD和T-AOC是氧化應(yīng)激反應(yīng)的常見指標(biāo)。由圖1可知，與正常組相比，模型組大鼠血T-SOD和T-AOC活力明顯降低(P<0.01)；與模型組相比，SDO各劑量組大鼠血T-SOD和T-AOC活力明顯升高(P<0.05)。

A.對(duì)DN大鼠T-SOD的影響；B.對(duì)DN大鼠血清T-AOC的影響；

Fig.1 The effect of Shuangdan Oral Liquid on vitality of T-SOD and T-AOC in DN rats.

A. the effect on T-SOD；B. the effect on T-AOC.

*P<0.05，**P<0.01 VS model group;△△P<0.01VS insulin

3.8SDO對(duì)DN大鼠MDA和NO含量的影響MDA和NO是氧化應(yīng)激反應(yīng)的常見指標(biāo)。由圖2可知，與正常組相比，模型組血MDA和NO含量顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，SDO各劑量組大鼠血清MDA和NO含量明顯降低(P<0.05)。

A.對(duì)DN大鼠血清MDA含量的影響；B.對(duì)DN大鼠NO活力的影響

*P<0.05，**P<0.01 VS模型組；△P<0.01 VS胰島素組

Fig.2 The effect of Shuangdan Oral Liquid on the concentration of MDA and NO in DN rats.

A. the effect on MDA；B. the effect on NO

*P<0.05，**P<0.01 VS model group，△P<0.05 VS insulin

3.9SDO對(duì)DN大鼠腎臟組織病理的影響從光鏡下(圖3)可見，正常組：腎小球體積正常，結(jié)構(gòu)完整，腎小球、腎小管及間質(zhì)結(jié)構(gòu)正常，未見異常改變；模型組：大鼠腎小球和腎小管肥大，基底膜增厚，系膜區(qū)增寬，部分腎小管上皮空泡變性，擴(kuò)張且形狀不規(guī)則，部分毛細(xì)血管袢受壓塌陷。與模型組比較，雙丹口服液各組上述病變均有所改善，較模型組明顯減輕。

圖3SDO對(duì)DN大鼠腎組織病理的影響

Fig.3 The effect of Shuangdan Oral Liquid on the morphology change in kidney of DN rats (×200)

4討論

4.1SDO改善DN腎功能DN患者早期即可出現(xiàn)尿量增多，腎臟肥大，血肌酐及尿素氮升高。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SDO可顯著降低24 h尿量(與模型組相比，P<0.01)，降低DN大鼠的血肌酐及尿素氮水平(與模型組相比，P<0.05)。研究表明，丹參可顯著降低DN大鼠腎臟TGF-β1、結(jié)締組織生長因子(CTGF)、纖容酶原激活物抑制劑(PAI1)等細(xì)胞因子的水平，減少ECM的沉積，縮小腎小球體積，減少尿白蛋白的排泄，具有較好的腎臟保護(hù)作用[12]。

4.2SDO改善血脂代謝紊亂脂代謝紊亂與DN是相互影響的，高血脂促進(jìn)DN的發(fā)生與發(fā)展，DN則進(jìn)一步加重血脂紊亂，形成惡性循環(huán)[13]。本研究結(jié)果表明，SDO可降低DN大鼠的血總膽固醇、三酰甘油和低密度脂蛋白的含量，升高高密度脂蛋白含量(與模型組相比，P<0.01)，證明SDO具有調(diào)節(jié)DN大鼠血脂的功效。可能與SDO中所含的丹參成分具有的溶血、抗凝作用有關(guān)。大量研究證實(shí)，SDO中的主要有效成分為丹皮酚、丹參素2種單體。研究表明，丹參素抑制細(xì)胞內(nèi)源性膽固醇(Ch)的合成，降低細(xì)胞內(nèi)總膽固醇(TC)和氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)水平，因此具有保護(hù)血管屏障，防止脂質(zhì)沉積及動(dòng)脈粥樣硬化作用[14]。丹參素還有改善實(shí)驗(yàn)大鼠血液流變性，降低血液“濃、黏、聚、凝”狀態(tài)的作用[15]。丹參可全面調(diào)理DN狀態(tài)時(shí)的血液流變情況，延緩腎小球硬化的發(fā)生，從而對(duì)DN起到保護(hù)作用[16]。

4.3SDO增強(qiáng)機(jī)體抗氧化應(yīng)激能力DM的發(fā)生、發(fā)展及其病變程度，與自由基引發(fā)和介導(dǎo)的機(jī)體氧化損傷及機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)清除自由基能力平衡失調(diào)密切相關(guān)[17-18]。自由基損傷可造成血管通透性增加和基底膜增厚等病理改變， 并與DM早期腎小球血流動(dòng)力學(xué)變化有關(guān)。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SDO能夠升高血T-AOC及T-SOD活力(與模型組相比，P<0.05)，并且能降低血液中NO及MDA的含量(與模型組相比，P<0.05)進(jìn)而降低機(jī)體氧化應(yīng)激損傷。研究發(fā)現(xiàn)，丹參能明顯降低血清脂質(zhì)過氧化物(LPO)含量，提高血清超氧化物歧化酶(SOD)的活性，提示丹參可作為一個(gè)良好的外源性氧自由基清除劑[19]，減輕自由基代謝紊亂的作用可能是防治DN的重要作用機(jī)制。

4.4SDO改善腎臟病理學(xué)損傷DN的腎臟在光鏡下超微結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為腎小球和腎小管肥大，基底膜增厚，腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化。實(shí)驗(yàn)中SDO治療組腎臟光鏡下顯示腎小球和腎小管肥大程度減輕，基底膜增厚不明顯，未見系膜區(qū)明顯增寬，腎小管上皮空泡變性減少。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SDO能夠有效改善腎臟病理性損傷。

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Effectsof Shuangdan Oral Liquid on diabetic nephropathy rat models

CHEN Ying1, LIU Zhuying2, ZHOU Fuxing3,YANG Qian1, LI Hua1, SUN Jiyuan1,WANG Siwang1*(1. Department of Natural Medicine,School of Pharmacy,the Fourth Military Medical University,Xi′an 710032, China; 2.State Key Laboratory of Military Stomatology,Department of Orthodontics,School of Stomatology, the Fourth Military Medical University, Xi′an 710032, China;3.Department of Gynecology and Obstetrics, Xijing Hospital, the Fourth Military Medical University, Xi′an 710032,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of Shuangdan Oral Liquid (SDO) on experimental diabetic nephropathy (DN) and to explore its mechanism. MethodsSD rats were randomly divided into non-diabetic nephropathy control and DN group which were induced by administrating high-glucose-fat diet for four weeks and then intraperitoneal injection of streptozotocin 30 mg·kg-1. The DN rats were randomly assigned to five groups: model group，SDO group with three different doses (10.0，5.0 and 2.5 mL·kg-1，2 times·d-1，respectively) and insulin group (10 μ·kg-1，2 times·d-1). While control group and model group were given saline 5 mL·kg-1，2 times·d-1, the rest groups were treated with corresponding drugs for 8 weeks. At the end of the experiment，serum，urine and kidney were collected for the biochemical，oxidant stress，the whole blood viscosity and pathologic analysis. ResultsSDO could significantly decrease the level of 24 h urine，Scr and BUN and the concentration of T-CHO，TG，LDL，and increase the level of HDL in serum(P<0.05 or P<0.01)；it could also increase the activity of T-AOC and T-SOD(P<0.05 or P<0.01)，decrease the concentration of NO and MDA but had no effect on the level of FBG and HbA1c(P<0.05 or P<0.01). SDO could improve the whole blood viscosity and renal pathological damage. Conclusion SDO is an effective drug for treating DN, and the possible mechanism may be related to the improvement of metabolic disorders and the improvement of oxidative stress.

Key words:Shuangdan Oral Liquid；diabetic nephropathy model；oxidant stress

收稿日期：(2015-05-06)

通信作者：*王四旺，男，教授，博士生導(dǎo)師

作者簡介：陳穎，男，碩士研究生

基金項(xiàng)目：陜西省科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：2013K12-07-05)

中圖分類號(hào)：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1004-2407(2016)01-0056-06

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.01.018