王洪振，陳 徐，王 姝，冉秋菊，李秀玲，包朝亞，李長有，姚洪源

（1．吉林師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 吉林 四平136000；2．吉林大學(xué)分子酶學(xué)工程教育部重點實驗室， 長春130012；3．四平市神農(nóng)種業(yè)有限公司， 吉林 四平136000）

玉米（Zea mays L．）的組織培養(yǎng)研究是玉米生物技術(shù)育種的基礎(chǔ)，當(dāng)前玉米幼胚的組織培養(yǎng)已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。不同于玉米幼胚，玉米成熟種子容易保存，沒有生長季節(jié)和數(shù)量限制，是適用于玉米組織培養(yǎng)的一種較理想的外植體。因此，玉米成熟胚組織培養(yǎng)的研究一直備受關(guān)注。Green等于1974年首次報道玉米成熟胚組織培養(yǎng)獲得愈傷組織，但沒有獲得再生植株［1］。Wang等于1987年報道利用玉米成熟胚組織培養(yǎng)得到再生植株［2］。Huang等于2004年以7個玉米優(yōu)良自交系種子為材料，建立了再生頻率為19．8%～32．4%的成熟胚再生體系［3］。2008年，王世玉等進(jìn)一步報道以玉米自交系CML 295、CML 304和18－599R的成熟胚為外植體，探討并優(yōu)化了成熟胚來源的胚性愈傷組織誘導(dǎo)及繼代培養(yǎng)方法。對其愈傷組織的形態(tài)和組織切片的研究結(jié)果顯示，繼代過程可產(chǎn)生良好的Ⅱ型胚性愈傷組織。在分化培養(yǎng)中分別獲得68．6%、75．4%和84．8%的高頻再生率［4］。此后，越來越多的研究者相繼報道以玉米成熟胚為外植體的組織培養(yǎng)取得成功［5－9］。

目前，由于外植體預(yù)處理環(huán)節(jié)在玉米成熟胚組織培養(yǎng)中沒有統(tǒng)一的程序，不同的實驗室采用的方法也不一樣。本實驗室進(jìn)行了玉米成熟胚組織培養(yǎng)種子消毒條件優(yōu)化及成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基優(yōu)化研究，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究不同切胚處理對玉米成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1．1 材 料

1）實驗材料：為玉米（Zea mays）種子平育2B。

2）試劑：MS培養(yǎng)基成分、無水乙醇等均為市售分析純試劑，次氯酸鈉溶液有效氯含量為10%，用蒸餾水稀釋5倍即為本實驗所用2%次氯酸鈉溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

3） 儀 器 設(shè) 備：電 子 天 平 （ACCULAB ALC－110．4），德國 Sartorious集團；立式蒸汽滅菌器（YXQ－LS－50SⅡ），上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；超凈工作臺（DL－CJ－2ND型），北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；智能光照培養(yǎng)箱（PGX 450D型），寧波海曙賽福實驗儀器廠。

1．2 方 法

1．2．1 玉米種子預(yù)處理

挑選成熟玉米種子，大小均勻飽滿，用清水沖洗后，先用75%乙醇消毒1min，再用2%次氯酸鈉溶液消毒8min，然后放入無菌50mL三角瓶中，每瓶20粒種子，加入無菌水浸泡處理72h。

1．2．2 切胚處理

將經(jīng)過浸泡處理的成熟玉米種子，于超凈臺中進(jìn)行無菌操作，用解剖刀剝離出成熟胚，盾片面朝上全胚接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，實驗中所用誘導(dǎo)培養(yǎng)基全部為K 3玉米成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基［10］。

本實驗設(shè)計4種不同玉米成熟胚切胚處理方式，玉米成熟胚全胚培養(yǎng)作為玉米成熟胚切胚處理的對照。

切胚處理Ⅰ：將成熟胚縱向切開，將半胚切口朝下接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基；切胚處理Ⅱ：將成熟胚先縱向切開，再橫切1次，將四分胚切口朝下接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基；切胚處理Ⅲ：將成熟胚先縱向切開，再橫切3次，將八分胚切口朝下接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基；切胚處理Ⅳ：用解剖刀將成熟胚從種子上剝離后，先縱向切開，再橫切5次，將十二分胚切口朝下接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基。將培養(yǎng)皿放在培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)，溫度為26℃。每天觀察外植體的生長情況，及時去除污染的培養(yǎng)皿。3周后，進(jìn)行成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)率統(tǒng)計，并繼代培養(yǎng)。

成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)率（%）＝誘導(dǎo)出愈傷組織的成熟胚數(shù)／接種的成熟胚總數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

玉米成熟胚全胚培養(yǎng)和4種不同切胚培養(yǎng)，分別統(tǒng)計成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)率，結(jié)果如表1和圖1。4種切胚處理中，切胚處理Ⅱ愈傷組織誘導(dǎo)率最高。

表1 4種切胚方式對玉米平育2B成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

圖1 4種切胚方式對玉米平育2B成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

3 討 論

玉米成熟胚組織培養(yǎng)的預(yù)處理包括多個環(huán)節(jié)，如消毒、浸泡和變溫處理等，每個環(huán)節(jié)都對愈傷組織的誘導(dǎo)、繼代和再生有重要影響。

切胚處理也是玉米成熟胚組織培養(yǎng)預(yù)處理的一個重要步驟。目前關(guān)于玉米成熟胚組織培養(yǎng)的研究中，早期大多數(shù)采用全胚為外植體［11－13］。近期的研究中采用二分胚（胚縱切1次）為外植體的報道較多［14－16］。樸蓮玉等分離出經(jīng)過消毒和浸泡后種子的玉米胚，并將三分胚作為外植體［17］。趙錦慧等設(shè)計了4種切胚方式：Ⅰ是將完整的全胚放于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；Ⅱ是將胚取出切去幼芽和幼根以后，再放置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；Ⅲ是將去除幼根與幼芽的胚沿胚軸縱切以后分為兩部分，切口緊貼培養(yǎng)基放置；Ⅳ是將Ⅲ處理的每部分再橫著分割1次，最終切割為4塊。結(jié)果表明，以上4種處理中，Ⅲ的處理方式下平均誘導(dǎo)率最高，而Ⅰ處理方式下平均誘導(dǎo)率最低，表明一定的損傷反而可以刺激外植體的誘導(dǎo)［18］。但其沒有深入研究八分胚和十二分胚對愈傷組織誘導(dǎo)率的影響。

本實驗在優(yōu)化玉米成熟胚種子消毒條件和愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，設(shè)計了4種切胚處理方式，包括八分胚（胚縱切1次，再橫切3次）和十二分胚（胚縱切1次，再橫切5次）的實驗。4種切胚方式結(jié)果表明，切胚處理Ⅱ（即四分胚）愈傷組織誘導(dǎo)率最高，這一實驗結(jié)果與趙錦慧的實驗結(jié)果相同，而切胚處理Ⅲ（即八分胚）和切胚處理Ⅳ（即十二分胚）的愈傷組織誘導(dǎo)率還沒有作為對照的全胚培養(yǎng)的誘導(dǎo)率高。這一結(jié)果表明，雖然一定的損傷反而可以刺激愈傷組織的誘導(dǎo)，但外植體切割過小時對愈傷組織的誘導(dǎo)反而不利，接種的成熟胚外植體大小和損傷有一個合適的范圍。本實驗首次報道成熟胚切胚處理Ⅲ（即八分胚）和切胚處理Ⅳ（即十二分胚）對玉米成熟胚的愈傷組織誘導(dǎo)的影響，希望能夠?qū)σ院蟮南嚓P(guān)研究提供有價值的參考。

［1］Green C E，Phillips R L，Kleese R A．Tissue culture of maize（Zea mays L．）：initiation，maintenance and organic growth factors．Crop Sci，1974，14（1）：54－58．

［2］Wang A S．Callus induction and plant regeneration from maize mature embryos［J］．Plant Cell Rep，1987：360－362．

［3］Huang X Q，Wei Z M．High－frequency plant regeneration through callus initiation from mature embryos of maize（Zea mays L．）［J］．Plant Cell Rep，2004，22：793－800．

［4］王世玉，鄭用璉，劉亞，等．玉米成熟胚胚性愈傷組織的誘導(dǎo)、高頻再生及轉(zhuǎn)化的研究［J］．作物學(xué)報，2008，34（3）：423－428．

［5］何婷，王亦菲，陸瑞菊，等．糯玉米的成熟胚培養(yǎng)［J］．中國農(nóng)學(xué)通報，2009，25（4）：47－49．

［6］賈小霞，王漢寧，孔維萍，等．玉米幼胚和成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)過程中內(nèi)源激素的比較［J］．核農(nóng)學(xué)報，2009，23（4）：555－560．

［7］肖莉杰，王麗艷，閔麗．玉米成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)［J］．農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)：英文版，2009，10（6）：67－68，93．

［8］孔維萍．利用正交試驗篩選玉米成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基［J］．農(nóng)業(yè)科技通訊，2010（1）：62－63．

［9］裴冬麗，李成偉，韓秀英，等．玉米成熟胚離體培養(yǎng)體系的建立［J］．玉米科學(xué)，2011，19（2）：77－79，83．

［10］王洪振，陳徐，黃二沖，等．玉米種子消毒條件的優(yōu)化及成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)研究［J］．吉林師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2014，11（4）：91－94．

［11］郭麗紅，陳善娜，龔明，等．玉米根尖和成熟胚的愈傷組織培養(yǎng)及懸浮系的建立［J］．云南大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），1999，21（1）：141－144．

［12］石太淵，楊立國，杜艷艷，等．玉米體細(xì)胞培養(yǎng)中不同基因型和外植體的反應(yīng)［J］．國外農(nóng)學(xué)雜糧作物，1999，19（5）：11－14．

［13］王昌濤，楊愛國，高樹仁，等．玉米不同外植體愈傷組織的誘導(dǎo)及植株再生的研究［J］．沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2005，10，36（5）：515－518．

［14］陳勛基，危曉薇，李建平，等．玉米自交系成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)和再生體系研究［J］．新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，48（1）：30－34．

［15］邸宏，梁廣東，張林，等．玉米自交系成熟胚再生體系的優(yōu)化［J］．玉米科學(xué)，2011，19（1）：56－59．

［16］呂杰，周曉馥，未曉巍，等．基因型及基本培養(yǎng)基對玉米成熟胚培養(yǎng)的影響［J］．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（29）：17 767－17 768，17 780．

［17］樸蓮玉，宮赫陽，孫盼盼，等．玉米成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)及其影響因素研究［J］．延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)學(xué)報，2013，35（1）：72－76．

［18］趙錦慧，陳龍，牛子敬．玉米成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)與繼代培養(yǎng)的影響因素研究［J］．河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（7）：38－42．