徐靜靜，張良英，趙 冰，鄭茜子， 申惠翡， 袁柳祥

（1．西北農(nóng)林科技大學(xué)風(fēng)景園林藝術(shù)學(xué)院， 陜西 楊凌712100；2．西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院， 西藏 林芝860000）

杜鵑花（Rhododendron）作為“十大名花”之一，分布廣泛且栽培歷史悠久。世界約有960種杜鵑花，我國(guó)約有550種［1］，杜鵑花與報(bào)春（Primula）和龍膽（Oentiana）被稱為世界三大高山野生花卉［2］，在我國(guó)西藏有廣泛的分布，《西藏植物志》中詳細(xì)記載了170多種杜鵑花［3］。目前對(duì)西藏杜鵑花的研究主要集中于其群落分布以及從形態(tài)學(xué)角度分析種質(zhì)資源問題［4－5］。

西藏色季拉山屬濕潤(rùn)山地暖溫帶、半濕潤(rùn)山地溫帶氣候，含有約25種杜鵑花種與變種［5］，資源豐富，對(duì)杜鵑花種質(zhì)資源的研究有著重要的意義。利用ISSR分子標(biāo)記對(duì)杜鵑花的研究已經(jīng)有許多［6］，東北地區(qū)、云南以及陜西秦嶺一帶的杜鵑花資源都曾有學(xué)者研究［7－8］，但西藏杜鵑花資源的分子標(biāo)記卻未見報(bào)道。本研究利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)色季拉山8個(gè)杜鵑花野生種的親緣關(guān)系進(jìn)行研究，以期為色季拉山野生杜鵑花資源的開發(fā)利用和育種工作提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1．1 采 樣

本實(shí)驗(yàn)所用材料采集于色季拉山（表1），按種群采樣法采集樣本，每種采集20個(gè)樣本，放入硅膠干燥帶回，－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 8種杜鵑花的名稱和采集地分布

圖1 8個(gè)杜鵑花野生種間花部形態(tài)差異

1．2 總DNA的提取

采用CTAB法對(duì)硅膠干燥的葉片提取總基因組DNA，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，并用紫外分光光度計(jì)（Bio－RAD SmartpecMT 3000）檢測(cè)DNA濃度。最后用雙蒸水將DNA稀釋到50ng／μL，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．3 引物篩選與PCR擴(kuò)增

本實(shí)驗(yàn)所用引物參照加拿大哥倫比亞大學(xué)UBC公司公布的ISSR引物序列，由沃爾森生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。用每個(gè)種的DNA樣本在25μL反應(yīng)體系中對(duì)所選的49條引物進(jìn)行篩選，最后選出8條擴(kuò)增條帶清晰、重復(fù)性好的引物，使用者對(duì)8條引物（UBC 811、UBC 819、UBC 826、UBC 834、UBC 835、UBC 841、UBC 842、UBC 856）所有樣本進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)在北京君意公司生產(chǎn)的PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)體系采用25μL的Mix反應(yīng)體系：1μL引物、1μL 模 板 DNA、12．5μL Taq mix、10．5μL ddH2O。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min；94℃變性45s，53℃退火45s，72℃延伸90s，45個(gè)循環(huán)；72℃延伸8min，4℃保存。

對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳，使用Gene Genius公司的Bio Imaging System凝膠成像系統(tǒng)拍照，并記錄數(shù)據(jù)。

1．4 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)相同分子量DNA片段電泳遷移相同統(tǒng)計(jì)電泳結(jié)果，使用“0，1”數(shù)據(jù)記錄，有DNA擴(kuò)增條帶記為1，無條帶記為0，形成0／1矩陣。利用POPGENE軟件進(jìn)行相似性系數(shù)的分析，多態(tài)位點(diǎn)百分率（PPL）、有效等位基因（Ne）、Nei’s基因多樣性指數(shù)（h）、Shannon信息指數(shù)（Ⅰ）。然后利用 NTSYSpc 2．1軟件使用非加權(quán)算數(shù)平均法（UPGMA）對(duì)種群進(jìn)行聚類分析，獲得種群間親緣關(guān)系樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2．1 引物篩選與ISSR擴(kuò)增片段

本實(shí)驗(yàn)的ISSR標(biāo)記技術(shù)使用的是通用型引物，不同的引物對(duì)不同的物種擴(kuò)增條帶差異明顯，若想獲得條帶多態(tài)性和穩(wěn)定性都比較好的引物，則需要對(duì)不同的引物進(jìn)行篩選。實(shí)驗(yàn)所提供的材料均為野生種，因此在引物篩選時(shí)需要使用這8個(gè)野生種的樣本DNA對(duì)所選引物進(jìn)行篩選，以獲得能同時(shí)擴(kuò)增該8個(gè)種且所得條帶清晰明亮、多態(tài)性高、穩(wěn)定性強(qiáng)的引物。本實(shí)驗(yàn)選取了UBC的49條引物，使用這49條引物對(duì)8個(gè)野生種的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，分析得出，8個(gè)引物（表2）可對(duì)8個(gè)野生種擴(kuò)增出條帶清晰明亮、多態(tài)性高且穩(wěn)定性強(qiáng)的條帶。

利用這8個(gè)引物分別對(duì)8個(gè)種的樣本DNA進(jìn)行擴(kuò)增，共獲得343條帶，其中多態(tài)性條帶335條；每個(gè)引物可擴(kuò)增出14～16位點(diǎn)，總共獲得124個(gè)位點(diǎn)，其多態(tài)性位點(diǎn)123個(gè)，多態(tài)位點(diǎn)百分率為99．19%；擴(kuò)增片段為250～2 000bp，得出了帶型豐富的電泳圖譜（圖2）。

表2 對(duì)8個(gè)野生種樣本進(jìn)行擴(kuò)增的ISSR引物

圖2 引物UBC 856對(duì)8種杜鵑花種質(zhì)資源的ISSR擴(kuò)增電泳圖

2．2 聚類分析

利用POPGENE 32對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和計(jì)算，計(jì)算了有效等位基因數(shù)、多態(tài)位點(diǎn)百分率、Nei’s遺傳距離、Shannon信息指數(shù)，據(jù)此分析了8個(gè)種間的親緣關(guān)系。數(shù)據(jù)表明，8個(gè)種間的遺傳距離為0．377 6～0．709 4，遺傳相似性系數(shù)為0．491 9～0．685 5，雪層杜鵑與鱗腺杜鵑間的遺傳距離最大，黃毛海綿杜鵑與硬毛杜鵑間的遺傳距離最小。

利用NTSYSpc 2．1軟件根據(jù)8個(gè)種之間的遺傳相似性系數(shù)對(duì)這8個(gè)種進(jìn)行UPGMA聚類分析，構(gòu)建聚類樹形圖（圖3）?？煽闯?，在相似性系數(shù)約0．55處，8種杜鵑花被明顯地聚成兩類。第一類群中包含雪層杜鵑和柳條杜鵑；第二類群包含其余6種杜鵑花（硬毛杜鵑、黃毛海綿杜鵑、光蕊杜鵑、黃杯杜鵑、鱗腺杜鵑、白背紫斑杜鵑）被聚到了一個(gè)類群，其中硬毛杜鵑和黃毛海綿杜鵑的遺傳相似性系數(shù)最大，約為0．69。

3 結(jié)論與討論

ISSR分子標(biāo)記技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、成本低、重復(fù)性高的優(yōu)點(diǎn)，近年來被廣泛用于品種鑒定分類［9］、品種起源［10］、親緣關(guān)系的研究［11］和對(duì)瀕危物種的遺傳多樣性分析［12］。本實(shí)驗(yàn)中使用篩選所得的8個(gè)引物對(duì)8個(gè)杜鵑花野生種進(jìn)行擴(kuò)增，共得到343條清晰條帶，其中多態(tài)性條帶335條，多態(tài)性條帶比率為97．67%。圖譜數(shù)據(jù)經(jīng)分析所得的遺傳距離為0．377 6～0．709 4，有效等位基因百分率為99．19%。所得數(shù)據(jù)表明，實(shí)驗(yàn)所用的8個(gè)野生資源可以利用ISSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)其親緣關(guān)系進(jìn)行分析。

表3 8種杜鵑花的遺傳距離（對(duì)角線下）和遺傳相似性系數(shù)（對(duì)角線上）

圖3 8個(gè)杜鵑花野生種的遺傳相似性系數(shù)聚類分析圖

使用POPGENE軟件分析數(shù)據(jù)所得的8個(gè)種的遺傳距離為0．377 6～0．709 4；平均 Nei’s基因多樣性指數(shù)為0．376 8，平均Shannon信息指數(shù)為0．557 6，這些數(shù)據(jù)表明，在這8個(gè)種群間有著明顯的遺傳差異。8個(gè)種間遺傳相似性系數(shù)為0．491 9～0．685 5，在聚類分析中可以被聚到一起，且有明顯分組。聚類分析結(jié)果表明，在這8個(gè)野生種間存在著遺傳差異，并且有相同的遺傳背景。

利用 NYSYSpc 2．1根據(jù) Nei’s遺傳相似性系數(shù)對(duì)8個(gè)杜鵑花野生種進(jìn)行聚類分析，結(jié)果表明，在遺傳相似性系數(shù)約為0．55處，8個(gè)野生種明顯地被分為了兩類?！吨袊?guó)植物志》、《西藏植物志》中將該8種杜鵑分為三大類，杜鵑亞屬（雪層杜鵑、鱗腺杜鵑）、常綠杜鵑亞屬（黃杯杜鵑、硬毛杜鵑、光蕊杜鵑、黃毛海綿杜鵑、白背紫斑杜鵑）、糙葉杜鵑亞屬（柳條杜鵑）［13－15］，由聚類結(jié)果（圖3）可看出，8種杜鵑花野生種的遺傳相似性聚類與其形態(tài)分類不相符。雪層杜鵑和柳條杜鵑聚為一類，表明它們有相同的遺傳背景，然而遺傳相似性較低，在形態(tài)學(xué)分類上差異較大。白背紫斑杜鵑形態(tài)上被分為常綠杜鵑亞屬，且屬于常綠杜鵑組下的大理杜鵑亞組，與黃毛海綿杜鵑同處于同一亞組，在遺傳相似性系數(shù)聚類分析中與黃毛海綿有著相同的遺傳背景。由此可見，形態(tài)學(xué)分析可作為親緣關(guān)系研究的輔助手段。

本研究利用ISSR標(biāo)記技術(shù)初步分析了西藏色季拉山8種杜鵑花資源的親緣關(guān)系，聚類分析結(jié)果未能和形態(tài)學(xué)分類相一致，這為進(jìn)一步研究西藏杜鵑屬植物分類提供分子水平的理論依據(jù)，為育種以及雜交組合提供理論依據(jù)，同時(shí)也為其種質(zhì)資源保護(hù)利用提供理論基礎(chǔ)。

［1］司國(guó)臣，張延龍，梁振旭，等．秦嶺漢中地區(qū)野生杜鵑花種質(zhì)資源調(diào)查研究［J］．浙江農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)，2013（3）：350－353．

［2］趙冰，張果，司國(guó)臣，顧欣，等．秦嶺野生杜鵑花屬植物種質(zhì)資源調(diào)查研究［J］．西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2013（1）：104－109．

［3］閡天檬，方瑞征，黃素華．西藏植物志［M］．北京：科學(xué)出版社，1986（3）：553－677．

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