徐玲玲，李巧玉，張紅蓮，羅德勇，黎四現(xiàn)，關(guān) 萍

（貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 貴陽(yáng)550025）

目前，由于人類過(guò)于頻繁的生產(chǎn)活動(dòng)導(dǎo)致的重金屬污染已經(jīng)成為全球環(huán)境治理的一大難題，由重金屬造成的水體污染和土壤污染已經(jīng)成為全球急待解決的問(wèn)題。其中，鎘污染不容忽視。鎘是具有劇毒的重金屬，具有極強(qiáng)的生物遷移性，土壤中的鎘易被植物吸收，并最終通過(guò)食物鏈對(duì)動(dòng)植物的生長(zhǎng)和人類的健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅［1］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)大約有1／5的耕地面積遭到重金屬污染，嚴(yán)重減少了農(nóng)作物的產(chǎn)量［2］，所以由重金屬引起的土壤修復(fù)正成為研究的熱點(diǎn)。在眾多的修復(fù)方法中，植物修復(fù)因其具有成本低、操作簡(jiǎn)便、對(duì)環(huán)境擾動(dòng)較小和不易造成二次污染等優(yōu)點(diǎn)受到研究者的青睞［3－4］；尤其是具有生態(tài)功能的花卉及牧草，既具有觀賞價(jià)值，又能改善周邊環(huán)境，還能在一定程度上增加植被的覆蓋率［5］，所以對(duì)于這一類植物的篩選顯得尤為重要。目前國(guó)內(nèi)外已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的重金屬超積累植物多達(dá)500多種，但大多是Ni的超富集植物，鎘超富集植物數(shù)量較少［6］。對(duì)于耐鎘植物的篩選，大多從成苗期開始，但始于種子萌發(fā)階段的較少。種子萌發(fā)作為植物生活周期的關(guān)鍵階段，在此階段的生長(zhǎng)狀況直接與植物后期的生長(zhǎng)和繁殖密切相關(guān)，所以，探討種子萌發(fā)階段和幼苗初期對(duì)重金屬的生理響應(yīng)顯得更實(shí)際［7］。鳳仙花是常見的花卉植物，紫云英是常見的牧草，韭菜具有易生長(zhǎng)、生活周期長(zhǎng)、生物量大的優(yōu)點(diǎn)，3種植物均具有一定的生態(tài)功能。本試驗(yàn)初步探討了鳳仙花、韭菜和紫云英種子萌發(fā)階段和幼苗初期對(duì)不同濃度鎘的生理響應(yīng)，以期為耐鎘植物的篩選和重金屬污染區(qū)的土壤修復(fù)提供一定的參考。

1 材料與方法

1．1 供試材料

供試種子為鳳仙花（Impatiens balsamina L．）、韭菜 （A tuberosum Rottl．ex Spreng）和 紫 云 英（Astragalus sinicus L．），分別購(gòu)買于山東臨沂沃術(shù)花卉園、廣東廣州幸福種子百匯和浙江杭州鑫源花卉種子店。試劑：氯化鎘（CdCl2·2．5H2O）為分析純，蒸餾水；其他材料及儀器有：培養(yǎng)皿，光照培養(yǎng)箱，紫外分光光度計(jì)，高速冷凍離心機(jī)，電子天平，鑷子，游標(biāo)卡尺，定性濾紙等。

1．2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

分別將3種供試種子用0．5%高錳酸鉀表面消毒5min，用自來(lái)水沖洗若干次，然后用蒸餾水沖洗數(shù)次，將種子浸泡于去離子水中24h后，將多余的水分倒掉，然后用濾紙將其表面的水分吸干。選取直徑為11cm的培養(yǎng)皿，放入雙層同等規(guī)格的定性濾紙，用5mL移液槍向其中加入等量的鎘液直至濾紙飽和為止，然后在每個(gè)培養(yǎng)皿中用鑷子加入種子50粒，種子之間的距離要適中，以保證每粒種子與培養(yǎng)液充分接觸。本試驗(yàn)共設(shè)置7個(gè)處理，用CdCl2·2．5H2O分別配置成質(zhì)量濃度為50，100，150，200，250，300mg／L的鎘液，蒸餾水處理為對(duì)照，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)，以保證有足夠的量進(jìn)行生理指標(biāo)的測(cè)定。將存有種子的培養(yǎng)皿放入25℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔1d向內(nèi)補(bǔ)充相應(yīng)等量的培養(yǎng)液，以維持皿內(nèi)相對(duì)恒定的培養(yǎng)液濃度和濕度。每天觀察記錄種子的萌發(fā)狀況，分別于第4天統(tǒng)計(jì)種子的發(fā)芽勢(shì)，第7天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率，培養(yǎng)14d后，取幼苗進(jìn)行各生理指標(biāo)的測(cè)定。

1．3 測(cè)定內(nèi)容與方法

1．3．1 種子萌發(fā)指標(biāo)的測(cè)定

一般認(rèn)為待胚芽長(zhǎng)至種子長(zhǎng)度一半時(shí)為萌發(fā)。種子萌發(fā)1d后，持續(xù)7d觀察并記錄其發(fā)芽數(shù)，于第4天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽勢(shì)，第7天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率，測(cè)定其根長(zhǎng)、苗長(zhǎng)，并計(jì)算其發(fā)芽指數(shù)以及活力指數(shù)。以下指標(biāo)的計(jì)算參考孫園園［8］等的方法。

發(fā)芽率（%）＝供試種子的發(fā)芽數(shù)／供試種子數(shù)×100%。

發(fā)芽勢(shì)（%）＝3d內(nèi)供試種子的發(fā)芽數(shù)／供試種子數(shù)×100%。

發(fā)芽指數(shù)＝∑Gt／Dt，式中Gt為在t日的發(fā)芽數(shù)，Dt為發(fā)芽天數(shù)。

活力指數(shù)＝發(fā)芽指數(shù)×S，式中GI為發(fā)芽指數(shù)，S為芽的長(zhǎng)度＋根的長(zhǎng)度。

1．3．2 生理指標(biāo)的測(cè)定

培養(yǎng)2周后，分別測(cè)定3種植物葉綠素、丙二醛（MDA）的含量，超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）和過(guò)氧化物酶（POD）的活性。葉綠素含量采用分光光度法測(cè)定［9］，MDA含量采用硫代巴比妥酸法測(cè)定［10］，SOD 活性參照涂俊芳［11］等的氮藍(lán)四唑（NBT）光化還原法測(cè)定，CAT活性測(cè)定參照王亞玲［12］等的紫外吸收法測(cè)定，POD活性參照張志良［13］等的愈創(chuàng)木酚法測(cè)定。

1．4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)用 Microsoft Office Excel 2010進(jìn)行整理，用SPSS（19．0）進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2．1 不同濃度鎘對(duì)3種植物發(fā)芽勢(shì)及發(fā)芽率的影響

當(dāng)鎘濃度在100～300mg／L時(shí)，3種植物各脅迫處理的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率與對(duì)照均差異顯著（p＜0．05）（表1）。在50mg／L鎘脅迫下，發(fā)芽率均略高于對(duì)照，說(shuō)明低濃度鎘能促進(jìn)種子萌發(fā)。在0～50mg／L鎘處理范圍內(nèi)，發(fā)芽勢(shì)與對(duì)照均沒(méi)有顯著差異（p＞0．05）。隨著脅迫濃度增大，發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率均表現(xiàn)出下降的趨勢(shì)，在300mg／L二者均降至最低，與對(duì)照差異極為顯著（p＜0．01），說(shuō)明高濃度鎘抑制種子萌發(fā)。各處理下韭菜和鳳仙花的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率差別不大，但均低于紫云英的。在300mg／L鎘濃度下，紫云英的萌發(fā)率仍然達(dá)到41．33%，說(shuō)明鎘對(duì)其萌發(fā)的影響小于韭菜和鳳仙花。

表1 不同濃度鎘對(duì)3種植物種子萌發(fā)的影響

2．2 不同濃度鎘脅迫對(duì)3種植物幼苗初期生長(zhǎng)的影響

3種植物在50mg／L鎘處理時(shí)，苗長(zhǎng)和根長(zhǎng)均與對(duì)照有顯著差異（p＜0．05）（表2）。在300mg／L，韭菜、鳳仙花和紫云英的根長(zhǎng)分別為 0．76，0．25，0．26 cm，苗長(zhǎng)分別為2．39，1．27，0．75cm，均與對(duì)照具有極顯著差異（p＜0．01）。根長(zhǎng)和苗長(zhǎng)除韭菜和鳳仙花個(gè)別處理濃度間差異不顯著外，基本上各植物在各處理濃度間差異顯著，說(shuō)明隨著脅迫濃度的提高，鎘對(duì)植株生長(zhǎng)的阻礙作用越強(qiáng)。鎘濃度為300mg／L時(shí)，植株根長(zhǎng)及苗長(zhǎng)均最短，甚至出現(xiàn)無(wú)根苗。

2．3 不同濃度鎘脅迫對(duì)3種植物發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)的影響

隨著鎘濃度的升高，3種植物的發(fā)芽指數(shù)均呈現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)（圖1）。在100mg／L鎘處理下，鳳仙花和紫云英的發(fā)芽指數(shù)達(dá)到最大值36．57，比對(duì)照增加了16．46%。隨著脅迫濃度的增加，發(fā)芽指數(shù)逐漸下降。在300mg／L脅迫濃度下，3種植物的發(fā)芽指數(shù)均達(dá)到最小值，分別為13．6，15．33，20．6，比對(duì)照下降了56．69%，48．2%，55．08%。活力指數(shù)也隨鎘脅迫濃度的升高呈下降趨勢(shì)（圖2）。在300mg／L時(shí)活力指數(shù)最低，分別比對(duì)照下降了85．87%，92．64%，94．6%，差異極顯著。

圖1 不同濃度鎘脅迫下3種植物的發(fā)芽指數(shù)

圖2 不同濃度鎘脅迫下3種植物的活力指數(shù)

2．4 不同濃度鎘脅迫對(duì)3種植物葉綠素含量的影響

葉綠素含量在鎘濃度大于50mg／L時(shí)，隨脅迫濃度的升高呈下降趨勢(shì)（圖3）；韭菜和紫云英葉綠素的含量則隨著脅迫濃度增加而下降，趨勢(shì)較為平緩，而韭菜在前中期下降幅度不大，后期下降幅度較為明顯。在300 mg／L鎘濃度時(shí)，3種植物葉綠素含量均降到最低，分別為0．34，0．24，0．6mg／g （FW），分 別 較 對(duì) 照 降 低 了57．5%、53．66%、48．24%。在300mg／L時(shí)，3種植物的葉片較對(duì)照明顯發(fā)黃，紫云英和鳳仙花根部出現(xiàn)黑色斑點(diǎn)，表明高鎘脅迫明顯影響植物葉綠素的合成。

2．5 不同濃度鎘脅迫對(duì)3種植物幼苗MDA含量的影響

3種植物MDA含量均隨著鎘濃度的增加呈先升后降的趨勢(shì)（圖4）。鳳仙花和韭菜在低鎘濃度（50～100mg／L）脅迫下，MDA含量逐漸上升，并達(dá)到最大值1．01，0．88nmol／g （FW），分 別 較 對(duì) 照 增 加 了40．6%、31．81%；紫云英 MDA 含量在200mg／L鎘濃度脅迫下，達(dá)到最大值0．57nmol／g（FW），較對(duì)照增加了43．86%。3種植物MDA含量均在300mg／L鎘脅迫下時(shí)達(dá)到最低值（0．44，0．43，0．21nmol／g（FW）），分別較對(duì)照下降了26．67%、38．33%、34．38%。同一鎘濃度下，MDA含量高低順序?yàn)椋壶P仙花＞韭菜＞紫云英。

表2 不同濃度鎘對(duì)3種植物幼苗初期生長(zhǎng)的影響

圖3 不同濃度鎘脅迫下3種植物的葉綠素含量

圖4 不同濃度鎘脅迫下3種植物的MDA含量

2．6 不同濃度鎘脅迫對(duì)3種植物幼苗抗氧化酶活性的影響

2．6．1 鎘脅迫對(duì)3種植物幼苗SOD活性的影響

紫云英和韭菜SOD活性呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，鳳仙花則表現(xiàn)出先降后升再降的趨勢(shì)（圖5）。前兩者均在鎘濃度為100mg／L時(shí)達(dá)到最大值118．04，136．22 U／g（FW），隨著脅迫濃度增加，SOD活性逐漸降低，在300mg／L鎘濃度時(shí)，降至最低，分別為97．87，70．92 U／g（FW）。鳳仙花SOD活性在50mg／L鎘濃度較對(duì)照低，說(shuō)明低濃度的脅迫對(duì)其沒(méi)有造成損傷；隨著脅迫濃度的增加，活性開始增強(qiáng)，并在150mg／L鎘濃度時(shí)達(dá)到最大值82．33U／g（FW），當(dāng)鎘濃度為250mg／L時(shí)，開始低于對(duì)照組。3種植物SOD活性均在鎘濃度為300mg／L最低，且都低于對(duì)照組。

2．6．2 不同濃度鎘脅迫對(duì)3種植物幼苗CAT活性的影響

3種植物CAT活性均呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，韭菜增幅明顯大于鳳仙花和紫云英（圖6）。韭菜和鳳仙花在250mg／L鎘處理下，CAT活性達(dá)到最大值，為5．65，1．89U／（g·min）（FW）；紫云英 CAT活性在鎘濃度為100mg／L時(shí)達(dá)到最大值4．49U／（g·min）（FW）。在300mg／L鎘處理下，鳳仙花CAT活性降至1．22U／（g·min）（FW），仍然較對(duì)照高，而韭菜和紫云英CAT活性則達(dá)到最低值，分別為3．07，1．88U／（g·min）（FW），均比對(duì)照低，說(shuō)明3種植物對(duì)鎘脅迫的應(yīng)激程度存在差異。

圖5 不同濃度鎘脅迫下3種植物的SOD活性

圖7 不同濃度鎘脅迫下3種植物POD活性變化

2．6．3 鎘脅迫對(duì)3種植物幼苗POD活性的影響

鳳仙花和韭菜POD活性均呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，而紫云英呈上升的趨勢(shì)（圖7）。前二者POD活性分別在200，250mg／L鎘濃度下達(dá)到最大值90．93，66．24U／（g·min）（FW），分別比對(duì)照增加了59．94%、84．44%，差異顯著；隨著脅迫濃度的進(jìn)一步增大，二者POD活性開始迅速下降，并在300mg／L鎘脅迫下降至44．48，35．15U／（g·min）（FW）。而后者 POD活性在300mg／L鎘處理濃度下達(dá)到最大值115．87U／（g·min）（FW）。3種植物POD活性即使在300mg／L鎘脅迫下，依然高于對(duì)照，說(shuō)明它們對(duì)鎘具有一定的耐受性。

3 討 論

不同植物對(duì)重金屬脅迫的生理響應(yīng)不盡相同，原因可能與植物本身對(duì)重金屬的耐性不同有關(guān)，這與牛雅典［14］對(duì)不同油菜品種的耐性研究結(jié)果類似。對(duì)種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)而言，很多重金屬表現(xiàn)出低促高抑的現(xiàn)象［15－17］。本試驗(yàn)中，韭菜、鳳仙花和紫云英的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)隨著鎘脅迫濃度的提高均顯著下降，有學(xué)者認(rèn)為這與鎘能抑制與植物萌發(fā)有關(guān)酶類的活性或者阻礙細(xì)胞分裂有關(guān)［18］。高濃度鎘對(duì)根長(zhǎng)與芽長(zhǎng)的影響極為明顯，且對(duì)根的抑制作用大于芽的，這與藍(lán)群［19］等的研究相符。活力指數(shù)綜合反映了重金屬對(duì)種子萌發(fā)的影響［20］，本試驗(yàn)中活力指數(shù)比發(fā)芽指數(shù)下降趨勢(shì)更明顯，說(shuō)明鎘嚴(yán)重抑制種子萌發(fā)。有研究表明，重金屬通過(guò)抑制葉綠素的合成降低細(xì)胞內(nèi)葉綠素的含量，從而影響植物的光合作用［21］。本試驗(yàn)中，葉綠素含量大體上與鎘濃度呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明高濃度重金屬抑制了葉綠素的合成。MDA是細(xì)胞膜膜脂過(guò)氧化的直接產(chǎn)物，其含量在一定程度上反映了植物抵御逆境的能力［22］。3種植物 MDA含量呈先升后降的規(guī)律，說(shuō)明植物只在一定范圍的逆境中具有抵抗能力，超過(guò)這一范圍，就會(huì)失去自身的抵御能力。植物在逆境中往往通過(guò)啟動(dòng)自身的抗氧化保護(hù)酶系統(tǒng)來(lái)減少或清除由逆境產(chǎn)生的活性氧，以減輕逆境帶來(lái)的傷害。3種植物的SOD、POD、CAT活性均表現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)，在某個(gè)特定的鎘脅迫強(qiáng)度內(nèi)，保護(hù)酶產(chǎn)生的作用大于活性氧的作用，植物未表現(xiàn)出受害現(xiàn)象，但當(dāng)脅迫強(qiáng)度超過(guò)植物所能承受的范圍，保護(hù)酶系統(tǒng)的作用不足以抵抗活性氧的作用，植物調(diào)控失敗，代謝紊亂，甚至死亡。這與常云霞［23］等人的結(jié)論一致。不同濃度鎘脅迫對(duì)韭菜、鳳仙花和紫云英種子萌發(fā)和幼苗初期生理特性的影響表明，3種植物對(duì)鎘耐受性存在差異，但對(duì)于造成這種差異的原因還需要做進(jìn)一步的研究。

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