微生物多糖的生物合成及代謝工程研究進(jìn)展

曾化偉1，2，鄭惠華1，2，陳惠1，2，廖祥儒3，蔡宇杰3

(1.江蘇安惠生物科技有限公司， 江蘇 南通 226009；

2.中國科學(xué)院微生物研究所與江蘇安惠生物科技有限公司 藥用菌聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室， 江蘇 南通 226009；

3.江南大學(xué) 工業(yè)微生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江蘇 無錫 214122)

[摘要]綜述了微生物多糖的生物合成途徑、基因簇結(jié)構(gòu)與功能和代謝工程的研究進(jìn)展。真菌多糖的合成途徑主要包括：前體核苷酸糖(單糖的活化形式)的合成、合成的起始反應(yīng)、重復(fù)單元的延伸、翻轉(zhuǎn)和聚合、多糖的輸出。多糖合成過程中涉及大量的基因，大多數(shù)基因存在多糖合成基因簇中，隨著基因測序技術(shù)的發(fā)展，大量的多糖合成基因簇被發(fā)現(xiàn)和研究。研究表明：通過調(diào)控涉及糖核苷酸合成途徑的酶水平可提高胞外多糖的產(chǎn)量，而增加多糖合成基因簇基因在微生物中的表達(dá)，可產(chǎn)生更高的多糖合成代謝流。

[關(guān)鍵詞]微生物多糖；生物合成；基因簇；代謝工程

[文章編號]1673-2944(2015)04-0049-10

[中圖分類號]Q936

收稿日期：2015-01-30

基金項(xiàng)目：國家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2012AA021704)；江蘇省科技廳企業(yè)“博士集聚”計(jì)劃和江蘇省農(nóng)業(yè)科技支撐項(xiàng)目(BE2012341)

作者簡介：曾化偉(1981—)，男，江西省寧都縣人，江蘇安惠生物科技有限公司工程師，博士，主要研究方向?yàn)樗幱镁钚猿煞指咝Ю鄯e代謝工程；[通信作者]鄭惠華(1967—)，女，江蘇省南通市人，江蘇安惠生物科技有限公司高級工程師，主要研究方向?yàn)槭乘幱镁锛夹g(shù)。

微生物多糖主要包括細(xì)菌、藥用真菌在代謝過程中所產(chǎn)的一類由多個(gè)單糖或其衍生物聚合而成的大分子物質(zhì)。根據(jù)形態(tài)學(xué)上的分類，可以分為細(xì)胞壁多糖、細(xì)胞外多糖和細(xì)胞內(nèi)多糖，細(xì)胞壁多糖典型代表為細(xì)菌中O-抗原(O-antigen)，細(xì)胞外多糖包括細(xì)菌細(xì)胞壁外莢膜多糖(Capsular Polysaccharide，CPS)和胞外多糖(Exopoly Saccharides，EPS)[1]。細(xì)菌多糖可作為食品工業(yè)中的添加劑(如乳酸菌EPS、海藻酸鹽、黃原膠等)，或在制造化妝品中作為保濕成分(如透明質(zhì)酸)[2]。在醫(yī)藥中，病原細(xì)菌表面的CPS或O-antigen已被廣泛應(yīng)用于抗感染疾病多糖疫苗的開發(fā)，有些多糖疫苗已投入臨床使用[3]。近年來，隨著人們對保健意識的增強(qiáng)，藥用真菌多糖產(chǎn)品(如靈芝多糖)以其良好的抗腫瘤、提高免疫力、抗氧化等生物學(xué)活性已受到人們的矚目[4-5]。因微生物多糖優(yōu)越的應(yīng)用價(jià)值，科學(xué)家們對它們的生物合成途徑、途徑相關(guān)基因、代謝工程領(lǐng)域的研究產(chǎn)生了濃厚的興趣，并取得了可喜的研究成果，下面將對這些研究成果進(jìn)行綜述。

1微生物多糖生物合成的途徑

多糖合成途徑的研究主要集中在細(xì)菌中，真菌多糖的合成途徑研究非常少[2]。現(xiàn)有的研究表明，盡管多糖的結(jié)構(gòu)千差萬別，但它的合成途徑卻相對一致[3]。主要包括4個(gè)步驟：(1)前體核苷酸糖(單糖的活化形式)的合成；(2)合成的起始反應(yīng)；(3)重復(fù)單元的延伸、翻轉(zhuǎn)和聚合；(4)多糖的輸出。

1.1核苷酸糖的合成

根據(jù)多糖所含單糖的種類分為同型多糖和異型多糖[1]，異型多糖較同型多糖的核苷酸糖合成更復(fù)雜。筆者參考文獻(xiàn)[2,6-9]，總結(jié)了近年發(fā)表的異型多糖(如黃原膠、乳酸菌ESP(HePS)、靈芝菌絲體多糖(IPS-1-1)等)的一些主要核苷酸糖合成途徑(圖1)。以葡萄糖為發(fā)酵碳源，經(jīng)酶1轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸后，其代謝主要有三條支路。第一條途徑為葡萄糖-6-磷酸經(jīng)酶2轉(zhuǎn)化為葡萄糖-1-磷酸，再合成TDP-葡萄糖、TDP-鼠李糖、UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖、UDP-葡糖醛酸，這是基本的合成途徑；第二條途徑是葡萄糖-6-磷酸可以生成GDP-甘露糖和GDP-巖藻糖；第三條途徑是葡萄糖-6-磷酸經(jīng)酶11作用生成果糖-6-磷酸，再生成UDP-N-乙酰半乳糖胺和GDP-果糖。果糖-6-磷酸還能夠進(jìn)入糖酵解途徑產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸經(jīng)厭氧途徑生成乳酸，或通過有氧途徑進(jìn)入檸檬酸循環(huán)產(chǎn)生ATP和其它產(chǎn)物，這些ATP為多糖合成提供能量保證。如果以乳糖為發(fā)酵碳源，需依次經(jīng)Leloir途徑的酶(12-15)作用生成葡萄糖-1-磷酸，最后進(jìn)入核苷酸糖的合成；以果糖為碳源直接生成果糖-6-磷酸，然后在相關(guān)酶的催化下生成丙酮酸，或生成葡萄糖-1-磷酸，進(jìn)入核苷酸糖的合成。除此之外，還有大量未標(biāo)出合成途徑，它們能夠產(chǎn)生其它的核苷酸糖。如d-TDP-脫氧-太威糖、dTDP-D-3-乙酰-巖藻糖胺、GDP-L-可立糖等[10]。根據(jù)發(fā)酵碳源和多糖組成的不同，所涉及的合成關(guān)鍵酶并不完全相同，但一般包括酶(2、5、6、11)。

1.葡糖激酶；　　　　　　　　　　 2.α-磷酸葡糖變位酶；　　　　 3.葡萄糖-1-磷酸胸苷轉(zhuǎn)移酶； 4.鼠李糖合成酶系； 5.UDP-葡萄糖焦磷酸化酶； 6.UDP-半乳糖-4-差向異構(gòu)酶； 7.NAD連接的脫氫酶； 8.磷酸甘露糖變位酶； 9.GDP-甘露糖焦磷酸化酶； 10.脫水酶和GDP-巖藻糖合成酶； 11.磷酸葡糖異構(gòu)酶； 12.β-半乳糖苷酶； 13.半乳糖苷變旋酶； 14.半乳糖激酶； 15.半乳糖-1磷酸轉(zhuǎn)移酶 圖1　微生物部分核苷酸糖合成途徑

1.2合成的起始反應(yīng)

多糖合成研究主要集中在O-antigen合成中，把它作為一個(gè)模型。O-antigen合成的起始反應(yīng)是在起始糖基轉(zhuǎn)移酶作用下，將第一個(gè)核苷酸糖與位于細(xì)胞膜上的脂載體十一異戊烯磷酸(Und-P))形成Und-PP-連接的糖復(fù)合物，這個(gè)過程在不同O-antigen中相對保守[1]。在O-antigen合成中，WecA(PNTP蛋白家族)和WbaP(PHTP蛋白家族)是目前僅知的兩個(gè)起始轉(zhuǎn)移酶，WecA負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)-/N-乙酰氨基半乳糖(GalNAc)，WbaP負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)乳糖-1-磷酸或葡萄糖-1-磷酸[11]。部分EPS和CPS的合成和這個(gè)過程類似，也需要起始糖基轉(zhuǎn)移酶將核苷酸糖加載到脂載體上[12-13]。但乳酸菌同型多糖HoPS不依賴脂載體十一異戊烯磷酸[12]。

1.3重復(fù)單元的延伸、翻轉(zhuǎn)和聚合

在O-antigen多糖中，這步是核心過程。根據(jù)該過程中組裝和翻轉(zhuǎn)機(jī)制的不同，可分為三種途徑：Wzy-dependent途徑、ABC-transporter dependent途徑和synthase-dependent途徑[1]。

Wzy-dependent途徑：起始反應(yīng)后，基因簇中的糖基轉(zhuǎn)移酶將其余核苷酸糖按照一定順序轉(zhuǎn)移到單糖-PP-Und上，形成完整的十一異戊二烯二磷酸寡糖重復(fù)單元(RU-PP-Und)。RU-PP-Und隨后被翻轉(zhuǎn)酶(Wzx)反轉(zhuǎn)到內(nèi)膜一側(cè)[1]。Wzx如何實(shí)現(xiàn)該翻轉(zhuǎn)的清晰機(jī)制仍不清楚。但在綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)中，開展一系列的巧妙實(shí)驗(yàn)，一個(gè)更為清晰的機(jī)制正在逐漸呈現(xiàn)。Isiam等發(fā)現(xiàn)Wzx有12個(gè)跨膜螺旋，提出依賴于質(zhì)子逆向轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制來轉(zhuǎn)運(yùn)RU-PP-Und通過內(nèi)部富含帶正電荷的殘基空腔[14]。Wzx蛋白被認(rèn)為與其翻轉(zhuǎn)的RU-PP-Und有不嚴(yán)格底物特異性，但最近發(fā)現(xiàn)Wzx與RU-PP-Und的重復(fù)單元化學(xué)結(jié)構(gòu)的識別也是翻轉(zhuǎn)的部分機(jī)制[15]。在周質(zhì)空間內(nèi)，聚合酶Wzy將Ru-PP-Und聚合成十一異戊二烯二磷酸多糖(Ps-PP-Und)[16]。推測其聚合方式為PS-PP-Und中的PS轉(zhuǎn)移到Ru-PP-und的非還原端[17]。一般認(rèn)為Wzy的底物特異性很強(qiáng)，但最新研究表明，某些Wzy即具有比較松弛的底物特異性，它是闡釋O-antigen生物合成的關(guān)鍵酶。Wzy的聚合功能及其與Wzz的相互作用在體外試驗(yàn)中得到了證實(shí)[18]。然后由Wzz來控制O-antigen的長度。Wzz的作用機(jī)理尚不確定。通過研究3個(gè)O-antigen鏈長調(diào)節(jié)器(WzzB，WzzFepE，WzzECA)的晶體結(jié)構(gòu)，它們分別為五聚體、八聚體和九聚體的啞鈴型，具有相似的三維結(jié)構(gòu)，表明其有一個(gè)共同調(diào)節(jié)O-antigen鏈長的機(jī)制，這個(gè)觀察結(jié)構(gòu)支持了Morona模型[14]。該模型認(rèn)為Wzz能夠以成為伴侶的方式與Wzy和連接酶(WaaL)組成蛋白復(fù)合物，并調(diào)節(jié)Wzy和WaaL不同化學(xué)計(jì)量比例而影響O-antigen聚合動(dòng)力學(xué)[14]。但也有與該模型不同的結(jié)果，Woodward等通過體外重組了O-antigen的合成，發(fā)現(xiàn)O-antigen的鏈長度可單獨(dú)由Wzy和Wzz決定[14]。

EPS的合成與O-antigen中Wzy-dependent途徑相似，在EPS的生物合成系統(tǒng)中，也發(fā)現(xiàn)了類似Wzx，Wzy和Wzz的物質(zhì)[1]。80種大腸桿菌(Escherichia coli)血清型莢膜多糖分4個(gè)群，群1和4具有共同的組裝系統(tǒng)，與群2和3有根本的不同。群1和4具有與O-antigen相同的Wzy-dependent途徑，群1和4的合成依賴ABC-transporter dependent途徑[19]?？梢钥闯?，Wzy-dependent途徑是微生物分布最普遍的合成途徑。

ABC-transporter dependent途徑：該途徑存在于E.coli O8，O9，O52等、Klebsiella.pneumoniaeO1，O2，O12和小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Yersiniaenterocolitica)中的O-antigen合成中，也被發(fā)現(xiàn)在流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)、E.coli和Neisseriameningitidis莢膜多糖群2和3合成中[1，20-22]。O-antigen鏈?zhǔn)窃趦?nèi)膜細(xì)胞質(zhì)中淺層合成，其通過起始糖基轉(zhuǎn)移酶WecA催化的鏈反應(yīng)后，一個(gè)特異性的糖基轉(zhuǎn)移酶先在乙酰氨基葡萄糖十一異戊二烯二磷酸(GlcNAc-PP-Und)上添加一個(gè)糖殘基作為重復(fù)單元合成的糖基受體。如在E.coli O9a中，糖基轉(zhuǎn)移酶WbdC轉(zhuǎn)移單個(gè)甘露糖殘基到GlcNAc中形成糖基受體[1]。在K.pneumoniaeO2a中，雙功能半乳糖基轉(zhuǎn)移酶WbbO能轉(zhuǎn)移吡喃半乳糖殘基和呋喃半乳糖殘基到GlcNAc中形成糖基受體[23]。進(jìn)一步的鏈延伸由單功能或多功能糖基轉(zhuǎn)移酶將糖殘基依次轉(zhuǎn)移到Und-PP連接的糖基受體的非還原端。在聚合反應(yīng)完成后，新生糖鏈由屬于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體(經(jīng)Wzm編碼的2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(TMDs)和Wzt編碼的2個(gè)核苷酸結(jié)合域(NBDs))轉(zhuǎn)位通過內(nèi)膜。轉(zhuǎn)運(yùn)的具體細(xì)節(jié)和機(jī)理依然不明。該途徑不用Wzz來調(diào)節(jié)鏈的長度，而采用完全不同的方式。O-antigen鏈的長度可通過終端糖殘基的共價(jià)修飾來調(diào)節(jié)，如E.coliO9a的甲基化修飾[24]，K.pneumoniaeO2調(diào)節(jié)與ABC-transporter dependent相關(guān)的其它多糖合成組件的化學(xué)計(jì)量[25]。

莢膜多糖群2、3的合成中，雖然也用ABC-transporter dependent途徑，但起始糖基轉(zhuǎn)移酶是將第一糖殘基轉(zhuǎn)運(yùn)到聚2-酮-3-脫氧辛酮糖酸連接體(poly-Kdo linker)中。另外除需要由2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(KpsM)和2個(gè)的核苷酸結(jié)合域(KpsT)組成的轉(zhuǎn)運(yùn)體外，還需要多糖共聚合酶(PCP-3)家族(KpsE)和外膜多糖(OPX)蛋白(KpsD)。這些蛋白組成了蛋白復(fù)合物，并以一種類似于藥物外排泵的方式將多糖從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面[26]。

Synthase-dependent pathway途徑：直到現(xiàn)在，該途徑僅在Salmonellaenterica質(zhì)粒編碼的O54抗原的合成中觀察到[26]。該途徑是起始糖基轉(zhuǎn)移酶WecA催化反應(yīng)后，WbbE轉(zhuǎn)移第一個(gè)UDP-ManNAc到UndPP-GlcNAc作為糖基受體。WbbF蛋白似乎完成以后所有的步驟。WbbF屬于進(jìn)行性糖基轉(zhuǎn)移酶家族(合酶家族)，該家族蛋白涉及合成多種多糖(如透明質(zhì)酸、軟骨素、細(xì)菌纖維素等)。WbbF含有兩個(gè)保守的功能域，一個(gè)是負(fù)責(zé)按順序依次轉(zhuǎn)移ManNAc來延伸糖鏈，另一個(gè)具有Wzx的功能，即將多糖反轉(zhuǎn)到內(nèi)膜面向周質(zhì)空間的一側(cè)[20]。

1.4連接和終止

在細(xì)菌內(nèi)膜向周質(zhì)空間的一側(cè)，將O-antigen從PS-PP-Und上轉(zhuǎn)移到類脂A核心寡糖上形成完整的脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)[27-28]。該過程在上述3種糖鏈組裝和翻轉(zhuǎn)方式中是相同的，但具體反應(yīng)機(jī)理尚不清楚。僅知道一個(gè)WaaL是參與連接的酶類，它的連接功能在外試驗(yàn)已經(jīng)得到確認(rèn)[27-28]。近年來，提出該酶為一個(gè)不依賴金屬的反向寡糖轉(zhuǎn)移酶，能夠利用位于周質(zhì)暴露區(qū)域的精氨酸和組氨酸殘基轉(zhuǎn)移O-antigen到LPS外核，形成β-自由連鎖[34-35]。WaaL對還原端的糖殘基具有低的特異性。在一些條件下，甚至能夠連接可拉酸(包括非還原末端的葡萄糖)到LPS外核[27-28]。其底物特異性由天然的LPS外核的糖殘基受體決定[29]。

2微生物多糖生物合成途徑的相關(guān)基因

多糖合成過程中涉及大量的基因，大多數(shù)基因存在多糖合成基因簇中。隨著基因測序技術(shù)的發(fā)展，大量的多糖合成基因簇被發(fā)現(xiàn)和研究?，F(xiàn)將不同分類多糖的基因簇進(jìn)行闡述。

在O-antigen基因簇中，E.coli是研究最為深入的。Plainvert等對血清型O45菌株E.colimeningitis clone：K1：H7的基因簇進(jìn)行了序列分析，推測該基因簇位于尿苷三磷酸-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶(galF)和6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(gnd)之間。經(jīng)序列比對推測含有的9個(gè)開放閱讀框的功能：依次為4個(gè)涉及6-脫氧-L-塔羅糖合成途徑的酶(rmlABC和Tll)、假蛋白(wbvA)、Wzy、Wzz、糖基轉(zhuǎn)移酶(wbvB)、O-乙酰轉(zhuǎn)移酶(wbvC)。通過突變體的功能分析鑒定了Wzy能有效的對寡糖亞基產(chǎn)生聚合效應(yīng)[30]。最近，報(bào)道了對大量不同血清型O-antigen基因簇的序列比對分析，將使我們更全面的理解該類基因簇中基因的結(jié)構(gòu)與功能。184個(gè)血清型O-antigen基因簇均位于galF和gnd之間，galF、gnd和UDP-葡萄糖6磷酸脫氫酶(ugd)是保守基因。一些糖核苷酸合成基因如從dTDP-葡萄糖合成dTDP-L-鼠李糖途徑基因(rmlBDAC)，廣泛分布在56個(gè)血清型O-antigen基因簇中。N-乙酰神經(jīng)氨酸合成前體胞嘧啶核苷酸-N-乙酰神經(jīng)氨酸僅存在6個(gè)血型型O-antigen基因簇。至少有49基因簇中發(fā)現(xiàn)沒有發(fā)現(xiàn)糖核苷酸合成途徑基因，暗示這些基因位于基因簇外。每個(gè)基因簇中存在2~6個(gè)推測的糖基轉(zhuǎn)移酶基因，糖基轉(zhuǎn)移酶1家族(pf00534)和糖基轉(zhuǎn)移酶2家族(pf00535)分布最廣。幾乎所有基因簇都存在了Wzy-dependent途徑基因Wzx/Wzy或ABC-transporter dependent途徑基因Wzm/Wzt(血清型O14和O57列外，其可能不存在基因簇)[31]。46個(gè)血清型的Salmonella以GlcNAc-/GalNAc起始O-antigens合成基因簇分析表明：大多基因簇也定位于galF和gnd之間，存在Wzx/Wzy基因，4個(gè)血清型基因簇中僅存在Wzx或Wzy(除Salmonella O54and O67基因簇外，且其存在Wzm/Wzt基因)。在一些以乳糖起始合成的SalmonellaO抗原基因簇具有盒子結(jié)構(gòu)，即基因簇中間為血清特異性基因，兩側(cè)為一些高度同源的基因。但在這46個(gè)GlcNAc-/GalNAc起始血清型SalmonellaO抗原基因簇的基因高度多樣性，沒有這種盒子結(jié)構(gòu)[20]。在所有腸桿菌中O-antigen合成中，起始糖基轉(zhuǎn)移酶WecA不位于基因簇中[20]。

在ESP基因簇中，研究最為深入的是黃原膠和乳酸菌ESP。LactococcuslactisNIZO B40 ESP基因簇在乳酸菌中研究最為深入。Van Kranenburg等對該基因簇(EspRXABCDEFGHIJKL)的序列比對分析表明：EspR是調(diào)節(jié)的基因。在聚合和輸出過程，EspA-B參與決定多糖鏈長度。EspDEFGH為糖基轉(zhuǎn)移酶功能。EspI僅涉及到聚合功能，EspK僅為輸出功能。對糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行同源和異源表達(dá)，確認(rèn)EpsD是起始葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，EpsE和EpsF是將葡萄糖核苷酸轉(zhuǎn)移連接到脂載體上，EpsG負(fù)責(zé)將半乳糖連接到與脂載體結(jié)合纖維二糖，EpsJ涉及到半乳糖磷酸轉(zhuǎn)移酶功能或者是從脂載體產(chǎn)生骨架寡糖，EspB通過磷酸化來控制多糖的合成[32-35]。在比對5個(gè)L.lactis菌株的ESP基因簇序列，EpsD是保守的，EpsE序列具有菌株特異性[36]。最近，大量序列比對分析也應(yīng)用在ESP合成基因簇中，50條Oenococcusoeni基因組序列分析，分布了兩個(gè)基因簇(eps1和eps2)。eps1基因簇序列分析，將其分為模式A、B、C三種。超過50%的基因高度保守，ugd和吡喃半乳糖酶(glf)是最保守。模式A糖基轉(zhuǎn)移酶基因組成最簡單(Woa A、B、C、D、E)。與模式A不同，模式B、C出現(xiàn)其它的糖基轉(zhuǎn)移酶基因或不存一些糖基轉(zhuǎn)移酶基因。無論哪種模式，基因簇中都包括起始糖基轉(zhuǎn)移酶基因woaA。所有的模式均存在Wzz、Wzy、Wzx基因。eps2基因簇序列分析表明，其較eps基因簇復(fù)雜。可將其分為15個(gè)模式，模式中包括有以下推測的功能基因。5′端高度保守的調(diào)節(jié)蛋白(AraC，Wzd，Wze)、13個(gè)不同聚合酶(Wzy)、9個(gè)折疊酶家族、3個(gè)序列差異的起始糖基轉(zhuǎn)移酶WobA、其它各種類轉(zhuǎn)移酶、多糖前體合成酶等[37]。

莢膜多糖基因簇研究最多的在Escherichiacoli中，它可為革蘭氏陰性菌的模式基因簇。80個(gè)E.coli血清型分為4個(gè)群。K30為群1的模式血清型，其還存在于K.pneumoniae、Erwinia、創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus)等。K1、K5與K10、K54分別為群2、群3的模式血清型，它們還存在于N.meningitidis、Haemophilusinfluenzae等。K40和O111為群4的模式血清型，據(jù)我們所知僅存在于Escherichiacoli[19，38]。其它菌屬莢膜基因簇與大腸桿菌基因簇的結(jié)構(gòu)具有顯著的相似性，可歸為相應(yīng)莢膜多糖群的基因簇。EscherichiacoliK30莢膜多糖群1基因簇定位于galF和gnd基因之間，有12個(gè)閱讀框。依次有組裝新生CPS功能的Wzi、輸出聚合物到表面的Wza、起去磷酸化的基因Wzb和Wzc、4個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶(起始糖基轉(zhuǎn)移酶WbaP、WcaN、WcaO和WbaZ)、Wzx、Wzy、功能不清楚的orfY、orfZ。其中，起表達(dá)表面多糖作用的Wza、Wzb和Wzc基因在1群是保守的[39]。在Vibriovulnificus莢膜多糖群1基因簇也具有保守基因(wza、wzb和wzc)，并與E.coli有較高的同源性，但第一個(gè)開發(fā)閱讀框序列在Genbank中沒有同源性，不同Vibriovulnificus菌株之間多糖合成基因存在多樣性[38]。群4基因簇也出現(xiàn)了與群1有一樣的保守基因(Wza、Wzb和Wzc)[40]。K5群2基因簇分為3個(gè)獨(dú)立依賴溫度調(diào)節(jié)的功能區(qū)。功能區(qū)1包括基因(kpsFEDUCS)，kpsFED具有輸出或轉(zhuǎn)運(yùn)功能，kpsUCS與磷脂酰-3-脫氧-D-甘露-辛酮糖的合成有關(guān)。功能區(qū)2為血清型特異基因(kfiA，B，C and D)，kfiA為起始糖基轉(zhuǎn)移酶、KfiC為糖基轉(zhuǎn)移酶，kfiD為UDP-葡萄糖脫氫酶。功能區(qū)3包括涉及ABC-transporter dependent途徑的kpsM和kpsT。兩端的KpsC、KpsD、KpsE、KpsM、KpsS和KpsT為保守區(qū)域[41]。流感嗜血桿菌b型莢膜多糖基因簇與K5群2基因簇相似，即中間是與多糖生物合成相關(guān)的血清型特異的區(qū)域2，兩端是在所有流感嗜血桿菌中都保守的區(qū)域1和3[42]。群3也出現(xiàn)與群2基因簇具有一樣的保守基因(kpsM和kpsT)[40]。

在革蘭氏陽性菌中，Streptococcus莢膜多糖基因簇研究最多。35個(gè)血清型Streptococcussuis莢膜多糖基因簇與S.suisP1/7全基因組比較，22個(gè)血清型的CPS基因簇序列定位于染色體基因orfZ到roA之間，其它13個(gè)位于其它基因的兩側(cè)。其與乳糖起始合成的SalmonellaO抗原基因簇一樣具有盒子結(jié)構(gòu)，即基因簇中5′具有4個(gè)高度保守的基因(cpsABCD)。cpsA具有多糖合成調(diào)節(jié)作用，缺失cpsB不產(chǎn)生莢膜，cpsC和cpsD可能與蛋白的輸出有關(guān)。3′端相對保守序列。中間區(qū)域基因功能包括起始糖基轉(zhuǎn)移酶、多種其它糖基轉(zhuǎn)移酶、多種糖苷前體合成酶、翻轉(zhuǎn)和聚合酶等，各血清型基因簇間(除血清型4)在這個(gè)區(qū)域展示多樣性(存在一個(gè)以上特異血清型基因)。所有血清型莢膜多糖合成模式均為Wzx/Wzy pathway途徑[43]。在90個(gè)血清型S.pneumoniaecapsular基因簇中也存在盒子結(jié)構(gòu)，上游位置也存在高度保守的4個(gè)合成調(diào)節(jié)基因(cpsABCD)，基因簇內(nèi)包含多種糖基轉(zhuǎn)移酶、多糖合成酶、乙?；D(zhuǎn)移酶和翻轉(zhuǎn)酶等[44]。其它革蘭氏陽性菌S.aureus血清5型莢膜多糖基因簇中，存在16個(gè)基因緊密連接的基因，中間區(qū)域的基因也存在血清型特異性[45]。

3微生物多糖的代謝工程

隨著科學(xué)家取得了大量關(guān)于微生物多糖生物合成途徑和相關(guān)基因的研究成果，多糖合成的代謝工程方面的研究逐漸展開。代謝工程是重組DNA技術(shù)通過改變細(xì)胞內(nèi)有關(guān)的酶活、酶量和輸送體系、調(diào)節(jié)功能，改變細(xì)胞的遺傳特性以改進(jìn)微生物某些代謝活性，最大限度的提高目的產(chǎn)物產(chǎn)率的一門技術(shù)[46]。微生物多糖合成的代謝工程的研究可以分為兩個(gè)目標(biāo)：一個(gè)是提高多糖的產(chǎn)量，另外一個(gè)是改變多糖的結(jié)構(gòu)。

提高微生物多糖的產(chǎn)量有可能能帶來生產(chǎn)效益的提高，降低生產(chǎn)成本。為此近年來國內(nèi)外研究人員在這方面進(jìn)行了大量的代謝工程研究。歸納起來可以通過以下策略實(shí)現(xiàn)：(1)通過調(diào)控涉及糖核苷酸合成途徑的酶水平來提高胞外多糖的產(chǎn)量。S.thermophilusLY03在以乳糖為碳源生長時(shí)，過表達(dá)催化6-磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)化葡萄糖-1-磷酸的葡萄糖磷酸變位酶和涉及合成UDP-葡萄糖的UDP-葡萄糖焦磷酸化酶，提高Leloir途徑的酶活，提高Leloir途徑的酶或和過表達(dá)UDP-葡萄糖焦磷酸化酶均能提高胞外多糖產(chǎn)量。通過敲除葡萄糖磷酸變位酶基因和提高Leloir途徑的酶活也能提高胞外多糖產(chǎn)量[47]。Leloir途徑的UDP半乳糖4-差向異構(gòu)酶被認(rèn)為是合成lactic acid bacteria胞外多糖的關(guān)鍵酶[48]，Welman AD等通過提高該酶的活力達(dá)到提高胞外多糖的產(chǎn)量[46]。但也有一些提高糖核苷酸合成途徑的酶活力不能提高多糖產(chǎn)量的報(bào)道。在菌株L.lactisUDP-葡萄糖焦磷酸化酶，能夠大幅度提高UDP-葡萄糖和UDP-半乳糖的合成能力，胞外多糖產(chǎn)量卻沒有提高[49]。在其他的乳酸菌和藥用菌靈芝中過量表達(dá)UDP-葡萄糖焦磷酸化酶，又能提高胞外多糖產(chǎn)量[46，50]。上述研究表明，通過調(diào)控涉及糖核苷酸合成途徑的酶水平來提高多糖產(chǎn)量的方式具有較大的靈活性。(2)增加多糖合成基因簇基因在微生物中的表達(dá)，產(chǎn)生更高的多糖合成代謝流。用高拷貝載體pIL253進(jìn)行L.lactisNIZO B40 eps基因簇的拷貝，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雖然細(xì)胞生長速率由此而降低，EPS的產(chǎn)量則提高了4倍[51]。將多個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)入菌株Sphingomonas，增強(qiáng)了糖基轉(zhuǎn)移酶活力，使胞外多糖產(chǎn)量提高了20%[52]。其它策略：一些研究暗示能量和輔酶水平可能提高多糖合成。調(diào)節(jié)輔酶平衡(NADH/NAD+)能夠減少碳代謝流向乳酸，而更多的流向其它代謝物，減少乳酸對乳酸菌生長的脅迫[7，53]。最近通過在LactobacilluscaseiLC2W過表達(dá)NADH氧化酶，能使多糖產(chǎn)量提高46%[53]。但在多糖中的透明質(zhì)酸的研究中，在Streptococcus過表達(dá)NADH氧化酶，能量的合成能力提高了30%，生物量提高了15%，透明質(zhì)酸的產(chǎn)量卻沒有提高[50]；在透明質(zhì)酸代謝工程研究中，科研人員試圖通過敲除透明質(zhì)酸降解酶，來提高其產(chǎn)量[54]。在菌株S.zooepidemicus共表達(dá)有增強(qiáng)細(xì)胞攝氧的作用的vgb基因和透明質(zhì)酸合成hasABC基因，能使透明質(zhì)酸產(chǎn)量提高了30%[55]；在海藻糖代謝工程研究中，通過在P.aeruginosa過表達(dá)海藻糖鹽合成途徑間接調(diào)控因子CupB5蛋白和ClpXP proteases基因，海藻糖的產(chǎn)量也能獲得提高[56-57]。值得注意的是，近年來Woodward等首先通過化學(xué)合成方法制備了多糖合成的中間物質(zhì)(N-乙酰-d-半乳胺)，然后采用依次將酶糖基化的方法，構(gòu)建了Eoli86寡糖重復(fù)單元，再成功的表達(dá)出聚合酶Wzy，最終實(shí)現(xiàn)了體外合成O-antigen多糖[58]。這項(xiàng)技術(shù)雖然超出了代謝工程的范疇，但是其為多糖的產(chǎn)量的提高提供更為廣闊的研究空間。

通過代謝工程還能改變多糖的結(jié)構(gòu)，這將有可能改變多糖的物理、化學(xué)和生物活性等，為多糖的應(yīng)用展現(xiàn)更為優(yōu)越性能。菌株L.delbrueckiisubsp.bulgaricus培養(yǎng)在以果糖為碳源的培養(yǎng)基中，胞外多糖的葡萄糖和半乳糖的比列為1∶2.4。培養(yǎng)在果糖和葡萄糖的混合物中，胞外多糖的葡萄糖、半乳糖和鼠李糖比列為1∶7.0∶0.8[59]。菌株L.rhamnosusE/N在分別以葡萄糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖為唯一碳源發(fā)酵產(chǎn)的胞外多糖。經(jīng)凝膠色譜研究表明，半乳糖、蔗糖和乳糖發(fā)酵產(chǎn)的多糖具有高、低分子量分布，麥芽糖和葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)的多糖僅有高分子量分布。原子力顯微鏡分析表明多糖的分子量比例和聚合鏈長度不同，且與多糖溶液粘度相關(guān)[60]。這些研究結(jié)果暗示了通過代謝工程調(diào)整碳的代謝流，可以改變多糖的組分、多糖分子量分布、空間構(gòu)象等結(jié)構(gòu)特征。就在最近，利用代謝工程改變碳代謝進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾已有成功的實(shí)例。Yi等[18]利用含有巖藻糖的E.coliO86 O抗原多糖為研究模式，將Bacterioidesfragilis的GDP-巖藻糖補(bǔ)救代謝途徑(能夠高效利用培養(yǎng)基中巖藻糖類似物合成GDP-巖藻糖類似物)取代E.coliO86自身的GDP-巖藻糖從頭合成代謝途徑，將該工程菌生長在巖藻糖類似物中，發(fā)現(xiàn)O抗原多糖被該巖藻糖類似物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)同源修飾。將新的多糖合成元件(包括基因簇和糖基轉(zhuǎn)移酶)導(dǎo)入到微生物體內(nèi)將產(chǎn)生新的多糖合成途徑，將有可能改變多糖的單糖組分。將含有S.thermophilusSfi6的多糖合成基因簇的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入不產(chǎn)胞外多糖的L.lactisMG1363菌株中，使L.lactisMG1363能夠合成胞外多糖，該多糖重復(fù)單元的乙酰半乳糖胺變成了半乳糖，而且糖基側(cè)鏈缺失。這可能是由于產(chǎn)乙酰半乳糖胺能力的丟失，導(dǎo)致骨架上半乳糖而不是乙酰半乳糖胺[61]。

4靈芝藥用模式真菌多糖合成和代謝工程的研究

雖然一些精細(xì)的微生物多糖合成途徑、相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)與功能的研究上還不是很清楚，但在該研究領(lǐng)域(尤其在細(xì)菌中)已經(jīng)取得了前所未有的成果。通過代謝工程技術(shù)已也大幅度的提高了透明質(zhì)酸、海藻酸鈉和乳酸菌ESP的產(chǎn)量，并在多糖結(jié)構(gòu)改性中展現(xiàn)了應(yīng)用前景。然而這些研究在藥用模式真菌——靈芝(屬于真菌界、真菌門、擔(dān)子菌亞門層菌綱、非褶菌目、靈芝科、靈芝屬真菌)中幾乎還是空白。近10多年來靈芝多糖的藥理作用和結(jié)構(gòu)特征已基本明確，然而其發(fā)酵多糖產(chǎn)量和多糖結(jié)構(gòu)急待通過代謝工程技術(shù)得以改善。代謝工程技術(shù)應(yīng)用的基礎(chǔ)是充分明晰其生物合成和相關(guān)基因簇，靈芝多糖合成和代謝工程研究僅局限于對IPS-1-1合成途徑進(jìn)行了初步推測[8]，迫切要求我們這一代科研人員進(jìn)行更為深入的研究。近期，隨著中國藥用植物研究所采用二代測序技術(shù)及光學(xué)圖譜完成繪制整染色體級的靈芝基因組精細(xì)圖[62]，為靈芝多糖代謝工程研究提供了一定的生物學(xué)信息。國家“863”課題中又對企業(yè)科研機(jī)構(gòu)與高校共同承擔(dān)的靈芝多糖合成方面的研究給予大力支持，目前課題組已展開了靈芝多糖生物合成途徑分析和基因簇的研究工作，并最終要實(shí)現(xiàn)大幅度提高多糖產(chǎn)量和改善多糖生物活性功能。

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[責(zé)任編輯：謝 平]

Progress in research on biosynthesis and metabolic engineering

of microbial polysaccharides

ZENG Hua-wei1，2，ZHENG Hui-hua1，2，CHEN Hui1，2，LIAO Xiang-ru3，CAI Yu-jie3

(1.Jiangsu Alphay Biotechnology Co.Ltd, Nantong 226009, China；

2.Institute of Microbiology Chinese Academy of Sciences-Jiangsu Alphay Biotechnology

Co. Ltd Joint Laboratory of Medicinal Fungi, Nantong 226009, China；

3.Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University,

Wuxi 214122, China)

Abstract:This paper reviewed progress in research on biosynthetic pathways of microbial polysaccharide, gene cluster structure and function, and metabolic engineering. Biosynthetic pathways of Fungi polysaccharide include: the synthesis of precursor nucleotide sugars (the activated form of monosaccharide), the starting reaction of the synthesis, the extension, flip and aggregation of the repeating unit, and polysaccharides output. Polysaccharide synthesis process involves a large number of genes, most of which are present in the polysaccharide synthesis gene cluster. With the development of genetic sequencing technology, a large number of polysaccharide synthesis gene clusters have been found and researched. Studies have shown that regulating enzymes involved in sugar nucleotide synthesis pathway can increase the production of extracellular polysaccharide. The increase of polysaccharide gene cluster expression in microorganisms can produce higher polysaccharide anabolic flow.

Key words:microbial polysaccharides;biosynthesis;gene clusters;metabolic engineering