文婷婷， 王 洋， 利 站， 林 程， 關(guān)亞靜， 胡 晉

（1.浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院種子科學(xué)中心， 杭州310058；2.山東省種子管理總站， 濟南250100； 3.浙江農(nóng)林大學(xué)， 杭州311300）

豌豆作為世界第四大豆類作物，種植面積廣，年產(chǎn)量高，是重要的人類食品和動物飼料。多年來有關(guān)豌豆種子的研究已廣泛開展，主要是從豌豆種子的生理特性、萌發(fā)特性及種植品質(zhì)等角度研究報道。但國內(nèi)外對豌豆種皮的研究卻鮮見報道。豌豆種皮作為種子的重要組成部分，是種子胚胎與外界環(huán)境間的重要生物屏障，在保護胚胎免受逆境危害、調(diào)控胚胎發(fā)育、決定種子休眠和萌發(fā)、種子品質(zhì)等方面都起著重要的作用；同時，它也是種子吸收外界化合物的第1道屏障。種皮透性可控制種胚與外界間的水分、氣體和養(yǎng)分的交換，對種子休眠、萌發(fā)、貯藏以及種子處理等具有重要的作用。已有研究表明，化學(xué)物質(zhì)在種子中的滲透性與種皮結(jié)構(gòu)及成分等密切相關(guān)。劉軍等報道，紅豆草和扁蓿豆在種皮結(jié)構(gòu)上有差異，導(dǎo)致透水性不同［1］。孫群等通過測定硬實種子和非硬實種子種皮粉末中的粗纖維、Ca、Si含量的差異，發(fā)現(xiàn)硬實種子的種皮強度在很大程度上與粗纖維和Ca有關(guān)，粗纖維和Ca的大量積累增加了種皮的機械強度［2］。電鏡和質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展為種皮結(jié)構(gòu)和成分的深入研究創(chuàng)造了條件，但是引起種皮透水性差異的許多機理尚不完全清楚。本研究應(yīng)用掃描電鏡觀察種皮結(jié)構(gòu)，顯微化學(xué)鑒別法和紅外光譜分析法鑒定種皮細胞壁成分，并借助能量色散型x射線熒光分析儀對種皮中礦物元素含量進行定量測定，旨在探索豌豆種皮結(jié)構(gòu)及成分對種子透水性的影響，以期為提高種子透性和品質(zhì)提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗選用3個豌豆品種的種子：豐優(yōu)1號、甬苗豌豆和中豌3號。種子置于4℃冰箱貯藏備用。

1.2 方 法

1.2.1 掃描電鏡觀察種子種皮結(jié)構(gòu)

種子預(yù)處理參考劉強等［3］和文婷婷等［4］的方法。種子用濃度為0.1mol／L，pH＝6.9的磷酸緩沖液（PBS）浸泡12h，于2.5%的戊二醛溶液中4℃固定過夜后用0.1mol／L PBS漂洗樣品3次，每次15min。將種皮剝離，橫切種臍，用1%的鋨酸溶液固定樣品1～2h后再用0.1mol／L PBS漂洗樣品3次，每次15min。用50%、70%、80%、90%、95%5種濃度的乙醇溶液對樣品依次脫水，每種濃度處理15min，再用100%的乙醇處理2次，每次20min，接著用乙醇與醋酸異戊酯的混合液（體積比為1∶1）處理樣品30min后用純醋酸異戊酯處理樣品過夜。

對樣品進行臨界點干燥，離子濺射鍍膜，掃描式電子顯微鏡（XL 30－ESEM，荷蘭飛利浦公司）觀察，拍照。

1.2.2 酸蝕豌豆種子吸水率的測定

用濃硫酸對種子分別處理0，5，20，40，60min，每處理3次重復(fù)，每重復(fù)50粒。酸蝕種子用清水沖洗并擦干表面浮水后稱重。將酸蝕種子浸泡于蒸餾水中，并于2，4，6，8，10，12h后分別取樣，擦干表面浮水，稱重記錄。

1.2.3 顯微化學(xué)鑒別法鑒定豌豆種皮細胞壁成分

參考劉軍等［1］的方法，取豌豆種皮分別在碘－氯化鋅溶液、鹽酸間苯三酚試劑和蘇丹Ⅳ酒精飽和溶液中染色，觀察并記錄種皮橫斷面染色結(jié)果。

1.2.4 紅外光譜分析法鑒定豌豆種皮細胞壁成分

豌豆種皮經(jīng)液氮研磨成粉末狀，采用紅外光譜儀（AVATAR 370型，美國 Thermo Nicolet公司生產(chǎn)，光譜分辨率4cm－1，掃描信號累加32次）掃描觀察。

1.2.5 種子飽和吸水率及皮殼率的測定

取豌豆種子，3次重復(fù)，每次100粒，稱重后浸于蒸餾水中12h，取出種子，擦干表面浮水，稱重記錄。

種子皮殼率測定參照王瑞等［5］的方法，將樣品用蒸餾水浸泡2d，小心去皮，皮和胚分別置于105℃烘箱中烘至恒重后稱重。

皮殼率（%）＝皮重／（皮重＋胚重）×100%。

1.2.6 礦物元素含量測定

取3個豌豆品種種子種皮各3～4g，經(jīng)液氮研磨成粉末狀，每個品種3次重復(fù)。處理好的樣品使用島津能量色散型x射線熒光分析儀（可測元素范圍為Al～U）進行元素含量測定。

1.2.7 統(tǒng)計分析

百分率數(shù)據(jù)根據(jù)y＝arcsin［sqrt（x／100）］進行反正弦轉(zhuǎn)化，采用Statistical Analysis System （SAS）軟件進行差異顯著性（a＝0.05，LSD）分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 豌豆種皮結(jié)構(gòu)

經(jīng)掃描電鏡觀察，豌豆種皮表面有角質(zhì)層，并且呈網(wǎng)狀，網(wǎng)眼由不規(guī)則多邊形組成（圖1a）。種臍處種皮表面粗糙，未觀察到角質(zhì)層，中央縱向有1條臍溝（圖1b）。

豌豆種子種皮橫斷面結(jié)構(gòu)可分為4層（圖1c）。最外1層為角質(zhì)層，是植物中一種蠟狀高度復(fù)雜的脂肪性物質(zhì)。角質(zhì)層下面是柵欄層，由徑向長形、柵欄狀細胞鑲嵌排列緊密連接而成［4］，厚度為84.4～102.9 μm。第3層結(jié)構(gòu)為墊狀物，結(jié)構(gòu)致密，厚度為20.6～53.5μm。最下面是薄壁組織層，由薄壁細胞疏松排列而成，可使水分快速穿過。

豌豆種子過種臍種皮橫斷面可分為5層（圖1d）。對列柵欄層，上下柵欄層厚度分別為27.4～40.4μm和42.6～61.3μm。對列柵欄層在靠近管胞結(jié)構(gòu)處，逐漸變薄，直至消失。管胞結(jié)構(gòu)（最厚可達441.0μm，最寬可達272.0μm）在橫斷面上呈橢圓形，孔隙較大且疏松，在臍溝（寬36.5μm）處直接暴露于空氣。星狀組織分布于管胞結(jié)構(gòu)兩側(cè)，在靠近

圖1 豌豆種皮結(jié)構(gòu)掃描電鏡照片

圖2 不同酸蝕時間豌豆種子照片

圖3 不同酸蝕時間豌豆種子種皮結(jié)構(gòu)掃描電鏡照片

管胞處最厚，厚度可達257.0μm。最下面一層為薄壁組織，厚度約為183.0μm。管胞結(jié)構(gòu)、星狀組織和薄壁組織較疏松，有利于水分的輸送。

2.2 酸蝕對豌豆種子種皮的影響

豌豆種子隨濃硫酸腐蝕時間延長，種子表面褐色斑點增多（圖2）。

經(jīng)濃硫酸腐蝕5min的豌豆種子，其種臍處表面幾乎無裂縫（圖3a），而酸蝕20，40，60min種子的種臍裂縫逐漸增多且臍溝加寬（圖3c，e和g）。對于種皮橫斷面，濃硫酸腐蝕5min的豌豆種子幾乎無裂縫（圖3b），而隨著酸蝕時間的增加，種子的柵欄層、星狀組織、管胞結(jié)構(gòu)以及薄壁組織逐漸遭到破壞（圖3d，f和圖3h）。

在每一個時間段豌豆種子的吸水率均為酸蝕0min＞酸蝕5min＞酸蝕20min＞酸蝕40min。酸蝕60min與酸蝕0min的種子在浸水2h后吸水率沒有顯著差異。但隨著浸水時間的延長，酸蝕0min的種子吸水率迅速上升，吸水8h已達到96.58%，增速8.43%／h。而酸蝕60min的種子在浸水8h后吸水率為74.15%，增速僅為3.82%／h。

表1 不同酸蝕處理時間豌豆種子的吸水率

2.3 豌豆種皮細胞壁成分

豌豆種皮結(jié)構(gòu)經(jīng)碘－氯化鋅溶液染色呈棕色，鹽酸間苯三酚試劑反應(yīng)染成桃紅色，蘇丹Ⅳ酒精飽和溶液染色呈紫紅色。由此可推測豌豆種皮細胞壁中含有較多的纖維素、木質(zhì)素和角質(zhì)。

圖4 豌豆種皮紅外光譜圖

紅外光譜分析法鑒定細胞壁成分參照謝晶曦［6］、徐榮等［7］和張曉斌等［8］的分析方法。2 889.65cm 附近為飽和C－H鍵的特征吸收峰，主要是細胞壁中蛋白質(zhì)、纖維素和果膠等成分（圖4）。1 643.70cm 附近是細胞壁蛋白質(zhì)上的C＝O（酰胺Ⅰ帶）。1 538.72cm附近主要是蛋白質(zhì)上N－H振動吸收峰（酰胺Ⅱ帶）。1 261.73cm 附近是蛋白質(zhì)酰胺 Ⅲ 帶。1 430.89 和1 384.13cm附近屬纖維素中甲基的特征吸收峰，1 055.28cm附近為纖維素糖鏈中C－C和 C－O鍵的吸收峰。613.90cm附近為含硫化合物或脂肪族硝基、亞硝基化合物。由此可知，豌豆種皮中主要含有纖維素、果膠、蛋白質(zhì)等成分。

2.4 豌豆吸水率與皮殼率

豐優(yōu)1號與中豌3號的飽和吸水率分別達到100.59%和101.35%，顯著高于甬苗豌豆（表2）。3個豌豆品種的皮殼率不同，品種間存在顯著性差異（表2）。皮殼率由高到低依次為中豌3號（8.76%）、豐優(yōu)1號（7.78%）和甬苗豌豆（6.80%）。

表2 3個豌豆品種的吸水率和皮殼率

2.5 豌豆種皮中含碳化合物和礦物元素含量

不同品種種皮中含碳化合物和礦質(zhì)元素含量存在一定差異（表3）。豐優(yōu)1號的Ca元素含量顯著高于中豌3號和甬苗豌豆，中豌3號的Fe元素顯著高于豐優(yōu)1號和甬苗豌豆，甬苗豌豆的K元素則顯著低于豐優(yōu)1號和中豌3號。

表3 3個豌豆品種種皮中含碳化合物和礦質(zhì)元素含量（%）

2.6 豌豆種子皮殼率、含碳化合物及礦物元素含量與種子吸水率的相關(guān)性分析

對3個品種種子皮殼率、種皮中各成分含量和種子吸水率進行相關(guān)性分析，表明種子皮殼率與吸水率呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.89（表4）。種皮中K、Fe與種子吸水率呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0.94和0.97。Ca元素與種子吸水率呈顯著正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.70。含碳化合物、Sr元素與種子吸水率呈極顯著負相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為－0.94和－0.82。

表4 豌豆種皮中各成分與種子吸水率之間的相關(guān)系數(shù)

3 討論與結(jié)論

3.1 豌豆種皮結(jié)構(gòu)與種子透水性的關(guān)系

種皮紋理特征可穩(wěn)定遺傳，是植物長期系統(tǒng)進化的結(jié)果［9］，可用作物種鑒定指標，為分析不同物種的進化及親緣關(guān)系提供可行性方法［10］。一個多世紀以前就有學(xué)者提出，種皮結(jié)構(gòu)影響種子透性。影響種皮透性的因素主要位于種皮的角質(zhì)層以及厚壁的柵欄層［11］。本研究掃描電鏡觀察種皮結(jié)構(gòu)、酸蝕種子吸水率、鑒定種皮細胞壁成分只用了豐優(yōu)1號種子的結(jié)果，其余2個品種具類似結(jié)果。

一般認為，種皮表面角質(zhì)層是阻擋水分進入種子的第1道屏障，因為其結(jié)構(gòu)致密，且由蠟質(zhì)等疏水物質(zhì)組成。其次，柵欄層結(jié)構(gòu)堅硬致密，無細胞間隙，是水分進入的主要障礙。種臍處的特殊結(jié)構(gòu)使它成為吸收水分的主要通道。種臍橫斷面結(jié)構(gòu)中沒有角質(zhì)層，且臍溝處孔隙較大的管胞結(jié)構(gòu)直接與空氣接觸，星狀組織和薄壁組織也是排列疏松的結(jié)構(gòu)，使得水分、化學(xué)物質(zhì)的吸收以及空氣的流通易于進行。

種子酸蝕處理的目的是得到種臍和種皮結(jié)構(gòu)受損的研究材料。不同酸蝕時間處理豌豆種子發(fā)現(xiàn)，隨酸蝕時間延長，種臍和種皮被破壞程度加深，各時間段種子吸水率基本都低于對照。Cai等對新鮮豌豆的收縮特性和復(fù)水特性進行研究發(fā)現(xiàn)，種皮不僅阻礙水分由內(nèi)向外運動也阻礙水分由外向內(nèi)運動［12］。完整的未經(jīng)破壞的種子，其吸水的主要部位是種臍，且由于種皮完整不易失水，因而種子有較高的吸水率。而一旦種子的種臍和種皮均被破壞，水分進出種子的障礙被解除，種子更容易吸水，但失水同樣加劇，最終導(dǎo)致吸水率下降。因此，種子種臍與種皮的完整性對種子吸水保水至關(guān)重要。

3.2 豌豆種皮細胞壁成分與種子透水性的關(guān)系

本研究表明，豌豆種皮細胞壁中主要含有纖維素、木質(zhì)素、角質(zhì)、蛋白質(zhì)、果膠等成分。其中纖維素是植物細胞壁的主要組成成分，常伴生著木質(zhì)素等其他物質(zhì)，使細胞壁具有高強度和抗化學(xué)降解的能力。孫群等認為，粗纖維的大量積累增加了種皮的機械強度和不透水性［2］。木質(zhì)素使細胞相連，增加細胞壁的抗壓強度，強化植物組織。梁艷麗等認為，種皮中木質(zhì)素含量影響著種皮的厚度及堅硬度［13］。角質(zhì)是植物角質(zhì)層的主要成分，而作為種皮最外側(cè)的堅密的角質(zhì)層，是妨礙水分滲入種內(nèi)，造成種子硬實的重要原因之一［14］。

3.3 豌豆種皮皮殼率與種子透水性的關(guān)系

種皮是由珠被發(fā)育而來的套被狀結(jié)構(gòu)，包圍在胚和胚乳之外，是種子的重要組成部分之一，具有保護種胚和吸水保水的作用［15］。通過將3個豌豆品種的皮殼率與種子吸水率作相關(guān)性分析表明，種皮確實對種子透水性產(chǎn)生影響。皮殼率越高，吸水率越高，表明種子透水性越好。

3.4 豌豆種皮中含碳化合物、礦物元素與種子透水性的關(guān)系

周勁松認為，Ca、Si、K、Mg等元素含量可能與種皮硬度有關(guān)［16］。孫群等認為，Ca元素的大量積累增加了種皮的機械強度，是硬實種子的特征之一［2］。本試驗通過對3個豌豆品種種皮中各成分含量與種子吸水率作相關(guān)性分析表明，種皮中K、Fe、Ca元素的積累可能有利于豌豆種子的透水性，而種皮中含碳化合物和Sr元素的存在可能阻礙種子的透水性。由此可見，不同作物類型種子透水性的影響因素可能并不完全一致。

綜上所述，豌豆種子的透水性受到多種因素的影響，涉及到種子的種皮結(jié)構(gòu)、種皮成分、皮殼率等。種皮結(jié)構(gòu)中角質(zhì)層和柵欄層是阻礙水分進入的主要因素，種臍是水分進入種子的主要通道。種皮成分中纖維素、木質(zhì)素、角質(zhì)、含碳化合物和Sr元素的積累都會增加種皮的機械強度，從而降低種子的透水性，而種皮中K、Fe、Ca元素的積累可能有利于種子的透水性。此外，皮殼率越高，種子的透水性越好，且保持種子種皮完整性對種子吸水保水具有重要作用。

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