蔡 明， 張美艷， 牟 蘭， 薛祝林， 岳信龍， 黃必志

（1.蘭州大學草地農(nóng)業(yè)科技學院， 甘肅 蘭州730020； 2.云南省草地動物科學研究院， 昆明650212；3.中國農(nóng)業(yè)大學動物科技學院， 北京100019； 4.云南農(nóng)業(yè)大學動物科技學院， 昆明650201）

紅三葉（Trifolium pratense L.）原產(chǎn)于歐洲西南部，又名三葉草、金菜花、紅荷蘭翹搖等［1－4］，是一種優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、高效的放牧型優(yōu)良牧草［5－8］?；凶饔猛ǔＪ侵参镌谠馐芡饨绺蓴_時，為了避免或者減緩干擾的一種自然競爭適應(yīng)策略。紅三葉對周圍植物具有極強的化感作用，它會通過莖葉的揮發(fā)、淋溶及根系分泌等途徑向環(huán)境中分泌出多種異黃酮類物質(zhì)［9－10］，這些物質(zhì)會對周邊植物的生長發(fā)育起到抑制作用，從而實現(xiàn)自身種群的保護。許多學者對紅三葉對其他植物的化感作用進行了大量研究［11－14］，但對自身化感影響的研究較少。近年來，隨著連作障礙問題的頻繁發(fā)生［15－18］，牧草化感物質(zhì)對自身作用機制研究更顯得極為迫切。

本試驗為闡明紅三葉對自身種子的化感作用機理，研究了紅三葉葉片浸提液對自身種子發(fā)育（發(fā)芽率、發(fā)芽勢、胚根長、下胚軸長）的影響，確定葉片浸提液是否對自身種子萌發(fā)具有化感影響及強度大小，以期為實現(xiàn)紅三葉的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)提供理論依據(jù)。

表1 試驗地概況

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供體植物和受體種子均為普通紅三葉，采自云南省昆明小哨牧場。

1.2 試驗地概況

1.3 試驗方法

1.3.1 采樣及浸提液制備

采集新鮮紅三葉植株，置于便攜冰箱帶回實驗室。迅速采摘下葉片，刷凈灰土，去除枯黃葉，剪切3～4 mm小段；按1g鮮重葉片∶4mL水的比例用無菌蒸餾水在18～20℃室溫下震蕩浸泡48h后，用滅菌紗布和雙層濾紙進行過濾，再用0.45μm微孔濾膜過濾得到0.25g／mL濃度的浸提母液。將母液分別用無菌蒸餾水稀釋 為 0.025，0.05，0.075，0.10，0.15，0.20g／mL不同濃度后，存于4℃冰箱。每個培養(yǎng)皿（Φ9 cm）鋪2層濾紙，分別加入5mL各濃度浸提液，無菌蒸餾水為對照。

1.3.2 種子萌發(fā)及生物檢測方法

選取大小均勻的紅三葉種子，用10%的H2O2消毒5min，再用無菌蒸餾水沖凈，均勻排列于備好的培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿50粒，上蓋封好。前3d置于恒溫培養(yǎng)箱發(fā)芽（25℃黑暗，70%RH）；從第4天開始，改為20℃黑暗12h，25℃光照12h。每天開蓋透氣10min，并記錄發(fā)芽數(shù)（胚根突破種皮2mm時為發(fā)芽）；每隔3d固定補充適量紅三葉水浸提液或無菌蒸餾水1次，每個處理3次重復(fù)。第7天分別隨機從各培養(yǎng)皿中抽取10～15株幼苗測定其胚根長、下胚軸長。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

用SPSS 20.0進行方差分析（One－way ANOVA）和Duncan描述法分析數(shù)據(jù)。

發(fā)芽勢（%）＝3d正常發(fā)芽的種子數(shù)／供試種子總數(shù)×100%；

發(fā)芽率（%）＝發(fā)芽種子數(shù)／供試種子總數(shù)×100%；

化感指數(shù) RI＝1－C／T（當T≥C 時）；RI＝T／C－1（當T＜C時），其中：C 指對照值，T 指處理值，RI＞0表示促進作用，RI＜0表示抑制作用，RI絕對值的大小與化感作用強度一致。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度葉浸提液對紅三葉種子發(fā)芽勢的影響

不同濃度葉浸提液對紅三葉種子發(fā)芽勢的化感作用表現(xiàn)不盡一致，既有促進作用又有抑制作用（表2）。其中，低濃度0.025g／mL葉浸提液對種子發(fā)芽勢起促進作用，化感指數(shù)為0.02，且與最高濃度0.20g／mL處理的種子發(fā)芽勢差異極顯著（p＜0.01），與0.05，0.15 g／mL處理下的種子發(fā)芽勢差異顯著（p＜0.05）；最高濃度0.20g／mL對種子發(fā)芽勢的抑制作用最大，化感指數(shù)為－0.31，與對照差異極顯著（p＜0.01）；0.075～0.20g／mL范圍內(nèi)，葉浸提液對種子發(fā)芽勢的抑制作用隨著濃度增大而增大。

表2 不同濃度葉浸提液對紅三葉種子發(fā)芽勢的影響

2.2 不同濃度葉浸提液對紅三葉種子發(fā)芽率的影響

不同濃度葉浸提液對紅三葉種子發(fā)芽率均表現(xiàn)出抑制作用（表3）。其中：濃度0.050g／mL 和0.20 g／mL葉浸提液對種子發(fā)芽率抑制作用較大，化感指數(shù)在－0.13；0.050～0.10g／mL范圍內(nèi)，葉浸提液對種子發(fā)芽率抑制作用隨濃度增大而減小，而在0.10～0.20 g／mL范圍內(nèi)，葉浸提液對種子發(fā)芽率抑制作用隨著濃度增大而增大。

2.3 不同濃度葉浸提液對紅三葉種子胚根長的影響

不同濃度葉浸提液對紅三葉種子胚根的生長發(fā)育均為抑制作用（表4）。其中：最高濃度0.20g／mL對幼根的抑制作用最大，化感指數(shù)為－0.75，與對照差異極顯著（p＜0.01），且與最低濃度0.025g／mL處理下的胚根長差異極顯著（p＜0.01）；0.050～0.20g／mL處理下的胚根長與對照、最低濃度0.025g／mL差異極顯著（p＜0.01）；濃度達到一定臨界值時，抑制作用會變小或變大。

表3 不同濃度葉浸提液對紅三葉種子發(fā)芽率的影響

表4 不同濃度葉浸提液對紅三葉種子胚根長的影響

2.4 不同濃度葉浸提液對紅三葉下胚軸長的影響

表5 不同濃度葉浸提液對紅三葉下胚軸長的影響

不同濃度葉浸提液對紅三葉下胚軸長的影響不盡相同（表5）。其中：僅有0.050g／mL和0.20g／mL處理的下胚軸長受到抑制，其余處理均表現(xiàn)為促進作用；0.050g／mL的抑制作用較大，化感指數(shù)為－0.03，與0.025，0.15g／mL處理下的下胚軸長差異顯著（p＜0.05）；最低濃度0.025g／mL的促進作用最大，化感指數(shù)為0.19，與對照差異顯著（p＜0.05），且與0.050，0.20 g／mL差異顯著（p＜0.05）；0.075～0.15g／mL區(qū)間內(nèi)，葉浸提液對下胚軸長產(chǎn)生了促進作用，且隨著濃度的增加促進作用增大，濃度達到0.15g／mL時，化感指數(shù)為0.15。

3 討論與結(jié)論

有研究表明，紅三葉對許多植物具有強烈的化感作用，從而形成穩(wěn)固的種群，維護自身的繁衍和生息，與本研究結(jié)果一致［11，19－21］。本試驗結(jié)果表明，紅三葉不但對其他植物具有化感作用，而且對自身種子發(fā)育也有化感作用。發(fā)芽勢和發(fā)芽率是植物種子發(fā)育的重要指標，常用來評價種子的發(fā)芽速度和整齊度［22－23］；從發(fā)芽勢和發(fā)芽率這2個指標來看，不同濃度葉浸提液對紅三葉種子發(fā)芽勢既有促進作用又有抑制作用，大致表現(xiàn)為“低促高抑”的影響。而葉浸提液對種子發(fā)芽率具有抑制作用，且在一定的濃度區(qū)間內(nèi)具有濃度效應(yīng)。植物的胚根發(fā)育的好壞，直接關(guān)系著種子萌發(fā)的營養(yǎng)攝入狀況。從胚根生長發(fā)育指標來看，不同濃度葉浸提液對紅三葉種子胚根的生長發(fā)育均具有極強的抑制作用，本試驗選取的最高濃度為0.20g／mL，與對照差異極顯著（p＜0.01）。依此推斷，隨著濃度的加大，抑制作用會更強。試驗中還發(fā)現(xiàn)，在不同濃度處理后，紅三葉種子的根部出現(xiàn)上卷的現(xiàn)象（圖1），這很容易進一步導(dǎo)致敗育，由此可知，導(dǎo)致紅三葉生物量下降的原因之一是化感物質(zhì)通過對根部的抑制影響其對營養(yǎng)成分的吸收，進而影響地上營養(yǎng)體的生長?？梢姼繉形镔|(zhì)的反應(yīng)比較敏感，所以今后在實際生產(chǎn)中一定要注意化感物質(zhì)對根部的調(diào)節(jié)作用，減少根部與化感物質(zhì)的接觸。種子發(fā)育可以依靠下胚軸來頂破土壤進行生長?？梢娤屡咻S的健康生長與否，對植物生長意義非常重大。本試驗0.075～0.15g／mL處理過的種子下胚軸長隨著濃度增加而不斷增大，當濃度達到0.20g／mL時，這種促進作用轉(zhuǎn)化為了抑制作用，說明葉浸提液在一定濃度范圍內(nèi)對下胚軸長產(chǎn)生了“低促高抑”作用。

紅三葉在栽培生產(chǎn)中，其殘茬葉片在土壤中經(jīng)過多長時間可以分泌出化感物質(zhì)，這些物質(zhì)在經(jīng)過淋溶和分解后進入土壤，又要經(jīng)過一個怎樣的反應(yīng)過程，是否會對化感強度產(chǎn)生影響，還有待進一步的研究。本試驗只是在室內(nèi)通過種子發(fā)芽試驗檢測了紅三葉對自身種子的化感作用，而大田土壤環(huán)境因素十分復(fù)雜［24－26］，因此，今后有必要結(jié)合實際，在大田或者花盆中進行砂培實驗，以對紅三葉的化感作用做進一步深入的研究。

［1］宋超，靳曉麗，田新會，等.不同紅三葉品種在蘭州地區(qū)的適應(yīng)性評價［J］.草地學報，2012，20（4）：657－661.

［2］韓烈保，楊碚，鄧菊芬.草坪草種及品種［M］.北京：中國林業(yè)出版社，1999：133－135.

［3］曾分有.富硒紅三葉草的生理功能及其機制探討［D］.湖南農(nóng)業(yè)大學，2007.

［4］陳學福，史高峰.紅三葉異黃酮的研究進展［J］.中草藥，2006，37（2）：309－312.

［5］俞聯(lián)平，李發(fā)弟，程文定，等.鉬播種量和行距對岷山紅三葉產(chǎn)量及異黃酮含量的影響［J］.中國草地學報，2009，31（1）：52－57.

［6］王元素，洪紱曾，蔣文蘭，等.喀斯特地區(qū)紅三葉混播草地群落對長期適度放牧的響應(yīng)［J］.生態(tài)環(huán)境，2007，16（1）：117－124.

［7］蔡明，牟蘭，黃必志.紅三葉地上部分浸提液對幼根和幼苗的化感效應(yīng)［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學，2014，42（8）：206－207.

［8］牟蘭，李榮，蔡明，等.紅三葉根浸提液的化感潛力初探［J］.山地農(nóng)業(yè)生物學報，2014，33（3）：42－45.

［9］Kroyer G.T.Red clover extract as antioxidant active and functional food ingredient［J］.Innovative Food Science ＆Emerging Technologies.2004，5（1）：101－105.

［10］李博.生態(tài)學［M］.北京：高等教育出版社，2000：97－99.

［11］劉蘇嬌，趙國琦，鄔彩霞，等.幾種豆科牧草水浸提液對多花黑麥草化感作用的機理研究［J］.草地學報，2013，21（6）：1 182－1 187.

［12］鄔彩霞.幾種豆科牧草化感作用的比較研究［D］.南京農(nóng)業(yè)大學，2007.

［13］李志華，沈益新，倪建華，等.豆科牧草化感作用初探［J］.草業(yè)科學，2002，19（8）：28－31.

［14］皇甫超河，陳冬青，王楠楠，等.外來入侵植物黃頂菊與四種牧草間化感互作［J］.草業(yè)學報，2010，19（4）：22－32.

［15］夏方山，閆慧芳，王明亞，等.紫花苜蓿連作對土壤理化性質(zhì)影響的研究進展［J］.中國草食動物科學，2015，35（2）：48－51.

［16］尤垂淮，高峰，王峰吉，等.連作對云南烤煙根際微生態(tài)及煙葉產(chǎn)質(zhì)量的影響［J］.中國煙草學報，2015，21（1）：60－67.

［17］孫雪婷，李磊，龍光強，等.三七連作障礙研究進展［J］.生態(tài)學雜志，2015，34（3）：885－893.

［18］張麗瓊，郝明德，臧逸飛，等.苜蓿和小麥長期連作對土壤酶活性及養(yǎng)分的影響［J］.應(yīng)用生態(tài)學報，2014，25（11）：3 191－3 196.

［19］安培坤，王引權(quán)，竇莉莉，等.岷山紅三葉莖葉水浸液對3種植物種子萌發(fā)及幼苗生長的影響［J］.草業(yè)科學，2012，29（6）：960－963.

［20］李志華，沈益新.紅三葉莖葉對幾種牧草種子及幼苗的化感作用［J］.中國草地，2005，27（3）：41－43.

［21］郭曉霞，沈益新，李志華.幾種豆科牧草地上部水浸提液對稗草種子和幼苗的化感效應(yīng)［J］.草地學報，2006，14（4）：356－359.

［22］張舟，鄔忠康，陳志成，等.鹽脅迫對4個品種豇豆種子萌發(fā)的影響［J］.種子，2014，33（3）：19－24.

［23］蔡明，牟蘭，王宗禮，等.不同濃度花浸提液對紅三葉種子化感作用研究［J］.種子，2014，33（12）：33－36.

［24］李玉占，梁文舉，姜勇.苜蓿根際土壤化感潛力的初步研究［J］.土壤通報，2004，35（6）：776－779.

［25］肖輝林，彭少麟，鄭煜基，等.植物化感物質(zhì)及化感潛力與土壤養(yǎng)分的相互影響［J］.應(yīng)用生態(tài)學報，2006，17（9）：1 747－1 750.

［26］吳林坤，林向民，林文雄.根系分泌物介導(dǎo)下植物－土壤－微生物互作關(guān)系研究進展與展望［J］.植物生態(tài)學報，2014，38（3）：298－310.