于 卓， 李 巖， 于肖夏， 閆文芝， 郝治滿， 宋昌海， 姜 超

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 呼和浩特010019；2.內(nèi)蒙古巴彥淖爾市農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院， 內(nèi)蒙古 巴彥淖爾015000）

馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）是重要的糧菜兼用型作物，也是優(yōu)良的飼料作物［1－2］。內(nèi)蒙古地處北疆，海拔高，風(fēng)速大，氣候冷涼，日照充足，雨熱同季，傳毒媒介少，具有優(yōu)越的生產(chǎn)馬鈴薯的自然環(huán)境條件，是我國馬鈴薯商品薯和種薯的重要產(chǎn)地之一，但近年來因馬鈴薯連作普遍、病害嚴(yán)重，導(dǎo)致該地區(qū)馬鈴薯產(chǎn)量和品質(zhì)低下，亟待培育抗病抗性強(qiáng)、適應(yīng)性廣的馬鈴薯優(yōu)良品種［3］。為培育抗病性強(qiáng)、品質(zhì)好、產(chǎn)量高、薯型好的馬鈴薯新品種，根據(jù)優(yōu)缺點(diǎn)互補(bǔ)和生態(tài)型差異大的親本選配原則，用引自美國的廣譜抗病性強(qiáng)的四倍體（2n＝4x＝48）野生馬鈴薯材料 YSP－4作母本，國內(nèi)育成的產(chǎn)量高、品質(zhì)好、抗晚疫病能力強(qiáng)的馬鈴薯品種隴薯7號(hào)作父本，人工去雄授粉雜交，成功獲得YSP－4×隴薯7號(hào)雜種F1代群體，進(jìn)而通過主要農(nóng)藝性狀觀測和單株選擇，選育出田間抗病性強(qiáng)、綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良的4個(gè)無性株系：株系3、株系5、株系6、株系12，其薯塊各具特色［4］。

SSR（Simple Sequence Repeat）分子標(biāo)記具有重復(fù)性好、多態(tài)性豐富和共顯性的優(yōu)點(diǎn)，已應(yīng)用于植物的基因定位、雜種真實(shí)性鑒定、分子遺傳連鎖圖譜構(gòu)建及遺傳多樣性分析等方面［5－8］，本試驗(yàn)擬利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)這4個(gè)優(yōu)良株系進(jìn)行DNA指紋鑒定，并分析評(píng)價(jià)其產(chǎn)量及營養(yǎng)品質(zhì)，選出最佳的株系，旨在為育成馬鈴薯新品種提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為YSP－4×隴薯7號(hào)雜交組合中選育出的優(yōu)良株系3、株系5、株系6、株系12及其雙親，原種由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)馬鈴薯育種研究中心提供。各材料的塊莖特征如表1所示。

表1 供試材料的薯塊特性

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)地概況及種植方法

試驗(yàn)于2014年4—9月在呼和浩特市賽罕區(qū)內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)場的網(wǎng)棚中進(jìn)行，土壤為沙壤質(zhì)栗鈣土，pH＝8.0，肥力適中，具灌水條件。親本和各雜種材料均采用單粒播種，種薯級(jí)別為原種，種植深度為12cm，株距為25cm，行距80cm，當(dāng)植株長到15～20cm時(shí)進(jìn)行中耕培土。以馬鈴薯專用復(fù)合肥作基肥，用量50 kg／667m2，并在塊莖形成期一次性追施氮肥10kg／667m2，生長期間保證植株正常生長對(duì)水分的需求。

1.2.2 產(chǎn)量性狀的測定

收獲時(shí)，每個(gè)材料隨機(jī)選取30個(gè)單株觀測單株結(jié)薯數(shù)、單株塊莖產(chǎn)量及單株商品薯率3個(gè)性狀。其中，商品薯率用不同重量薯塊的數(shù)量表示，即薯塊重＜100g記為小薯，薯塊重≥100g記為大中薯，商品薯率（%）＝大中薯數(shù)／單株結(jié)薯數(shù)×100%。

1.2.3 薯塊營養(yǎng)品質(zhì)性狀的測定

收獲后1周內(nèi)，各株系選取重量為150～200g的薯塊測定營養(yǎng)品質(zhì)性狀，主要包括干物質(zhì)、淀粉、粗蛋白、還原糖、維生素C及酚類物質(zhì)的含量。

干物質(zhì)含量測定采用烘干法，重復(fù)3次，干物質(zhì)含量（%）＝薯塊的干重／薯塊的鮮重×100%。用碘比色方法測定淀粉的含量，重復(fù)5次。用硝基水楊酸比色方法測定還原糖的含量，重復(fù)4次。用2，6－二氯靛酚滴定方法測定維生素C的含量，重復(fù)6次。粗蛋白測定采用雙縮脲法，3次重復(fù)。酚類物質(zhì)測定采用Folin－酚比色法，6次重復(fù)。各指標(biāo)測定方法均參考張永成、田豐編著的《馬鈴薯試驗(yàn)研究方法》［9］。

1.2.4 SSR試驗(yàn)方法

1）DNA提取與檢測：取各材料苗期的嫩葉，用基因組試劑盒提取其DNA（北京天根公司），其純度用1.2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，將符合純度要求的DNA置－20℃冰箱中備用。

2）SSR－PCR的反應(yīng)體系和程序：體系為2.0μL的10×Buffer，0.225mmol／L 的 dNTPs 1.4μL，60ng／L的模板 DNA 1.0μL，1.5mmol／L 的 Mg2＋1μL，Taq DNA聚合酶0.09μL，0.5μmol／L的上下游引物各0.6μL，ddH2O 13.11μL。程序?yàn)?4℃預(yù)變性4min，1個(gè)循環(huán)；94℃變性30s，56℃退火45s，72℃延伸90s，共34個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min，1個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，每個(gè)反應(yīng)體系中加入6.0 μL的變性緩沖液，94℃變性處理5min后迅速取出冰浴冷卻至室溫［10］。

3）電泳和銀染檢測：擴(kuò)增產(chǎn)物用6%的變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，上樣量為5μL，時(shí)間為1.5h。將電泳后的膠板用蒸餾水漂洗2min，在染色液中銀染12min，取出后蒸餾水速漂，顯影液中顯影至條帶清晰時(shí)用蒸餾水漂洗2min，膠板在室內(nèi)涼干后照相［11］。

4）引物的篩選：將公布在NCBI網(wǎng)站上的76對(duì)特異性馬鈴薯SSR引物，由上海生工有限公司合成堿基序列，以雙親的DNA作模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從中選出條帶穩(wěn)定清晰、多態(tài)性良好的SSR適宜引物2對(duì)（表2），用于各雜種優(yōu)良株系的SSR指紋鑒定［12］。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)量性狀表現(xiàn)

各雜種株系的單株結(jié)薯數(shù)、單株產(chǎn)量和商品薯率存在一定差異（表3）。單株結(jié)薯數(shù)介于7.00～8.80個(gè)之間，以株系5較多，為8.80個(gè)，接近其父本隴薯7號(hào)。單株產(chǎn)量變幅為0.96～1.35kg，高低順次為株系12＞株系6＞株系5＞株系3。各雜種株系單株的商品結(jié)薯率變幅為78.04%～93.14%，株系12的商品薯率最高，株系5最低。綜合3項(xiàng)指標(biāo)看，以株系12的產(chǎn)量性狀表現(xiàn)最好，其次為株系6。

表2 適宜SSR引物及其堿基序列

表3 供試材料單株的結(jié)薯數(shù)、產(chǎn)量和商品薯率比較

2.2 營養(yǎng)品質(zhì)性狀表現(xiàn)

由表4可知，母本YSP－4的薯塊干物質(zhì)含量為23.07%，父本比母本高1.72%，差異顯著。各雜種株系間的薯塊干物質(zhì)含量均存在一定差異，變幅為16.77%～24.85%，以株系6為最高，株系3次之，株系12再次之，株系5最低。

淀粉含量在各雜種株系間的變幅為12.27%～20.77%，株系6最高，為高淀粉株系；Vc含量在1.61～6.16mg／100g之間，以株系 12最高。還原糖含量變幅為0.018%～0.028%，均介于雙親之間，遠(yuǎn)低于馬鈴薯作為加工用不超過0.1%的要求，4個(gè)優(yōu)良株系塊莖的蛋白質(zhì)含量變幅為0.97%～1.20%，以株系6最高。

馬鈴薯塊莖中的酚類物質(zhì)是重要的抗氧化劑，具有重要的保健功能。本試驗(yàn)結(jié)果表明，各雜種株系的酚類物質(zhì)含量分布在0.35%～0.69%之間，差異顯著，其中株系12最高、株系5最低。

從以上6項(xiàng)指標(biāo)綜合看，株系6的營養(yǎng)品質(zhì)最好，且為高淀粉株系（≥20%）；其次為株系12。

2.3 SSR指紋差異

2.3.1 基因組DNA質(zhì)量檢測

4個(gè)雜種株系及其雙親的DNA電泳條帶清晰穩(wěn)定，無彌散及拖尾等現(xiàn)象，表明各材料的基因組DNA質(zhì)量高，符合SSR標(biāo)記分析對(duì)DNA純度的要求（圖1）。

圖1 各材料基因組DNA純度的電泳檢測

2.3.2 SSR擴(kuò)增結(jié)果

用篩選出的S 118和S 174這2對(duì)SSR適宜引物，對(duì)4個(gè)雜種株系及其雙親的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，2對(duì)引物共擴(kuò)增出15個(gè)穩(wěn)定清晰的SSR位點(diǎn)，每對(duì)引物平均為7.5個(gè)，其中多態(tài)性位點(diǎn)10個(gè)，多態(tài)性位點(diǎn)比率占66.67%（表5），表明6個(gè)供試材料間的遺傳多態(tài)性較豐富。從圖2可以看出，6個(gè)材料間的SSR指紋特征均有一定差異，每對(duì)引物都能清晰地識(shí)別出各雜種株系和其親本，這為雜種株系鑒定及馬鈴薯新品種的育成登記提供了重要的DNA分子依據(jù)。

圖2 6個(gè)材料用引物S 174和S 118擴(kuò)增的SSR指紋圖

表4 供試材料營養(yǎng)品質(zhì)性狀的比較

表5 2對(duì)引物對(duì)6個(gè)供試材料基因組DNA的SSR擴(kuò)增結(jié)果

3 結(jié) 論

4個(gè)馬鈴薯雜種優(yōu)良株系中，以株系12和株系6的產(chǎn)量及營養(yǎng)品質(zhì)性狀表現(xiàn)較為突出，分別為高產(chǎn)株系和高淀粉株系。

試驗(yàn)篩選出2對(duì)SSR適宜引物S 174和S 118，對(duì)6個(gè)材料PCR擴(kuò)增得到10個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，其多態(tài)性位點(diǎn)百分率為66.67%；構(gòu)建了能識(shí)別出4個(gè)馬鈴薯雜種株系和其親本的SSR指紋圖，為馬鈴薯新品種的育成和利用提供了分子依據(jù)。

［1］牛秀群，李金花，張俊蓮，等.甘肅省干旱灌區(qū)連作馬鈴薯根際土壤中刀菌的變化［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2011，20（4）：136－243.

［2］金黎平，屈冬玉，謝開云，等.我國馬鈴薯種質(zhì)資源和育種技術(shù)研究進(jìn)展［J］.種子，2003，22（5）：99－101.

［3］張自強(qiáng)，于肖夏，鞠天華，等.2個(gè)馬鈴薯雜交組合F1的SSR鑒定［J］.中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，21（11）：1 411－1 415.

［4］郝志滿.YSP－4與隴薯7號(hào)雜種F1優(yōu)異株系選育及SSR分析［D］.呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

［5］Ghislain M，Spooner DM，Rodriguez F，et al.Selection of highly informative and user－friendly microsatellites（SSRs）for genotyping of cultivated potato［J］.Theoretical and Applied Genetics，2004，108（5）：881－890.

［6］Haussmann B，Hess D，Seetharama N，et al.Construction of a combined sorghum linkage map from two recombinant inbred populations using AFLP，SSR，RFLP and RAPD markers and comparison with other sorghum maps［J］.Theoretical and Applied Genetics，2002，105（4）：629－637.

［7］Rocha E A，Paiva L V，Carvalho H H，et al.Molecular characterization and genetic diversity of potato cultivars using SSR and RAPD markers［J］.Crop Breeding and Applied Biotechnology，2010，10（3）：204－210.

［8］于卓，謝銳，于肖夏，等.低氫氰酸含量高丹草新品系及其親本的SSR分析［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2014，23（1）：223－228.

［9］張永成，田豐.馬鈴薯試驗(yàn)研究方法［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2007.

［10］溫賀，于肖夏，鞠天華，等.4個(gè)彩色馬鈴薯優(yōu)良株系及其親本的SSR分析［J］.種子，2014，33（5）：16－19.

［11］張自強(qiáng)，于肖夏，鞠天華，等.3個(gè)馬鈴薯雜種優(yōu)良株系的核型及 SSR 分 析 ［J］.西 北 植 物 學(xué) 報(bào)，2014，34（7）：1 318－1 324.

［12］李長青，于肖夏，鞠天華，等.馬鈴薯雜種F1的SSR鑒定［J］.西北植物學(xué)報(bào)，2012，32（7）：1 351－1 360.