劉先寶+蔡吉苗+陳奕鵬+李超萍+黃貴修

摘 要 測(cè)定一株香蕉內(nèi)生細(xì)菌BEB99發(fā)酵液的石油醚和乙酸乙酯粗提物對(duì)香蕉枯萎病菌4號(hào)生理小種的（FOC4）菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響，并測(cè)定粗提物中的主要成分。研究結(jié)果表明：其發(fā)酵液的石油醚和乙酸乙酯粗提物對(duì)香蕉枯萎病菌的菌絲生長和孢子萌發(fā)均具有明顯抑制作用，可造成病菌菌絲的畸形，抗菌物質(zhì)濃度為1.67 mg/mL時(shí)，其孢子萌發(fā)抑制率分別達(dá)到92.99%和82.96%。GC/MS分析從粗提物中鑒定到18個(gè)成分，其中主要成分包括油酸（14.98%）、油酸乙酯（11.38%）、亞麻油酸乙酯（14.86%）、亞油酸（13.20%）、棕櫚酸（11.36%）和棕櫚酸乙酯（11.26%），及一個(gè)未知化學(xué)成分。

關(guān)鍵詞 內(nèi)生細(xì)菌 ；尖孢鐮刀菌 ；揮發(fā)油 ；抑菌活性

分類號(hào) S453.121

Volatile Oil Constituents and Antimicrobial Activity of

Endophytic Bacteria Isolated from Banana

LIU Xianbao CAI Jimiao CHEN Yipeng LI Chaoping HUANG Guixiu

（Environment and Plant Protection Institute / Ministry of Agriculture Key Laboratory of

Integrated Pest Management on Tropical Crops / Hainan Key Laboratory for Monitoring and

Control of Tropical Agricultural Pests， CATAS， Haikou， Hainan 571101， China）

Abstract The petroleum ether and ethyl acetate crude extracts of endophytic bacteria strain BEB99 were got by solvent method， and were tested by agar disc diffusion method for their antimicrobial activities against Fusarium oxysporum （FOC4）. The results revealed that the crude extracts displayed strong inhibitory effect on the mycelial growth and spore germination of FOC4. The pathogenic hyphae grew in abnormal shape and produced sac. The inhibition rate of spore germination were 92.99 % and 82.96% respectively when the concentration of petroleum ether and ethyl acetate crude extracts reach to 1.67 mg/mL. Nineteen ingredients were identified from the petroleum ether crude extract of BEB99 by GC-MS analysis. The relative content of Oleic acid （14.98%）， Ethyl oleate （11.38%）， Linoleic acid （13.20%）， Ethyl linoleate （14.86%）， Palmitic acid （11.36%） and Ethyl palmitate （11.26%） were main composition.

Keywords endophytic bacteria ； Fusarium oxysporum ； volatile oil ；antifungal activities

由尖孢鐮刀菌古巴?；停‵usarium oxysporum f.sp.cubense，F(xiàn)OC） 侵染引起的香蕉枯萎病是危及香蕉產(chǎn)業(yè)發(fā)展的毀滅性病害。目前，生產(chǎn)上還未建立對(duì)香蕉枯萎病有效的防治方法。結(jié)合運(yùn)用農(nóng)業(yè)防治、生物防治等方法對(duì)香蕉枯萎病進(jìn)行綜合防控已成為國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)[1]。

植物內(nèi)生細(xì)菌是指存在于植物體內(nèi)或生活史的某一特定階段，存在于植物體內(nèi)而未引起明顯癥狀的細(xì)菌[2]。香蕉植株中存在豐富的內(nèi)生菌資源[3-4]，內(nèi)生細(xì)菌可通過固氮、溶磷、產(chǎn)鐵載體、產(chǎn)生長素等特性促進(jìn)植物生長，還可通過占據(jù)生態(tài)位、代謝產(chǎn)物抑制病原菌生長或誘導(dǎo)植物抗性等防治病害危害，在植物病害的防治方面有著很好的應(yīng)用前景[5-8]。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究工作中從香蕉根中分離到一株內(nèi)生細(xì)菌，經(jīng)形態(tài)和分子鑒定其為勞爾氏菌，盆栽實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該菌株具有一定促生和生防作用。本研究在此基礎(chǔ)上，以香蕉枯萎病菌作為靶標(biāo)菌，通過平板檢測(cè)分析內(nèi)生細(xì)菌揮發(fā)油成分對(duì)病原菌菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響，通過GC-MS技術(shù)分析其揮發(fā)油的化學(xué)成分。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

香蕉內(nèi)生細(xì)菌BEB99和香蕉枯萎病病菌尖孢鐮刀菌古巴?；?號(hào)生理小種（FOC4），均由本實(shí)驗(yàn)室分離和保存。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑

NA培養(yǎng)基、優(yōu)化培養(yǎng)基（4 g/L葡萄糖，1 g/L酸水解酪蛋白，0.5 ml/L的1 mol/L MgCl2，1 ml/L的1 mol/L CaCl2，pH 6.5）、PDA、PD培養(yǎng)液、石油醚、乙酸乙酯。

1.2 方法

1.2.1 BEB99菌株發(fā)酵液制備

將保存的內(nèi)生細(xì)菌BEB99菌株接入優(yōu)化平板培養(yǎng)基中，28℃，24 h進(jìn)行活化。將活化的BEB99菌株接入50 mL優(yōu)化的液體培養(yǎng)基中（150 mL三角瓶），28℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)36 h，制成種子液，再將種子液以7 %的接種量接入優(yōu)化培養(yǎng)液中，相同條件下培養(yǎng)36 h，制備BEB99菌株的發(fā)酵液。

1.2.2 BEB99菌株發(fā)酵產(chǎn)物分離

將濃縮的發(fā)酵產(chǎn)物用細(xì)胞超聲破碎儀破碎后，分別用石油醚、乙酸乙酯有機(jī)溶劑250 mL與發(fā)酵液等體積混合，在1 000 mL分液漏斗中反復(fù)顛倒振蕩30 min，使其萃取充分，靜止過夜，萃取3次，合并有機(jī)相，將有機(jī)相減壓濃縮成浸膏，用石油醚、乙酸乙酯溶劑定容，備用。

1.2.3 BEB99菌株發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性測(cè)定及其對(duì)菌絲生長影響

將FOC4在PDA平板上培養(yǎng)5 d，用無菌水洗下分生孢子，后用滅菌的紗布過濾除去菌絲體，配成濃度為1×107個(gè)/mL的孢子懸浮液。待PDA培養(yǎng)基冷卻至50℃，吸取孢子懸浮液與培養(yǎng)基以1：9的比例混勻后倒入培養(yǎng)皿制成帶菌平板。分別將石油醚、乙酸乙酯提取物稀釋至濃度為25 mg/mL，再將25 mg/mL的石油醚、乙酸乙酯提取物稀釋1、10、20和30倍，各取20 μL滴到滅菌的濾紙片（直徑9 mm）上。待吹干后放置帶菌平板中央，重復(fù)3次，以滴加石油醚和乙酸乙酯有機(jī)溶劑為對(duì)照，28℃培養(yǎng)，5 d后觀察濾紙片周圍有無抑菌圈及其大小。同時(shí)用解剖刀切取抑菌圈邊緣的菌絲置于載玻片上，以正常培養(yǎng)生長的菌絲為陰性對(duì)照，以含多菌靈培養(yǎng)基上培養(yǎng)的菌絲為陽性對(duì)照，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)變化。

1.2.4 BEB99菌株發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)FOC4菌株孢子萌發(fā)影響測(cè)定

抑制孢子萌發(fā)作用的測(cè)定采用懸滴法。分別取25 mg/mL的石油醚、乙酸乙酯相提取物5、10、15、20 μL到2 mL已滅菌的離心管里，待石油醚和乙酸乙酯溶劑揮干，分別用75 μL無菌水溶解，使提取物濃度分別為1.67、3.33、5.01、6.68 mg/mL。將FOC4孢子懸浮液與不同濃度的提取物等量混合，混勻后吸取20 μL滴加到水瓊脂上（水瓊脂事先滴在玻片上），待干后將玻片倒置放在墊有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，置25℃條件下保濕培養(yǎng)8 h，統(tǒng)計(jì)10個(gè)視野中總孢子數(shù)和萌發(fā)孢子數(shù)，計(jì)算孢子萌發(fā)抑制率。3次重復(fù)，以等量無菌水與孢子懸浮液混合為對(duì)照。

孢子萌發(fā)抑制率（%）=（對(duì)照孢子萌發(fā)率-處理孢子萌發(fā)率）/對(duì)照孢子萌發(fā)率×100。

1.2.5 BEB99菌株發(fā)酵產(chǎn)物揮發(fā)油化學(xué)成分測(cè)定

揮發(fā)油化學(xué)成分通過美國安捷倫公司GC/MS聯(lián)用儀（HP6890/HP5975C）進(jìn)行測(cè)定。色譜柱為AB-INowax（30.0 m×250 μm×0.25 μm）彈性石英毛細(xì)管柱，柱溫50℃（保留2 min），以5℃/min升溫至230℃，保持20 min；汽化室溫度250℃；載氣為高純He（99.999%）；柱前壓5.08 psi，載氣流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量1 μL（乙醚溶液）；分流比20∶1。質(zhì)譜條件：離子源為EI源，離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；電子能量70 eV；發(fā)射電流34.6 μA；倍增器電壓1 022 V；接口溫度280℃；質(zhì)量范圍20～450 amu。

2 結(jié)果與分析

2.1 BEB99菌株發(fā)酵產(chǎn)物分離

本研究共收集內(nèi)生細(xì)菌BEB99發(fā)酵液80 L，減壓濃縮破碎后，分別用等體積的石油醚和乙酸乙酯有機(jī)溶劑萃取得石油醚相提取物0.1 g，乙酸乙酯相提取物9 g。

2.2 BEB99菌株發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性

以香蕉枯萎病病原菌尖孢鐮刀菌古巴專化型4號(hào)生理小種（FOC4）作為靶標(biāo)菌，采用濾紙片擴(kuò)散法對(duì)不同濃度梯度的提取物進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各濃度梯度的揮發(fā)油對(duì)靶標(biāo)菌表現(xiàn)出不同程度的抗菌活性。隨著稀釋梯度的增大，抑菌圈減小，稀釋1、10倍的石油醚和乙酸乙酯相提取物對(duì)香蕉枯萎病菌菌絲均有抑制作用，但稀釋20倍的石油醚相提取物對(duì)香蕉枯萎病菌菌絲還具有一定抑制作用，而該濃度的乙酸乙酯相提取物對(duì)香蕉枯萎病菌菌絲則無抑制作用，在稀釋達(dá)到30倍時(shí)均無抑制作用，見圖1。

2.3 BEB99菌株發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)FOC4菌絲生長的影響

挑取抑菌圈臨界處的菌絲在光學(xué)顯微鏡下觀察，并以多菌靈為陽性對(duì)照和生長良好的香蕉枯萎病菌菌絲為陰性對(duì)照，可見受抑制的菌絲變形扭曲，新分支處菌絲生長受抑制，隔膜處縊縮，原生質(zhì)凝聚，而生長正常的菌絲生長茂盛，菌絲伸展良好，形態(tài)均勻，直長，光滑（如圖2）。

2.4 BEB99菌株發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)FOC4菌株孢子萌發(fā)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，菌株BEB99提取物對(duì)香蕉枯萎病菌分生孢子也具有明顯的抑制作用，并且隨著抗菌物質(zhì)濃度的提高而增強(qiáng)。分生孢子經(jīng)濃度為1.67 mg/mL的石油醚、乙酸乙酯相提取物處理8 h后，孢子萌發(fā)抑制率分別為92.99 %和82.96%。當(dāng)抗菌物質(zhì)濃度達(dá)到5.01 mg/mL以上時(shí)，孢子萌發(fā)抑制率均高達(dá)100%（表1）。

2.5 BEB99菌株發(fā)酵產(chǎn)物揮發(fā)油的化學(xué)成分

應(yīng)用GC-MS技術(shù)，對(duì)菌株BEB99的揮發(fā)油進(jìn)行成分分析，并通過歸一化法確定各成分的相對(duì)百分含量（表2）。共得到19個(gè)色譜峰（圖3），鑒定出18個(gè)成分，還有一個(gè)未知化學(xué)成分，占總油量的97.958%。菌株BEB99揮發(fā)油中的組分復(fù)雜多樣，以酯類、酸類化合物為主，其中酯類6種，酸類9種，醛類2種。相對(duì)含量超過10%的有油酸（14.98%）、油酸乙酯（11.38%）、亞麻油酸乙酯（14.86%）、亞油酸（13.20%）、棕櫚酸（11.36%）和棕櫚酸乙酯（11.26%）。

3 討論與結(jié)論

目前，有關(guān)植物內(nèi)生細(xì)菌的揮發(fā)油成分及其抑菌活性研究報(bào)道較少。本研究運(yùn)用 GC- MS 聯(lián)用技術(shù)分析并鑒定出18個(gè)成分，其中以油酸、油酸乙酯、亞麻油酸乙酯、亞油酸、棕櫚酸和棕櫚酸乙酯為主，還有一個(gè)未鑒定出的化學(xué)成分，揮發(fā)油粗提物對(duì)香蕉枯萎病菌具有很好的抑菌活性。

據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，檸檬酸、棕櫚酸、油酸、硬脂酸及亞油酸等有抑制細(xì)菌和真菌生長的作用。Walters等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，油酸、亞油酸和亞麻酸能抑制Rhizoctonia solani、Pythium ultimum、Pyrenophora avenae 和Crinipellis perniciosa等重要植物病原真菌的生長。Liu等[10]研究發(fā)現(xiàn)，棕櫚酸、油酸及亞油酸等有機(jī)酸不僅對(duì)植物病原菌Alternaria solani、Colletotrichum lagenarium、Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum 和Fusarium oxysporum f. sp. Lycopersici的菌絲有抑制作用，還對(duì)孢子萌發(fā)有抑制作用。馬妙蓮等[11]從小米中分離到一株戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus），其代謝產(chǎn)物對(duì)黃曲霉、革蘭氏陽性菌、陰性菌具有較強(qiáng)的抑制作用，分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液含有棕櫚酸、油酸、硬脂酸、亞油酸、乙酸、乳酸、琥珀酸和檸檬酸等多種抑菌成分。在抑菌機(jī)制方面，Tyler等[12]研究表明，Pseudozyma flocculosa菌產(chǎn)生的孢外脂肪酸可嵌入菌體中，通過破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和裂解細(xì)胞，抑制植物白粉病菌的生長。有關(guān)本研究的抑菌有效成分及抑菌機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1] 胡一鳳，井 濤，王夢(mèng)穎，等.抗FOC4香蕉內(nèi)生放線菌的篩選及菌株NJQG-3A1鑒定. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（1）：127-131.

[2] Mercado-Blanco J， Lugtenberg B J J. Biotechnological Applications of Bacterial Endophytes. Current Biotechnology， 2014（3）： 60-75.

[3] Thomas P， Swarna G K， Roy P K， et al. Identification of culturable and originally non-culturable endophytic bacteria isolated from shoot tip cultures of banana cv. Grand Naine[J]. Plant Cell Tiss Organ Cult， 2008， 93（1）： 55-63.

[4] Thomas P， Soly T A. Endophytic Bacteria Associated with Growing Shoot Tips of Banana （Musa sp.） cv. Grand Naine and the Affinity of Endophytes to the Host[J]. Microb Ecol， 2009， 58（4）： 952-964.

[5] Andrade L F， Nietsche S， Xavier A A， et al. Analysis of the Abilities of Endophytic Bacteria Associated with Banana Tree Roots to Promote Plant Growth[J]. Journal of Microbiology ， 2014， 52 （1）： 27-34.

[6] Jimtha J C， Smitha P V， Anisha C， et al. Isolation of endophytic bacteria from embryogenic suspension culture of banana and assessment of their plant growth promoting properties[J]. Plant Cell Tiss Organ Cult， 2014， 118（1）： 57–66.

[7] Ceballos I， Mosquera S， Angulo M， et al. Cultivable Bacteria Populations Associated with Leaves of Banana and Plantain Plants and Their Antagonistic Activity Against Mycosphaerella fijiensis[J]. Microb Ecol， 2012， 64（3）： 641-653.

[8] Weber O B， Muniz C R， Vitor A O， et al. Interaction of endophytic diazotrophic bacteria and Fusarium oxysporum f. sp. cubense on plantlets of banana ‘Maca[J]. Plant & Soil， 2007， 298（1-2）： 47-56.

[9] Walters D， Raynor L， Mitchell A， et al. Antifungal activities of four fatty acids against Plant Pathogenic fungi[J]. Mycopathologia， 2004， 157（1）： 87-90.

[10] Liu S， Ruan W， Li J， et al. Biological Control of Phytopathogenic Fungi by Fatty Acids[J]. Mycopathologia， 2008， 166（2）： 93-102.

[11] 馬妙蓮， 趙 靜， 陳曉琳， 等. 具有廣譜抑菌活性乳酸菌的篩選及抑菌物質(zhì)分析. 食品科學(xué)， 2012， 33（1）： 162-165.

[12] Avis Tyler J， Bélanger Richard R. Mechanisms and means of detection of biocontrol activity of Pseudozyma yeasts against plant-pathogenic fungi[J]. FEMS Yeast Research， 2002， 2（1）： 5-8.