通信作者：鄭作文，教授，主要從事中藥藥理研究。E-mail:zzw_nn@163.com

狗蟻草不同萃取部分含藥血清對HSC-T6細(xì)胞增殖的影響

吳霜曹思思鄭作文*

廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥理教研室，廣西南寧530001

【摘要】目的：探究狗蟻草不同萃取物對肝星狀細(xì)胞(HSC-T6)增殖的影響。方法：制備狗蟻草不同溶劑萃取物的含藥血清，通過MTT法檢測含藥血清對肝纖維化體外模型HSC-T6增殖的影響。結(jié)果：狗蟻草乙酸乙酯萃取物10%、5%、2.5%含藥血清、95%乙醇提取物10%含藥血清對HSC-T6細(xì)胞增殖有抑制作用。結(jié)論：狗蟻草乙酸乙酯萃取物和95%乙醇提取物能夠抑制HSC-T6細(xì)胞的增殖，其中狗蟻草乙酸乙酯萃取物活性優(yōu)于95%乙醇提取物。

【關(guān)鍵詞】狗蟻草；肝纖維化；肝星狀細(xì)胞

基金項目：廣西自然科學(xué)基金(NO:2013GXNSFAA019112)。

作者簡介：吳霜，碩士研究生在讀，主要從事中藥藥理研究。E-mail:512086863@qq.com

【中圖分類號】R285.5

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

【文章編號】1007-8517(2015)22-0023-02

Abstract:Objective To investigate the activity of different extracts of Alysicarpus Vaginalis (L.) DC in anti-hepatic fibrosis .Methods Prepareing medicated serum of different extracts of Alysicarpus Vaginalis(L.)DC. To study the influence of medicated serum on the growth of HSC-T6 cell that is a vitro model of hepatic fibrosis by the MTT method. Results Compared with blank control group, the 10%, 5%, 2.5% of medicated serum of ethyl acetate extract and the 10% of medicated serum of 95% alcohol extract of Alysicarpus Vaginalis(L.)DC significantly inhibite the growth of HSC-T6 cell. Conclusion The ethyl acetate extract and the 95% alcohol extract of Alysicarpus Vaginalis(L.)DC are active in anti-hepatic fibrosis, the effect of the ethyl acetate extract is better than the 95% alcohol extract.

Keywords:Alysicarpus Vaginalis(L.)DC; hepatic fibrosis; HSC-T6

收稿日期：(2015.08.07)

The Influnence of Medicated Serum of Different Extracts ofAlysicarpusVaginalis(L.) DC on the Growth of HSC-T6 Cell

WU ShuangCAO SisiZHENG Zuowen*

Department of Pharmacology of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530001,China

狗蟻草為豆科鏈莢豆屬植物狗蟻草Alysicarpusvagnalis(Linn.) DC.的全草，又名練莢豆、假花生、山土豆、大葉青等，主要分布于廣西、廣東、海南、云南等地[1]。狗蟻草性涼，味甘、苦，具有去腐生肌、活血通絡(luò)、清熱化濕的功效，臨床用于治療筋骨酸痛、慢性肝炎、跌打損傷等[2]。狗蟻草為廣西的道地藥材，民間用其來治療慢性肝炎，但迄今為止，狗蟻草抗肝纖維化作用的研究在國內(nèi)外未見有報道。實驗通過肝纖維化體外HSC-T6細(xì)胞模型來研究狗蟻草不同溶劑萃取物的抗肝纖維化活性。

1儀器與材料

1.1藥材狗蟻草由廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室韋松基教授鑒定為豆科植物鏈莢豆Alysicarpusvagnalis(Linn.) DC.的全草。

1.2實驗動物昆明種小鼠(清潔級)48只，雌雄各半，體重(20±2)g，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號：桂醫(yī)動字第11004號。

1.3細(xì)胞株HSC-T6細(xì)胞購買于上海博蘊有限公司。

1.4材料石油醚(分析純，批號：20130820，成都市科龍化工試劑廠)；氯仿(分析純，批號：20130518，成都市科龍化工試劑廠)；正丁醇(分析純，批號：20130409，成都市科龍化工試劑廠)；乙酸乙酯(分析純，批號：201305040，成都市科龍化工試劑廠)；DMSO(批號：020120709370，Amresco)；青鏈霉素混合液(批號：1491907，Gibco)；胎牛血清(批號：121005，浙江天杭生物科技有限公司)；MTT(批號：410c051，Solarbio)；秋水仙堿(批號：C8190，北京索萊寶科技有限公司)。

1.5儀器Epoch酶標(biāo)儀(美國BIO-TEK公司)；311型CO2培養(yǎng)箱(美國ThermoForma公司)；TB-215型丹佛精密天平(德國賽多利斯公司)；HVE-50型自動高壓滅菌器(日本HIRAYAMA公司)；DLE560型超凈工作臺(荷蘭Clean Air公司)；明澈-D 24 UV超純水儀(法國默克密理博公司)；G3型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國Heidolph公司)。

2實驗方法

2.1含藥血清的制備取狗蟻草干燥藥材，剪碎，稱重，置于開口反應(yīng)器中加適量95%乙醇浸泡過夜，次日加入藥材12倍量的95%乙醇，回流提取3次。依次保持微沸狀態(tài)2、1.5、1h，過濾，合并3次濾液，減壓濃縮，干燥，得95%乙醇部位提取物。將95%乙醇提取后的藥材曬干，加入12倍量純水，按上述95%乙醇的提取步驟進(jìn)行提取，得到水提物。取適量95%乙醇提取物，加水溶解，依次用用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，減壓濃縮提取液，干燥，得狗蟻草石油醚萃取物、氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物。取昆明種小鼠48只，雌雄各半，隨機(jī)分為空白對照組、秋水仙堿組、95%乙醇提取物組、石油醚萃取物組、氯仿萃取物組、乙酸乙酯萃取物組、正丁醇萃取物組、水提取物組，每組雌雄各3只。陽性對照組給秋水仙堿0.8mg/kg，空白對照組給純水，其余各組給予相應(yīng)藥物，灌胃給藥，給藥劑量均相當(dāng)于生藥量112 g/kg，灌胃容積均為20ml/kg，連續(xù)5d，每天2次。最后一次給藥(灌胃前禁食不禁水12h)1h后，摘眼球取血，3000rpm離心10min，取上清，于56℃下溫育30 min滅活，過濾除菌。每組藥物含藥血清設(shè)10%、5%、2.5%三個濃度，5%和2.5%含藥血清組再分別加入5%和7.5%空白對照小鼠血清，使各組培養(yǎng)液總血清含量均為10%[3]。

2.2對HSC-T6細(xì)胞增殖的影響取處于對數(shù)生長期的HSC-T6細(xì)胞，消化制成單細(xì)胞混懸液，取適量混懸液，用0.4%Trypan Blue染色，在顯微鏡下計數(shù)，活細(xì)胞百分?jǐn)?shù)應(yīng)大于90%。調(diào)整細(xì)胞濃度至5×103個/ml，取細(xì)胞懸液接種于96孔板中，100μl/孔，37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后吸出96孔板中的原培養(yǎng)液，加入相應(yīng)含藥血清培養(yǎng)液200μl，每組藥物的含藥血清分別設(shè)4個復(fù)孔，37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后每孔加入MTT溶液(5mg/ml)15μl，37℃培養(yǎng)4h，吸去上清液，每孔加DMSO 150μl，室溫下用微量振蕩器震蕩10min，酶標(biāo)儀雙波長法測吸光度A570/630(檢測波長570nm，參照波長630nm)，根據(jù)抑制率=(對照組A570/630 - 給藥組孔A570/630)/對照組A570×100%計算抑制率。

3結(jié)果

由表1可知，狗蟻草不同萃取物含藥血清作用于HSC-T6細(xì)胞24h后，其乙酸乙酯萃取物含藥血清在10%、5%、2.5%三個濃度下，HSC-T6細(xì)胞增殖明顯低于空白對照組(P<0.05)；狗蟻草95%乙醇提取物含藥血清在10%濃度下，HSC-T6細(xì)胞增殖明顯低于空白對照組(P<0.05)；HSC-T6細(xì)胞在狗蟻草石油醚、氯仿、正丁醇、水提取物含藥血清培養(yǎng)液中的增殖與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1　狗蟻草不同提取物含藥血清對HSC-T6細(xì)胞增殖的影響 ± s， n=4)

注：與空白對照組比較，*P<0.05。

4討論

肝纖維化是指由各種致病因素引起的肝內(nèi)彌漫性細(xì)胞外基質(zhì)過度沉淀，是細(xì)胞外基質(zhì)的合成持續(xù)大于細(xì)胞外基質(zhì)降解的結(jié)果，是各種慢性肝臟疾病發(fā)展的必經(jīng)階段[4]。肝纖維化的發(fā)生涉及肝星狀細(xì)胞(HSC-T6)、肝細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞、竇內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞以及多種細(xì)胞因子和酶，其中肝星狀細(xì)胞的激活是肝纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[5]。當(dāng)肝臟細(xì)胞受到損傷時，機(jī)體就會分泌血小板源性生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子β、肝細(xì)胞生長因子等激活靜息狀態(tài)的肝星狀細(xì)胞，激活的肝星狀細(xì)胞大量增殖，并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞合成大量的細(xì)胞外基質(zhì)[6]，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)合成增加降解減少。鑒于肝星狀細(xì)胞在肝纖維化發(fā)展中的重要作用，研究以肝星狀細(xì)胞為靶細(xì)胞，建立肝纖維化體外模型用于抗肝纖維化藥物的篩選有重要意義[7]。中藥化學(xué)成分復(fù)雜，如果直接加入到細(xì)胞培養(yǎng)體系中，化學(xué)成分的理化性質(zhì)可能干擾實驗結(jié)果導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生。另外，中藥的化學(xué)成分未必是發(fā)揮療效的成分，有些藥物需經(jīng)過機(jī)體代謝后才產(chǎn)生具有療效的物質(zhì)。所以直接將中藥或成分復(fù)雜的提取物加入到培養(yǎng)體系中研究其藥效是不大合適的，而含藥血清藥理學(xué)方法是將藥物作用于動物后，取動物血清作為藥物加入到培養(yǎng)體系中，可以很好避免上述弊端[8-9]。MTT法可以檢測細(xì)胞活力和數(shù)目，靈敏度高，重復(fù)性好，簡單易操作，快速、經(jīng)濟(jì)而且無放射污染，廣泛用于細(xì)胞增殖實驗[10]。故實驗采用MTT法檢測狗蟻草不同溶劑萃取物的含藥血清對HSC-T6細(xì)胞增殖的作用，結(jié)果顯示，狗蟻草乙酸乙酯提取物10%、5%、2.5%含藥血清、95%乙醇提取物10%含藥血清對HSC-T6的增殖有抑制作用，表明狗蟻草乙酸乙酯提取物和95%乙醇提取物可能具有抗肝纖維化活性，且狗蟻草乙酸乙酯提取物抗肝纖維化活性可能優(yōu)于95%乙醇提取物。

參考文獻(xiàn)

[1] 李蘭興，彭家崇，異葉鏈莢豆引種觀察及利用研究[J].中國草原與牧草，1985，2(1)：40-42.

[2] 國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會. 中華本草[M ].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999：326.

[3] 王勤，王巍，龍穎，等.羅漢果甜苷對肝星狀細(xì)胞 HSC-T6增殖及肝纖維化相關(guān)基因的影響[J].中草藥，2013，44(3)：331.

[4] 張斌.肝纖維化的發(fā)病機(jī)理研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代診斷與治療，2004，15(6)：354.

[5] 葉國榮.肝星狀細(xì)胞在肝纖維化中的作用[J].現(xiàn)代消化及介入診療，2007，12(10)：90.

[6] 張哲，郭津生.肝星狀細(xì)胞的起源與功能[J].中華臨床醫(yī)師雜志，2010，4(4)：459-462.

[7] 劉嘩，齊荔紅，王碩豐，等.肝星狀細(xì)胞HSC-T6體外肝纖維化模型的建立[J].藥學(xué)實踐雜志，2005，23(6)：339-342.

[8] 崔曉蘭，賀玉琢，高英杰，等.中藥藥理研究的新思路-中藥學(xué)清藥理學(xué)[J].中國中醫(yī)藥科技，1997，4(4)：239.

[9] 田代真一.血清藥理學(xué)和血清藥化學(xué)[J].現(xiàn)代東洋醫(yī)學(xué)，1992，13 (1)：113-117.

[10] Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival[J].Immuno Methods, 1983,65(1)：55-63.